扇贝隶属珍珠贝目(Pterioida)，广泛分布于世界各个海域(刘天红等, 2013)。我国现在扇贝年产量1400万t，占海水养殖动物总产量的22%。扇贝裙边是扇贝加工后的下脚料（包括扇贝边、性腺和肠腺等），由于受现有加工技术水平的限制，尚未得到大规模高值化利用，是亟待深度开发利用的重要海洋生物资源(魏玉西等, 2009)。扇贝裙边蛋白质含量高，对扇贝裙边进行酶解转变为复合氨基酸，可以提高其生物利用率及营养价值。目前，已有学者将扇贝裙边用于加工生产海鲜酱油、贝裙脆片和扇贝酱(严超等, 2016)等。关于蛋白质降解制备复合氨基酸的方法一般采用HCl水解法，但该法破坏某些氨基酸(如色氨酸)，且HCl挥发性强，对设备的要求较高并容易污染环境(熊竹, 2016)。因此，利用蛋白酶酶解法制备复合氨基酸，被认为是一种更好的加工方式(桑亚新等, 2012；宋惠平等, 2015)。

Ca是人体必需的营养素，占人体体重的1.5%~2.2%，其中大部分(约99%)以Ca₃(PO4)₂的形式存在于骨中。中国人的饮食结构以植物性食物为主，不足以满足人体对Ca的需求，需要额外补充Ca (赵妍嫣等, 2011)，而且对骨骼正常生长和体内生理调节来说，Ca是一种非常重要矿物元素，即使膳食Ca摄入量足够，但是由于Ca²⁺在肠道碱性环境内容易形成沉淀(Vavrusova et al, 2014)，从而无法被小肠吸收，因此，生物利用率较低(Bao et al, 2008)，且对胃有刺激作用(Straub, 2007)。

研究发现，蛋白质酶解得到的氨基酸具有较强的Ca²⁺结合活性，如鸡蛋壳粉氨基酸螯合钙(杜冰等, 2011)、罗非鱼骨粉氨基酸螯合钙(胡振珠等, 2010)、米渣蛋白氨基酸螯合钙(郭艳, 2006)以及文蛤氨基酸螯合钙(郑清等, 2009)等。这类补钙剂可以促进钙离子的生物利用度，因而Ca吸收率较高(丁媛媛等, 2017)。本研究旨在采用复合蛋白酶酶解法，将扇贝裙边蛋白质酶解成为游离氨基酸，探索最佳酶解条件，并进一步将酶解得到的氨基酸与无机钙离子进行螯合制备复合氨基酸螯合钙，以提高扇贝裙边利用附加值，为扇贝裙边作为功能性食品提供基础资料。

实验用的扇贝裙边：栉孔扇贝，购自山东省青岛市沙子口；食品级酶制剂：中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、动物蛋白酶，购自广西南宁庞博生物工程有限公司；酸性蛋白酶，购自北京索莱宝生物科技公司。分析纯级试剂：石油醚，NaOH，EDTA-Na₂自制复合酶制作过程：将中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、动物蛋白酶和酸性蛋白酶按等质量均匀混合后，放于4℃冰箱直至使用。

索氏脂肪抽提器；PHS-3C pH计，上海雷磁仪器厂；GL-20G-Ⅱ冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；SYKAM全自动氨基酸分析仪S-433D，SYKAM公司，德国；K9840全自动凯氏定氮仪，济南海能科技有限公司。

将扇贝壳刷洗干净，先以0.05 mol/L HCl浸泡2 h，以自来水充净后粉碎至60~80目，水飞法除去密度大的部分后烘干得钙源贝壳粉。取适量钙源贝壳粉，先加适量HCl使贝壳粉完全溶解，再继续加钙源贝壳粉至加入的贝壳粉不再溶解为止。过滤，将滤液经浓缩、酒精沉淀、烘干即得贝壳源氯化钙(魏玉西等, 2013)。

甲醛滴定法(杨佩荣, 2003)；总氮(粗蛋白)的测定：凯氏定氮法(杨佩荣, 2003)；pH测定：pH酸度计；钙离子的测定：EDTA滴定法(金其荣等, 1989)；粗脂肪的测定：索氏抽提法(GB 5009.6-2016)。氨基酸分析方法：茚三酮法(GB 5009.124-2016)。

新鲜的扇贝裙边去杂后加入2倍体积蒸馏水煮沸5 min，沥干并于96℃干燥6 h，粉碎，过100目筛，即得均匀扇贝裙边粉末。

参考罗舜菁等(2017)、郑建明等(2017)方法并加适当改进。取3份、每份10 g扇贝裙边粉，各加入100 ml无水乙醇，60℃恒温水浴摇床6 min，抽滤，重复2次，过滤、晾干即得脱脂后的扇贝裙边粉末。脂含量测定结果取平均值。

酶解工艺参魏玉西等(2009)并加适当改进。将脱脂后的扇贝裙边粉末加入20倍体积的蒸馏水，加入自制复合酶进行正交酶解实验。酶解完毕以后，立即升温至100℃灭酶5 min，冷却至室温以后，3500 r/min离心30 min，上清液即为酶解液。测定酶解液中氨基酸态氮含量并计算氨基酸转化率(杨佩荣, 2003)。

首先对螯合钙的钙源的选择进行了优化，最后确定以贝壳粉制备的CaCl₂为最优钙源，然后对螯合过程的时间、pH及温度因素进行了单因素和正交实验的优化，用EDTA滴定法测螯合率最终，确定了最优的螯合工艺。

分别取扇贝裙边粉末、酶解液和复合氨基酸螯合钙样品，采用SYKAM全自动氨基酸分析仪S-433D进行氨基酸组成分析(付萍等, 2016)。

扇贝裙边脱脂结果见表 1。经脱脂处理以后，扇贝裙边粉末脂肪含量明显降低，有利于下一步酶解，并且腥臭味消失，呈现出扇贝固有的鲜甜味。

表 1(Tab.1)

表 1 脱脂次数与样品脂肪含量 Tab.1 Degreasing times and sample fat content (%) 材料Raw material 未脱脂裙边粉 Non-degreasing scallop skirt powder 1次脱脂裙边粉 One time of degreasing scallop skirt powder 2次脱脂裙边粉 Two times of degreasing scallop skirt powder 脂肪含量Fat content 16.60 2.10 0.55

表 1 脱脂次数与样品脂肪含量 Tab.1 Degreasing times and sample fat content (%)

正交实验选取时间、加酶量、温度和pH 4个因素(刘淇等, 2013)，通过预实验确定正交实验的因素和水平，进而进行正交实验。自制蛋白酶正交设计因素与水平排列见表 2，正交实验结果见表 3。总体来说，酶解pH的影响最主要，其次是酶解温度，而酶解时间和加酶量影响较小，实验结果与魏玉西等(2009)的研究结果相吻合。根据正交实验的结果，最后确定最佳酶解条件为：添加扇贝裙边粉末量0.15%(w/w)自制复合蛋白酶，介质pH=8，温度65℃，酶解7 h后在100℃水浴加热10 min灭酶，即得到复合氨基酸酶解液，氨基酸转化率达77%。

表 2(Tab.2)

表 2 蛋白酶正交设计因素与水平排列 Tab.2 Protease orthogonal experimental design 水平 Levels 因素Factors A酶解时间 Enzymolysis time (h) B酶解温度 Enzymolysis temperature(℃) C酸碱度 pH D加酶量 Enzyme dosage(%) 1 5 55 6 0.05 2 6 60 7 0.10 3 7 65 8 0.15

表 2 蛋白酶正交设计因素与水平排列 Tab.2 Protease orthogonal experimental design

表 3(Tab.3)

表 3 蛋白酶正交实验方案及结果分析 Tab.3 Orthogonal experiment design and results 实验号No. 酶解条件Conditions of enzyme hydrolysis 氨基酸转化率Amino acid conversion rate (%) A B C D 第1次First time 第2次Second time 第3次Third time 1 2 3 4 1 1 1 1 1 72.55 72.50 72.55 2 2 2 1 2 75.25 75.20 75.25 3 3 3 1 3 76.65 76.65 76.60 4 2 1 2 3 75.25 75.25 75.30 5 3 2 2 1 77.05 77.05 77.10 6 1 3 2 2 76.50 76.50 76.55 7 3 1 3 2 76.55 76.50 76.60 8 1 2 3 3 76.55 75.55 76.50 9 2 3 3 1 75.75 75.75 75.70 均值1 K1 74.817 74.783 75.200 75.117 均值2 K2 76.267 76.283 75.417 76.100 均值3 K3 76.283 76.300 76.750 76.150 极差R 1.466 1.517 1.550 0.973

表 3 蛋白酶正交实验方案及结果分析 Tab.3 Orthogonal experiment design and results

不同钙源参与的鳌合反应螯合率见表 4。由表 4可见，5种不同钙源对螯合率的影响差别较大，其中CaCl₂参与螯合反应螯合率最高(达89%)。因此，本研究螯合反应选用CaCl₂为钙源。这与文献(甘林火等, 2008)所报道的结果一致。同时为增加贝可利用度，选用贝壳为原料制备CaCl₂。将扇贝壳刷洗干净，先以0.05 mol/L HCl浸泡2 h，以自来水充净后粉碎至60~80目，水飞法除去密度大的部分后，烘干得钙源贝壳粉。取适量钙源贝壳粉，先加适量HCl使贝壳粉完全溶解，再继续加钙源贝壳粉至加入的贝壳粉不再溶解为止。过滤，将滤液经浓缩、酒精沉淀、烘干即得贝壳源CaCl₂。经实验证明，经该方法制备的CaCl₂的鳌合率，与分析纯级CaCl₂效果相同。因此，以下鳌合实验均使用贝壳CaCl₂为钙源。

表 4(Tab.4)

表 4 钙离子与螯合率的关系 Tab.4 Relationship between calcium and chelation rate (%) 钙离子来源Source of calcium ion 螯合率Chelation rate Ca(OH)2 57 CaCl2 89 CaCO3 38 Ca(C6H11O7)2 65 C6H10CaO6 33

表 4 钙离子与螯合率的关系 Tab.4 Relationship between calcium and chelation rate (%)

鳌合反应单因素实验结果见图 1、图 2和图 3。可见，鳌合过程的最佳温度为40℃，最佳时间为40 min，超过40 min以后，鳌合率下降，最佳pH为9。

图 1(Fig. 1)

图 1 反应时间对螯合率的影响 Fig.1 The effect of time on the chelation rate

图 1(Fig. 1)

图 2 温度对螯合率的影响 Fig.2 The effect of temperature on the chelation rate

图 1(Fig. 1)

图 3 pH对螯合率的影响 Fig.3 The effect of pH on the chelation rate

螯合反应正交设计因素与水平排列见表 5，正交实验方案及结果见表 6。由表 6可见，反应时间和介质pH对螯合率的影响最主要，而温度影响最小。具体地说，最佳螯合反应条件：反应温度为40℃，反应时间为40 min，介质pH为9。在此最佳工艺条件下进行螯合反应，螯合率可达92%。

表 5(Tab.5)

表 5 螯合反应正交实验设计因素与水平排列 Tab.5 Factors and levels arrangement of chelation orthogonal experimental design 水平 Levels 因素Factors A酶解温度 Enzymolysis time (℃) B酶解时间 Enzymolysis temperature(h) C酸碱度 pH 1 30 20 8 2 40 30 9 3 50 40 10

表 5 螯合反应正交实验设计因素与水平排列 Tab.5 Factors and levels arrangement of chelation orthogonal experimental design

表 6(Tab.6)

表 6 螯合反应正交实验结果 Tab.6 Chelating reaction orthogonal experimental design and results 实验号 No. 酶解条件 Conditions of enzyme hydrolysis 实验结果 Result of orthogonal design (%) A B C 第1次 First time 第2次 Second time 第3次 Third time 1 2 3 1 1 1 1 77 76 77 2 2 2 1 85 84 84 3 3 3 1 83 84 83 4 2 1 2 84 83 82 5 3 2 2 90 90 89 6 1 3 2 85 86 85 7 3 1 3 79 79 78 8 1 2 3 80 82 81 9 2 3 3 88 87 86 均值1K1 81.667 80.000 80.667 均值2K2 86.333 85.000 85.667 均值3K3 82.333 85.333 84.000 极差R 4.666 5.333 5.000 R2 20800 20747 20732

表 6 螯合反应正交实验结果 Tab.6 Chelating reaction orthogonal experimental design and results

扇贝裙边粉末中含有丰富的氨基酸，且含有7种人体必需氨基酸(魏玉西等, 2009)。本研究就扇贝裙边粉末、扇贝裙边粉末酶解液以及复合氨基酸螯合钙进行了氨基酸组成及含量测定，结果见表 7。由表 7可见，在扇贝裙边粉末酶解液中，末中含有较多谷氨酸和天冬氨酸，因此酶解液有浓郁的鲜味。选用贝壳制备的CaCl₂为钙源，进一步提升了扇贝的利用度，降低了生产成本。由于酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)更容易与钙离子进行螯合(Liu et al, 2013)，在复合氨基酸螯合钙产品中，酸性氨基酸的含量相对于酶解液进一步提升，使天冬氨酸由10.89%上升到22.23%，谷氨酸由20.32%上升到33.87%，因而使得复合氨基酸螯合钙产品有较显著的鲜味；但对于碱性氨基酸，如精氨酸、赖氨酸和组氨酸来说，因它们不易与钙离子进行螯合，所以在复合氨基酸螯合钙产品中其含量均有所下降；对中性氨基酸来说，在复合氨基酸螯合钙产品中的含量均无较大改变。

表 7(Tab.7)

表 7 氨基酸组分及含量分析 Tab.7 Analysis of amino acid composition and content 氨基酸 Amino acids 氨基酸所占百分比 Percentage of amino acids 扇贝裙边 Scallop skirt 酶解液 Hydrolysate 螯合钙 Chelate calcium 天冬氨酸Asp 10.61 10.98 22.23 苏氨酸Thr 4.84 1.54 3.48 丝氨酸Ser 4.92 5.41 10.76 谷氨酸Glu 15.72 20.32 33.87 甘氨酸Gly 9.40 3.64 9.97 丙氨酸Ala 5.92 2.39 3.21 胱氨酸Cys 0.36 11.67 0.70 缬氨酸Val 4.92 0.39 2.37 甲硫氨酸Met 0.41 0.89 0.69 异亮氨酸Ile 4.81 0.57 1.53 亮氨酸Leu 7.84 0.58 1.60 酪氨酸Tyr 3.39 0.62 0.42 苯丙氨酸Phe 4.06 0.97 0.84 组氨酸His 3.22 7.17 4.32 赖氨酸Lys 6.75 15.48 3.83 精氨酸Arg 7.23 12.86 1.95 脯氨酸Pro 5.58 0.17 3.90 注：色氨酸未测 Note: Tryptophan is not detected

表 7 氨基酸组分及含量分析 Tab.7 Analysis of amino acid composition and content

本研究采用多种蛋白酶，对扇贝裙边进行复合蛋白酶酶解，采用正交实验设计进行优化酶解条件，使最终氨基酸转化率达到77%，较目前所报道的酶解条件(Choi et al, 2012)有更高的氨基酸转化率，且复合氨基酸中含有较多人体必需氨基酸。因为氨基酸的羧基存在钙离子结合能力(Bao et al, 2008)，在酶解之后将氨基酸酶解液与来源于贝壳的无机钙离子进行螯合，制备复合氨基酸螯合钙，通过优化螯合反应条件，最终使螯合率达到92%，该产品可以提高人体对钙离子的生物利用率(Hou et al, 2015; Jeon et al, 2010)。因此，本研究结果不仅高值化利用扇贝裙边，将其中氨基酸游离出来并转化为复合氨基酸螯合钙，而且利用贝壳将其中钙质作为复合氨基酸螯合钙的钙源，将扇贝加工废弃物变废为宝，生产出的复合氨基酸螯合钙不仅具有补钙功能，而且具有鲜美的味感，可以作为补钙剂或功能性调味品食用。这对提高扇贝加工下角料的附加值，同时也为我们高值化利用其他水产加工废弃物、减少环境污染，促进蓝色经济的可持续健康发展提供了新的思路和方法。