2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部海水养殖病害防治重点实验室 青岛市海水养殖流行病学与生物安保重点实验室 青岛 266071;
3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071
2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity, Qingdao 266071;
3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071
近年来，对虾病害给国内外对虾养殖业造成了巨大的损失，其特点表现为对虾发病期提前(Tran et al, 2013)，病原种类繁多(韩琳等, 2018)，虾病发生区域广(Lightner et al, 2012; Nunan et al, 2014; Soto-Rodriguez et al, 2015; 王博雅等, 2017; 陈禄芝等, 2016)，且患病对虾死亡率高(Han et al, 2015; Hernández-Palomares et al, 2018)。研究发现，目前中国对虾养殖中主要存在的病毒性病原有白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV) (Hernández-Palomares et al, 2018)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)(Yan et al, 2016; 李秋璇等, 2015)、传染性肌肉坏死病毒(Infectious myonecrosis virus，IMNV) (Kurcheti et al, 2017)及偷死野田村病毒(Covert mortality nodavirus, CMNV)(Zhang et al, 2017)，最新报道还存在对虾黄头病毒(Sinnuengnong et al, 2018; 朱罗罗等, 2016)、对虾虹彩病毒(Qiu et al, 2017)；细菌性疾病主要为急性肝胰腺坏死综合症(Hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)(Han et al，2015；孙明玉等, 2018)和微孢子虫病原虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)导致的虾肝肠胞虫病(Prasertsri et al, 2009)。
在对虾疾病防控方面，无论对虾种苗场还是养殖场都已采取了防控措施，减少对虾病原感染率、降低养殖水体中的病原数量，采用各种水质改良剂、微生态制剂改善水质，提高对虾抗病力(Warneke et al, 2011; 王春迪等, 2016)，对虾病害发生率依然没有显著下降(王筱珊等, 2017；陈禄芝等, 2016; 王博雅等, 2017; 施慧等, 2017)，且国内对虾养殖产量呈逐年下降趋势。
为查明当前对虾养殖中病害形成的原因，本研究选择山东潍坊沿海1个具备大棚养殖池、室外养殖池的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖场作为虾病调查研究的采样点，采取定期取样的方法，跟踪监测了对虾及水体中的主要病原的种类数量，水中氨氮及亚硝基氮浓度的变化及对虾病害发生情况，以期通过分析养殖场的对虾疾病感染过程、发病特点，找出患病死亡的原因，为对虾养殖的疾病防控提供理论依据与技术支持。
1 材料与方法 1.1 养殖场基本资料收集 1.1.1 养殖场基本情况对虾养殖场位于山东省潍坊市北部近海的内陆盐碱地区域，养殖用水为近海河口区水源。养殖场现有水面13.8 hm2，其中，养殖用室外池塘30个(小型池塘12个，每个面积为0.2 hm2；中型池塘18个，每个面积为0.3 hm2)；大棚养虾池4个(小型棚2个，每个0.1 hm2；大型棚2个，每个0.5 hm2)。另有大型池塘6个，每个面积为0.8 hm2，用于水处理。室外养殖池平均有效水深为1.6 m，大棚养殖池平均有效水深为1.4 m。从其中随机抽取池塘7个为跟踪取样虾池，池塘编号、面积、放苗时间及密度等信息见表 1。
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表 1 养殖池的基本情况 Tab.1 Basic information of the shrimp ponds |
养殖用水先经漂白粉(30 mg/L)处理，再曝气脱氯后使用，养殖期间，水体盐度为11±3.6，pH为7.8~8.5，大棚养殖池水温为26.2℃~ 32.5℃，室外养殖池水温为23℃~28.5℃。大棚养殖池配备底部增氧管(3 W/m2)及水车式增氧机(1.5 W/m2)，室外养殖池配备水车式增氧机(1.5 W/m2)。在养殖期间，室外养殖池水体中的DO > 5 mg/L，大棚养殖池水体DO > 4 mg/L。养殖投喂人工配合饵料，虾苗体长为3 cm以前，日投喂6次，日投饵量为对虾体重的5%；3 cm后，日投喂4次，日投饵量为对虾体重的3%。大棚养殖池日换水量为(20±5)%，外塘养殖池每10 d换水1次，每次20%。
1.1.3 数据采集自放苗开始，每20 d跟踪检测虾池及进水渠的水质指标(温度、盐度、pH、DO、氨氮、亚硝氮)的变化情况，采集水样、对虾样品进行细菌分离鉴定、病原检测，并观察记录对虾发病症状。
1.2 样品采集及处理 1.2.1 水样采集用无菌瓶于换水前，在每个采样池中取水样100 ml，低温带回实验室，用于氨氮及亚硝基氮分析。
1.2.2 细菌分离从养殖场水源和养殖池水体中分别取100 μl的水样，灭菌海水10倍梯度稀释，无菌状态下涂布2216E和TCBS固体培养基；无菌取对虾肠道及肝胰腺混合研磨后，用生理盐水10倍梯度稀释，分别涂布2216E和TCBS的固体培养基，于28℃恒温培养箱内培养24 h。
1.2.3 病原检测样品采集每个池塘每次取对虾30尾，鳃丝、步足、肌肉及肝胰腺样品合并为1个独立样品，放入95%的乙醇中保存带回实验室，用TIANGEN试剂盒(TIANamp Marine Animals DNA Kit)提取样品全基因组DNA，-80℃保存备用；用RNAiso Plus (TaKaRa)提取样品总RNA，-80℃保存备用。
1.3 可培养细菌分析及弧菌的占有率 1.3.1 可培养细菌的分离鉴定取接种培养后的2216E平板，根据细菌的形态、大小、颜色等进行分离纯化。用细菌16S rDNA序列扩增方法对所分离的细菌进行初步鉴定(Bikrol, et al, 2010)，扩增产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司分析，所得序列在NCBI数据库中进行同源性比对。
1.3.2 水体中可培养细菌数及总弧菌数评估根据某水样在一定稀释度下涂布2216E平板形成的菌落数，推算该原始水样每毫升中的总细菌数为单位水体中可培养细菌数；根据某水样在一定稀释度下涂布TCBS平板形成的菌落数，推算该原始水样总弧菌数量，单位为CFU/ml。
1.3.3 某种弧菌占有率根据TCBS平板所分离弧菌的菌落数、鉴定结果及样品稀释度，分别统计大棚养殖池和室外养殖池中各种弧菌(Vibrio sp.)的数量。弧菌占有率=单位水体中某种弧菌数量/单位水体中可培养细菌数×100%。
1.4 对虾多病原检测EHP及AHPND的检测方法分别参照Jaroenlak等(2016)和Dangtip等(2015)的方法；WSSV、IHHNV及IMNV的检测采用国际兽疫局(Office International des Epizooties, OIE 2016)推荐的检测方法，CMNV检测参照Zhang等(2014)的方法。其中，WSSV、IMNV及CMNV均为套式PCR，IHHNV采用常规PCR 2对物检测。
1.5 水质指标检测使用YSI556便携式水质测定仪(Xylem, 美国)，每个取样日的09:00测量养殖池水体温度、盐度、溶解氧和pH。水体中氨氮和亚硝基氮的浓度测定分别采用靛酚蓝分光光度法(GB17378.4-2007)和萘乙二胺分光光度法(GB17378.4-2007)。
1.6 数据分析实验结果用平均值±标准差(X±SD, n=3)表示，运用SPSS 18.0软件，经单因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan’s多重检验分析实验结果的差异显著性，设置差异水平α=0.05 (P < 0.05为差异显著)。
2 结果 2.1 对虾生长及病害发生情况观察各采样池塘中的对虾发病情况，记录发病时间，各虾池病症初次发生时间见表 2。该养殖场大棚虾池在发病前10 d已表现出摄食减少、生长缓慢的症状，之后陆续出现对虾不摄食、空肠空胃、肠道细、趴边，末期对虾腹部和尾节变白，1周后出现死亡，且死亡率升高，最后出池；G2对虾症状与死亡情况与G1完全相似，相应的症状出现的时间仅较G1池晚4 d左右；G3的对虾发病较为迅速，症状表现为对虾不摄食，空肠空胃，发病1周后，对虾死亡率近50%，消毒排塘。根据对虾的发病特点及检测结果，初步判定大棚养殖池中的对虾发病为弧菌与虾肝肠胞虫混合感染所致，且与水体中氨氮、亚硝氮浓度过高有关；室外养殖池整个养殖周期发病较轻，个别池塘在养殖后期出现一定的发病症状，表现为对虾趴边，空肠空胃，但数量较少，跟踪的4个室外养殖池中，仅W1在9月25日出现病症，死亡率极低，因为已到收获季节，采取了收虾处理。
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表 2 各池对虾发病情况 Tab.2 Occurrence of shrimp disease in different ponds |
整个检测期间，共分离单菌落305个，对所分离的细菌进行初步鉴定，共成功鉴定细菌258株，其中，养殖水体中164株，对虾体内94株。比对结果显示，养殖水体中164株菌中含有菌株49种，对虾体内有菌株31种，对虾体内和水体主要细菌组成见表 3。由表 3可知，养殖水体中菌群种类比对虾体内的种类多。
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表 3 对虾体内和养殖水体中的菌群组成 Tab.3 Component of predominant bacterial communities isolated from shrimp and water |
分别统计不同采样时间所有跟踪的大棚及室外养殖池中弧菌平均数量(图 1)。由图 1可知，经过漂白粉处理后，再经过脱氯曝气的水，进入养殖池后其内的弧菌数量在10 CFU/ml左右，随着养殖时间的增长，无论室外养殖池还是大棚养殖池，水体中的弧菌数量都持续增多。且在各个采样时间内大棚养殖池中的弧菌数量均高于室外养殖池，至最后一次采样(8月13日)，大棚养殖池中弧菌的平均密度达到了(3.7±0.9)×104 CFU/ml；而室外养殖池仅为(6.3±4.0) ×102 CFU/ml。
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图 1 大棚养殖池及室外养殖池中弧菌数量的变化趋势 Fig.1 Changes of Vibrio density in the ponds indoor and outdoor |
分别统计大棚和室外养殖池养殖水体不同采样时间各种弧菌的占有率(图 2和图 3)。由图 2和图 3可知，无论大棚养殖池还是室外养殖池，均存在副溶血弧菌、溶藻弧菌、欧文氏弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌。大棚养殖池中，各种弧菌于6月14日前的占有率变化不大，之后，水体中的副溶血弧菌占有率持续升高，至采样末期达到了56.5%；室外养殖池养殖水体中7月4日之前，各种弧菌占有率均较低(13%以下)，随后，副溶血弧菌的占有率快速上升，至采样末期达21.4%。
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图 2 不同采样时间内大棚养殖水体中5种主要弧菌的占有率 Fig.2 Ratio of 5 Vibrio to total culturable bacteria in ponds indoor at different sampling time |
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图 3 不同采样时间内外塘养殖水体中5种主要弧菌的占有率 Fig.3 Ratio of 5 Vibrio to total culturable bacteria in ponds outdoor at different sampling time |
所跟踪的养殖池中，对虾感染EHP的检测结果见表 4。由表 4可知，养殖场于6月14日首次检出EHP，出现在大棚养殖池G1，另外2个大棚养殖池分别于7月4日与24日检出EHP。所有的4个外塘池仅在最后一次取样时，有3个池中检出EHP。代表性EHP检测结果见图 4。
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图 4 7月4日各池样品EHP PCR扩增产物 Fig.4 PCR products for detection of EHP in the sample of date 4th July A：第1轮PCR产物；B：第2轮PCR产物；M：DL2000 DNA分子标准；G1~G3：大棚养殖池；W1~W4：室外养殖池；N：阴性对照；P：阳性对照。下同 A: PCR products of first round; B: PCR products of second round; M: DL2000 DNA marker; G1~G3: Ponds indoor; W1~W4: Ponds outdoor; N: Negative control; P: Positive control. The same as below |
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表 4 EHP检测结果 Tab.4 Detection results of EHP |
AHPND跟踪监测的结果见表 5。由表 5可知，在7月4日检测时，所有检测池中的对虾AHPND均为阴性，至7月24日，除了室外养殖池W4外，均检出AHPND；8月13日检测显示，所用跟踪的养殖池中的对虾均有AHPND检出。代表性AHPND检测结果见图 5。
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图 5 7月24日各池样品AHPND PCR扩增产物
Fig.5 PCR products for detection of AHPND in the sample of date 24th July
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表 5 AHPND检测结果 Tab.5 Test results of AHPND |
对各采样期对虾样品进行PCR扩增，检测WSSV、IHHNV、CMNV、IMNV 4种对虾病毒，均未有出现阳性条带，部分代表性PCR结果分别见图 6。说明该养殖场养殖凡纳滨对虾感染这4种病原的几率很低。
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图 6 8月13日各池样品WSSV、IHHNV、CMNC及IMNV 4种对虾病毒PCR扩增产物 Fig.6 PCR products of WSSV、IHHNV、CMNV and IMNV in the sample of date 13th August A、B分别为WSSV第1轮及第2轮PCR产物；C、D分别为引物389F/389R及309F/309R检测IHHNV PCR产物；E、F分别为CMNV第1轮及第2轮PCR产物，G、H分别为IMNV第1轮及第2轮PCR产物 A: First round PCR products for WSSV; B: Second round PCR products for WSSV; C: PCR products for IHHNV by primer 389F/389R; D: PCR products for IHHNV by primer309F/309R; E: First round PCR products for CMNV; F: Second round PCR products for CMNV; G: First round PCR products for IMNV, H: Second round PCR products for IMNV |
检测各期大棚养殖池及室外养殖池水体中NH4+-N及NO2–-N平均浓度，结果分别见图 7、图 8。在大棚养殖池中，无论NH4+-N还是NO2–-N，其变化的幅度较大，而室外养殖池中，变化相对平稳。NH4+-N的最高值出现在7月上旬的大棚养殖池中，平均浓度达到(3.5±2.0) mg/L，而NO2–-N浓度在养殖中后期的大棚养殖池中持续提高，至8月14日，平均浓度已达到(8.2±0.7) mg/ml。
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图 7 对虾养殖水体中NH4+-N浓度的变化趋势
Fig.7 Variation of the concentration of NH4+-N in the shrimp ponds
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图 8 对虾养殖水体中NO2--N浓度的变化趋势 Fig.8 Variation of the concentration of NO2--N in the shrimp ponds |
近几年来，国内外养殖的凡纳滨对虾病害发生较为普遍，导致养殖产量降低，效益下滑，而对虾病原的多样化给对虾病害防控带来了较大的难度。特别是EHP的暴发流行，给产业带来的冲击较大。EHP是一种细胞内寄生虫，首次发现于泰国(Tourtip et al, 2009)。近年来，在中国养殖的日本囊对虾(Penaeus japonicus)、凡纳滨对虾以及罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)中也有检出(刘珍等, 2016)，对虾感染EHP后可导致生长迟缓(Rajendran, et al, 2016; Chayaburakul, et al, 2004)。Aranguren等(2017)研究表明，对虾感染EHP后，易受敏感性细菌的侵染。本研究结果表明，所跟踪的养殖场，随着养殖过程的持续，EHP病原存在扩散的可能，最初的EHP发现于大棚养殖池中，至养殖末期，除了W1外，其他所有跟踪的池塘中均检出EHP感染。尽管该养殖场的养殖用水采用漂白粉消毒处理，但由于该养殖场进排水采用同一条水渠，对养殖废水并没有进行消毒处理，为病原扩散提供了条件。
早期的研究发现，对虾AHPND的发生与感染含有PirA及PirB质粒的副溶血弧菌有关(Lee, et al, 2015; Tran, et al, 2013; 孙明玉等, 2018)，最近研究表明，对虾感染坎氏弧菌(Han et al, 2017)、哈维氏弧菌(Kondo et al, 2015)后也表现出AHPND症状。本研究跟踪检测AHPND的结果显示，在养殖前期(7月4日前)养殖场中并未检测出该病菌，但在7月24日后，几乎在所有跟踪的养殖池中检测到了AHPND的弱阳性信号，且持续到末期感染均为弱阳性，结合养殖对虾发病特点及其他弧菌的检测结果认为，该养殖场中对虾存在诱发AHPND的副溶血弧菌，特别是在大棚养殖池中，但副溶血弧菌并不是唯一导致对虾发病的因素，因在养殖水体中及对虾体内也检测出其他的致病弧菌，如溶藻弧菌、欧文氏弧菌、创伤弧菌和哈维氏弧菌，对该类弧菌的致病力评估尚待研究。
在跟踪的7个养殖池中，出现明显病害的3个池塘均为大棚养殖池，尽管所放的对虾种苗来源及养殖用水与室外养殖池相似，因大棚养殖池投苗密度是室外养殖池的5倍，相应的饵料投喂量也远高于室外养殖池，由此可导致水体中氨氮及亚硝基氮的浓度在养殖中后期出现超标现象(图 4、图 5)，达到了危害对虾的范围(魏俊利等, 2012)。表明，大棚养殖池中水质管理存在欠缺，导致养殖废物排放不彻底，水质变差。已有研究表明，较高的氨氮浓度能降低凡纳滨对虾的抵抗力(黄翔鹄等, 2006)，增加对副溶血弧菌的易感性(葛红星等, 2014)。
综合分析本研究所检测的各种对虾病原及养殖环境条件认为，该凡纳滨对虾养殖场存在多种对虾病原，其中，多种弧菌与EHP共感染是导致大棚养殖对虾发病的原因之一。结合大棚养殖池与室外养殖池的发病特点，可以推断，大棚养殖池中因放养密度高，水质管理不善，氨氮及亚硝基氮浓度过高，是导致大棚养殖池对虾发病的主要因素。本研究跟踪调查的WSSV、IHHNV、IMNV、CMNV 4种对虾病毒，是近年来在凡纳滨对虾养殖中危害较为严重的病原，但是，在本场并没有阳性样品检出，表明这些病毒性病原不是该对虾养殖场的致病因子。提示在未来的对虾养殖中，对EHP、细菌病的防控及水环境管理也应引起高度的重视。
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