白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是养殖对虾主要的病害之一，其传播范围广、致病力强，虾群感染3~7 d的死亡率高达90%~100%，给水产养殖业造成了巨大的经济损失(黄倢等, 1995; Lo et al, 1996; 马晓燕等, 2012; 何建国等, 1999)。研究表明，囊膜蛋白是介导病毒与宿主细胞发生相互作用的重要因子，在病毒侵染早期起关键作用，VP26、VP28和VP37是WSSV的主要囊膜蛋白，VP26存在于囊膜蛋白和核衣壳蛋白之间起联结作用(于力等, 2008)；VP28与病毒抗原性有关，在病毒入侵宿主细胞过程中起重要作用(van Hulten et al, 2000、2001)；VP37是粘附蛋白，可延缓WSSV的侵染过程(Liang et al, 2005; Liu et al, 2009)。

Ras基因是在生物进化过程中第一个被鉴定出来的非常保守的原癌基因，广泛存在于从酵母菌到人类的真核细胞中，因首先发现于大鼠肉瘤病毒(Rat sarcoma, Ras)而得名(Liu et al, 1995; Winston et al, 1996; Fan et al, 1997)。其分泌的RAS蛋白是偶联细胞表面受体与胞内效应因子的信号转导子，位于细胞膜内侧，属于小G蛋白家族，能结合GTP和GDP。结合GTP时为活性状态，能够与下游多种效应因子相互作用进行信号传递；当结合GDP时处于非活性状态，不能传递信号。所以，RAS蛋白在多种细胞跨膜受体介导的信号通路中起着分子开关的作用，在细胞增殖、分化、调亡、癌变等方面也起着非常重要的作用(Wennerberg et al, 2005; Winston et al, 1996; van der Weyden et al, 2007; Castro et al, 2005; Greenhough et al, 2007)。目前，关于对虾小G蛋白家族的研究多集中在Rab蛋白上，Praween等(2017)研究表明，在对虾感染传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)和WSSV时，Rab5、Rab6、Rab7三种蛋白的表达量均上调，说明三者参与了对虾的先天性免疫防御系统。

本研究通过克隆表达获得凡纳滨对虾的RAS蛋白，利用Far-western技术在体外筛选出能与RAS蛋白相互作用的WSSV结构蛋白，并通过ELISA验证二者在数量上的相互作用关系，为深入全面地探索WSSV感染机制和防治措施奠定基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

WSSV结构蛋白VP26、VP28N和VP37，表达载体pBAD/gⅢA由本实验室保存；TRIzol试剂、PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、Ex Taq酶及DNA标准(DNA Marker DL2000)购自TaKaRa公司；E.coli Top10感受态细胞购自TIANGEN公司；氨苄青霉素(Amp⁺)、L-阿拉伯糖、质粒小提试剂盒购自Solarbio公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶NcoⅠ、XbaⅠ及蛋白Marker购自Thermo公司；地高辛(DIG)购自Roche公司；胶回收试剂盒购自ZYMO公司。

1.2 实验方法 1.2.1 凡纳滨对虾cDNA的合成

剪取凡纳滨对虾的鳃丝，加入适量RNAiso充分研磨后，按照RNAiso试剂盒说明书提取RNA。依照PrimeScript RT Reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。

1.2.2 凡纳滨对虾Ras编码区基因的克隆

按照GenBank上的凡纳滨对虾Ras mRNA序列，设计特异性引物(Rass：5'-TACCATGGAGATGACGGAATA-CACG-3'；Rasa：5'-ACTCTAGATCGAACACAATGC-ACTT-3'，划线处为NcoⅠ和XbaⅠ酶切位点)，以凡纳滨对虾鳃的cDNA为模板，PCR扩增Ras基因序列。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，回收纯化。

1.2.3 重组表达载体pBAD/gⅢA-Ras的构建

PCR产物和pBAD/gⅢA载体经NcoⅠ和XbaⅠ双酶切，T4 DNA连接酶连接，构建重组表达载体，转化到E.coli Top10感受态细胞中，取100 μl转化液涂布到LB固体培养基(Amp⁺，50 μg/ml)上，37℃倒置培养。挑取单克隆，进行菌液PCR筛选阳性克隆，测序验证。

1.2.4 RAS生物学分析

利用在线软件ProtParam tool分析蛋白的等电点和分子量，应用SignalP 3.0 Server预测氨基酸序列有无信号肽，利用NPS Network Protein Sequence Analysis在线软件，采用PHD方法预测RAS蛋白二级结构(王修芳等, 2016)。

1.2.5 RAS蛋白的表达

测序正确的菌液用新鲜的LB培养液(Amp⁺，100 μg/ml)培养至OD_{600 nm}为0.5~0.6，加入诱导剂L-阿拉伯糖(终浓度为0.2 g/L)，37℃诱导4 h，对照组不加诱导剂。10000 r/min离心5 min，收集菌体，PBS缓冲液(pH=7.4)重悬，用超声破碎仪超声破碎后，10000 r/min离心30 min，分别收集诱导、未诱导菌液的上清液和沉淀，SDS-PAGE分析RAS蛋白表达情况，并将蛋白条带切下，送上海复旦大学进行蛋白质谱分析。

1.2.6 Co²⁺柱亲和层析纯化RAS蛋白

诱导表达的菌液沉淀用A液(含6 mol/L盐酸胍，pH=7.4)溶解后，4℃ 10000 r/min离心10 min，收集上清液，依次经0.8 μm和0.45 μm滤膜过滤。向层析柱中加入树脂，PBS缓冲液(pH=7.4)平衡洗柱，A液将紫外吸收峰洗至0，加入蛋白上清液混匀，冰浴2 h，A液洗脱至峰值为0，C液(含150 mmol/L咪唑，pH=7.4)洗脱，并收集RAS蛋白。RAS蛋白经尿素梯度复性液(4、2、1、0 mol/L)透析复性后浓缩，SDS-PAGE检测蛋白纯化效果。

1.2.7 DIG标记RAS蛋白

将DIG粉末溶于DMSO(1: 1000)中，与RAS蛋白充分混匀，4℃ PBS缓冲液(pH=7.4)过夜透析，以去除过量的DIG。

1.2.8 Far-western检测与RAS蛋白互作的WSSV蛋白

将WSSV的3种结构蛋白VP26、VP28N、VP37和BSA(阴性对照)进行15% SDS-PAGE后，转印至PVDF膜上，4℃ 5% BSA封闭过夜，PBS-T清洗后加入DIG-RAS蛋白，室温避光孵育2 h，PBS-T清洗5遍后，加入碱性磷酸酶(AP)标记的抗DIG抗体(Anti-DIG-AP，1: 3000)，室温避光孵育2 h，PBS-T清洗5遍后，用BCIP/NBT显色液避光显色。

1.2.9 ELISA检测RAS蛋白与VP26的相互作用

VP26用Na₂CO₃包被液稀释至0.02 μg/μl，分别取50 μl稀释好的VP26加入96孔板中，BSA为阴性对照，4℃包被过夜。PBS-T清洗后，5% BSA常温封闭2 h，PBS-T洗板3次。加入50 μl不同量的DIG-RAS蛋白(0.1、1.0、2.5 μg)，常温孵育2 h，PBS-T洗板5次。加入50 μl Anti-DIG-AP(1: 5000稀释)，常温孵育2 h，PBS-T洗板5次，加入50 μl PNPP显色液，直到出现明显颜色时，加入50 μl NaOH (0.3 mol/L)中止反应。酶标仪测定405 nm处的吸光值并计算P/N值。P/N计算公式：P/N=(OD_{405 nm}-OD_{405 nm空白})/(OD_{405 nm BSA}-OD_{405 nm空白})。

2 实验结果 2.1 Ras基因的克隆

以凡纳滨对虾鳃的cDNA为模板，利用设计的引物扩增Ras基因，琼脂糖凝胶电泳结果见图 1，扩增的片段在500~750 bp之间，与Ras基因片段(561 bp)大小相符。

2.2 重组表达载体pBAD/gⅢA-Ras的鉴定

T4 DNA连接酶将双酶切后的目的片段与具有相同粘性末端的pBAD/gⅢA表达载体连接，转化到E. coli Top10细胞中，经菌液PCR鉴定阳性克隆，PCR产物电泳结果见图 2，条带大小为500~750 bp，菌液测序结果经过DNAMAN软件分析，重组表达载体序列完全正确，无碱基错配和移码突变。

2.3 RAS蛋白生物学信息

经ProtParam tool分析显示，RAS理论分子量为21.3 kDa，等电点为5.97；SignalP 3.0 Server分析显示，该蛋白无信号肽结构，NPS Network Protein Sequence Analysis预测RAS蛋白二级结构(图 3)，α螺旋为40.64%，β转角为36.9%，延伸链占22.46%。

2.4 RAS蛋白的检测

分别取诱导、未诱导菌液的上清液和沉淀进行SDS-PAGE(图 4)，与未诱导的上清液、诱导的上清液、未诱导的沉淀相比，诱导菌液的沉淀在25 kDa左右出现一条明显加粗的蛋白条带(图 4中的红色箭头所示)，将此条带进行蛋白质谱分析(表 1)，结果显示，该蛋白为凡纳滨对虾的RAS蛋白。

2.5 RAS蛋白的纯化

重组RAS蛋白带有6×His标签，可利用Co²⁺亲和层析法纯化。SDS-PAGE显示(图 5)，RAS蛋白纯度高，为单一条带，可用于下一步实验。

2.6 RAS蛋白与WSSV结构蛋白的相互作用

将VP26、VP28N和VP37进行蛋白电泳后转印至PVDF膜上，依次经过DIG-RAS蛋白和Anti-DIG-AP孵育。显色结果显示，在VP26泳道出现明显的条带(图 6中的红色箭头所示)，而VP28N、VP37和BSA泳道无条带，说明RAS蛋白只能与VP26特异性结合。

2.7 ELISA分析

采用ELISA方法，进一步验证VP26与RAS互作，数据分析显示P/N值远大于2(图 7)，且VP26与RAS蛋白的相互作用随RAS蛋白量的增加而增强，当RAS蛋白量增加至2.5 μg时，P/N值增加到16.4，说明VP26与RAS蛋白有明显的结合作用。

3 讨论

大量研究表明，病原蛋白与宿主蛋白相互作用是诱发感染、致病的关键环节。WSSV侵染宿主细胞是一个很复杂的过程，病毒在复制过程中会与多种宿主细胞蛋白发生作用。近年来，已报道多种宿主分子(包括Rab5、Rab6、Rab7等小G蛋白)参与WSSV的侵染过程(Sritunyalucksana et al, 2006、2013)，但关于RAS蛋白与WSSV的相互作用尚不明确。

本研究根据Ras编码区序列设计引物，PCR获得Ras序列，通过原核表达和Co²⁺亲和层析法得到RAS蛋白，SDS-PAGE结果显示，RAS蛋白存在于诱导沉淀中，属于包涵体蛋白。以WSSV的3个主要结构蛋白VP26、VP28N和VP37作为研究对象，通过Far-western和ELISA检测三者是否与凡纳滨对虾RAS蛋白相互作用。研究表明，RAS蛋白虽不能与VP28N和VP37相互作用，但能与VP26特异性结合，且二者的相互作用随着RAS蛋白量的增加而增强。VP26是WSSV中含量较高的被膜蛋白，起连接作用(Tsai et al, 2006)，既可以与囊膜蛋白VP28结合，又可以与核衣壳蛋白VP51结合，三者可能通过形成复合体起到稳定病毒结构的作用(Chang et al, 2008; Wan et al, 2008)。VP26能特异性结合斑节对虾(Penaeus monodon)血细胞，参与WSSV侵染的初始阶段(刘非等, 2006)，中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的Tetraspanin-3蛋白在体外也能特异地结合VP26，参与WSSV的感染过程(关广阔等, 2015)，VP26通过与日本囊对虾(Penaeus japonicus)β肌动蛋白作用，完成WSSV的入侵、运输和释放等过程(Liu et al, 2011; Xie et al, 2005; Gouin et al, 2005)，说明VP26可与多个宿主分子相互作用。

RAS是细胞内信号通路中的转导因子，在信号传导途径中起着极为重要的作用，RAS与VP28和VP37无作用，说明RAS不参与WSSV吸附宿主细胞的过程。根据研究结果可初步推测，在WSSV侵染凡纳滨对虾细胞时，RAS蛋白通过与VP26相互作用，调控信号通路介导WSSV进入细胞内，从而加快了WSSV在宿主体内的传播，具体作用机制尚需深入研究。本研究结果为进一步揭示WSSV侵染宿主细胞的信号通路和病毒-宿主相互作用机制提供了理论基础。