2. 水产科学国家级实验教学示范中心 上海海洋大学 上海 201306
2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306
酵母双杂交技术最初是由Fields等(1989)在进行真核基因转录调控研究中用来检测酵母体内蛋白与蛋白相互作用的系统，目前，主要用于研究蛋白与蛋白之间的相互作用。酵母双杂交系统包括2个相互独立的功能结构——DNA结合域(DNA-BD)和转录激活域(AD)，这2个结构在细胞内相距较远时不能激活转录，当二者通过某种作用在空间上相互接近时，才能激活报告基因的转录(Ozenberger et al, 1995)。由于酵母双杂交技术具有高灵敏度、简便操作等优点，所以，该技术越来越广泛地应用于蛋白质相互作用的研究(Yu et al, 2012)。
对虾白斑综合征病毒(WSSV)是水产养殖中主要的病原，给水产养殖行业造成了巨大的经济损失。研究表明，其开放阅读框wsv112编码脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTP pyrophosphatase, dUTPase)(Liu et al, 2005)。自20世纪90年代在大肠杆菌(Escherichia coli)中发现dUTPase以来，一直为学术界研究的热点，其广泛存在于真核生物(植物、动物)、原核生物(细菌)和病毒中。dUTPase是一种水解酶，能够水解脱氧尿苷三磷酸(dUTP)，形成脱氧尿苷单磷酸(dUMP)和无机焦磷酸(PPi)。甲基化的dUMP可形成胸腺嘧啶脱氧核糖核苷三磷酸(dTTP)，dTTP是DNA合成的主要成分，因此，dUTPase对WSSV的生存具有重要的作用，维持低水平的dUTP/ dTTP比例，可降低dUTP在DNA合成中的插入和错配，减少突变频率(Payne et al, 2001; Chen et al, 2002; Liu et al, 2005)。McGeoch(1990)研究发现，不同生物中dUTPase分子量差别很大，但在N末端含有5个高度保守的序列，分别为motif 1(A GFDL)、motif 2 (GKSS)、motif 3(GIIDFGYTG)、motif 4 (GQKFAQL)和motif 5(RGDKGFGS)(招丽婵等, 2008)。一些病毒尤其是逆转录病毒编码的dUTPase协助病毒完成侵染的过程，并且与毒力有关，可作为病毒治疗的靶位点(陈巧林等, 2002; Cottone et al, 2002)。dUTPase在病毒的生命周期中发挥独特的作用，但关于dUTPase在WSSV与宿主细胞的相互作用以及表达调控机制仍不清楚。
本研究利用酵母双杂交技术初步筛选与wsv112互作的宿主蛋白，为深入研究wsv112的功能，揭示WSSV侵染宿主细胞的途径提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试剂与主要材料酵母菌株Y2HGold和Y187、YPDA培养基、营养缺陷型培养基[SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu (DDO)、SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA(DDO/X/A)]、X-alpha-Gal和YeastmakerTM Yeast Transformation System购自Clontech公司；pGADT7、pGADT7-T、pGBKT7、pGBKT-53、pGBKT7-lam质粒甘油菌由本实验室保存；E.coli Top10、酵母菌质粒小提试剂盒购自天根科技生物公司；氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)、卡那霉素(Kanamycin, Kan)和质粒小提试剂盒购自Solarbio公司；T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自Thermo公司。
1.2 实验方法 1.2.1 诱饵载体的构建根据wsv112基因的ORF设计带有Nde I和Pst I酶切位点的引物w112s (5'-GAC ATATGATGGACTCATCTGCATC-3')和w112a (5'-ATC TGCAGTGTATACTCCTCCACGC-3')，以WSSV提取的DNA为模板，PCR扩增目的序列。PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳后回收，将胶回收的产物和酵母表达载体PGBKT7分别经过Nde I和Pst I双酶切后，用T4 DNA连接酶连接，构建重组表达载体pGBKT7-112，将其转化到E. coli Top10感受态细胞中。挑单克隆，进行菌液PCR，筛选阳性克隆送生工生物工程(上海)有限公司测序验证。
1.2.2 酵母菌阴性及阳性接合对照感受态Y2H Gold、Y187的制备及相关转化步骤参照Clontech公司YeastmakerTM Yeast Transformation System转化手册进行。按照表 1所列进行阳性和阴性质粒转化，转化菌液分别稀释10、100和1000倍后，涂布于对应的单缺培养基上，37℃培养5 d，观察菌落生长情况。
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表 1 阴性和阳性对照质粒转化 Tab.1 Transformation of negative and positive plasmid |
分别挑取单克隆Y2H Gold(pGBKT7-53)和Y187 (pGADT7-T)加入同一个含有500 μl 2×YPDA的1.5 ml离心管中，涡旋混匀，30℃，250 r/min过夜培养，作为酵母双杂交的阳性对照(P)；以Y2H Gold(pGBKT7- Lam)和Y187(pGADT7-T)作为阴性对照(N)。将菌液稀释10、100、1000倍后涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu(DDO)、SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal(40 μg/ml)/ AbA(200 ng/ml)(DDO/X/A)培养基上，30℃倒置培养5 d，观察菌落生长情况。从DDO平板挑取含有2种质粒的菌株保种作为后续实验阴、阳性对照。
1.2.3 诱饵载体pGBKT7-112毒性和自激性的检测感受态酵母菌Y2H Gold制备及相关转化步骤按照Clontech公司YeastmakerTM Yeast Transformation System转化手册。将重组质粒pGBKT7-112和空质粒pGBKT7分别转入Y2H Gold感受态细胞。转化菌液分别稀释10、100和1000倍后涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固体培养基上，30℃倒置培养3~4 d，观察各平板酵母菌菌落的数量、大小、颜色，进行诱饵质粒pGBKT7-112的毒性和自激性检测。
1.2.4 酵母双杂交筛选与wsv112互作的基因挑取含有pGBKT7-112质粒的Y2HGold单克隆于50 ml SD/-Trp液体培养基中30℃，250 r/min培养至OD600 nm达到0.8，1000×g离心5 min，用4 ml SD/-Trp重悬沉淀，加入1 ml构建好的文库和45 ml 2×YPDA/Kan(50 μg/ml)，30℃30 r/min振荡培养20 h，显微镜观察结合情况，当视野中出现“米老鼠头”或“三叶草”形状时，结束接合。1000×g离心10 min后用0.5×YPDA/Kan重悬沉淀，共收集到10 ml悬浮细胞。100 μl 10–1、10–2、10–3、10–4倍的稀释液铺在100 mm SD/-Trp、SD/-Leu、DDO固体培养基上，30℃，培养3~5 d；剩余所有菌液涂布于DDO/X平板上，30℃倒置培养5~7 d，直至长出克隆。用灭菌的牙签将DDO/X培养基上生长的蓝色克隆转移至筛选力度更强的SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA(QDO/X/ A)培养基上，30℃培养3 d。为排除假阳性和多种质粒融合现象，将蓝色克隆在QDO/X/A上反复筛选至少3次。
将筛选出的蓝色克隆编号，并接种于1 ml QDO/A液体培养基中，30℃ 250 r/min培养，用PGADT7通用引物进行菌液PCR，检测蓝色克隆中插入cDNA片段的大小。PCR产物由生工生物工程(上海)有限公司测序，分析测序结果。
1.2.5 获得与wsv112互作基因的质粒按照酵母质粒小提试剂盒提取筛选的酵母质粒，并转化到E.coli Top10感受态细胞中，经Amp+和菌液PCR筛选出阳性克隆测序。选取含有正确序列的质粒，扩大培养后抽提质粒，得到插入片段的质粒。
1.2.6 回复杂交验证互作蛋白为进一步排除实验的假阳性，将上述得到的质粒pGADT7-X转化到含有pGBKT7-112诱饵载体的Y2H Gold菌株中(各质粒转化情况如表 2所示)，以pGADT7-T+pGBKT7-lam作为阴性对照，以pGADT7-T+pGBKT7-53为阳性对照。以pGADT7-X+pGBKT7、pGADT7+pGBKT7-112、pGADT7+pGBKT7为空质粒对照，pGADT7-X与pGBKT7-112共转化组在QDO/A/X培养基上如果不生长或菌落为白色，则pGADT7-X判断为假阳性；如果生长且菌落为蓝色，各阴性对照培养板无菌落生长则为阳性。
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表 2 回复杂交转化 Tab.2 The grouping of reply hybrid |
表达载体pGBKT7和wsv112双酶切连接后构建成重组质粒，菌落PCR检测结果如图 1所示，条带在1500~2000 bp之间与理论值相符，与wsv112标准序列对比后无碱基突变和移码现象。
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图 1 重组载体pGBKT7-112菌液PCR检测 Fig.1 PCR identification of recombinant plasmids M：DNA标准分子量2000；1：阴性对照；2~8：重组质粒； M: DNA Marker DL2000; 1: Negative control 2~8: Recombinant plasmids |
将pGBKT7-53、pGBKT7-lam、pGADT7-T转化到相应的酵母菌株后，将菌液稀释10、100和1000倍涂布到对应的缺陷型培养基上，30℃培养5 d，观察菌落生长情况，结果如图 2A~图 2C所示，每一种菌株生长状态完好，可用于后续实验。挑取单克隆菌株Y2H Gold(pGBKT7-53)和Y187(pGADT7-T)进行接合，作为阳性对照；Y2H Gold(pGBKT7-Lam)和Y187 (pGADT7-T)接合为阴性对照，涂布到相应的缺陷型培养基上，30℃培养5 d，观察菌落生长情况，结果如图 2D~图 2F所示。阳性对照菌株在DDO/X/A培养基上生长且为蓝色，说明该菌株可以激活AbA和X-α-Gal报告基因，可作为阳性对照；阴性对照菌株在DDO培养基上生长良好，在DDO/X/A培养基上无法生长，说明阴性菌株不能激活AbA和X-α-Gal报告基因，可作为阴性对照。
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图 2 对照菌株在不同缺陷型培养基上的生长情况 Fig.2 The growth of control groups on different culture medium A：pGBKT7-53转化到Y2H Gold在SD/-Trp培养基上；B：pGBKT7-lam转化到Y2H Gold在SD/-Trp培养基上；C：pGADT7-T转化到Y187在SD/-Leu培养基上；D：阳性对照在DDO/X/A培养基上；E：阴性对照在DDO培养基上；F：阴性对照在DDO/X/A培养基上 A: Y2H Gold transformants with pGBKT7-53 grow on SD/-Trp plates; B: Y2H Gold transformants with pGBKT7-lam grow on SD/-Trp plates; C: Y187 transformants with pGADT7-T grow on SD/-Leu plates; D: The positive control grow on DDO/X/A plates; E: The negative control grow on DDO plates; F: The negative control grow on DDO/X/A plates |
将构建成功的诱饵载体pGBKT7-112和空质粒pGBKT7分别转入Y2H Gold感受态细胞中，30℃倒置培养于SD/-Trp、SD/-Trp/X、SD/-Trp/X/A固体培养基上5 d后，观察培养基克隆生长状况(图 3A~图 3C)。结果发现，菌落只有在SD/-Trp、SD/-Trp/X培养基上生长，在SD/-Trp/-Ade-X培养基上没有菌落生长，说明诱饵质粒不能激活Aba报告基因，没有自激性；含有pGBKT7质粒的菌落和含有pGBKT7-112的菌落大小和数目差别不大(图 3A和图 3D)，说明诱饵菌株也没有毒性，可用于酵母双杂交实验。
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图 3 诱饵载体pGBKT7-112转录自激性的检测 Fig.3 Assay of self-transcriptional activation and toxicity of pGBKT7-112 A：pGBKT7-112转化到Y2H Gold在SD/-Trp培养基上；B：pGBKT7-112转化到Y2H Gold在SD/-Trp/X培养基上；C：pGBKT7-112转化到Y2H Gold在SD/-Trp/X/A培养基上；D：pGBKT7转化到Y2H Gold在SD/-Trp培养基上；E：阳性对照在SD/-Trp/X/A培养基上；F：阴性对照在SD/-Trp培养基上 A: Y2H Gold transformants with pGBKT7-112 grow on SD/-Trp plates; B: Y2H Gold transformants with pGBKT7-112 grow on SD/-Trp/X plates; C: Y2H Gold transformants with pGBKT7-112 grow on SD/-Trp/X/A plates; D: Y2H Gold transformants with pGBKT7 grow on SD/-Trp plates; E: The positive control grow on SD/-Trp/X/A plates; F: The negative control grow on SD/-Trp plates |
将剩余的杂交菌液全部涂布在DDO/X固体培养基上，30℃培养5 d后。将长出的蓝色克隆全部划线到筛选力更强的QDO/X/A固体培养基上，反复筛选3次后，共得到526株蓝色克隆。利用pGADT7通用引物扩增PCR检测蓝色克隆中插入的片段，将PCR产物测序，经分析共筛选出6株具有意义的序列，其编号分别是1-5、4-7、6-35、8-23、8-39、8-45。
2.5 回复杂交验证互作基因将筛选得到的6个质粒pGADT7-X与pGBKT7- 112共同转化到Y2H Gold酵母菌中进行回复杂交实验，同时，设置阴、阳对照组和空质粒对照组，回复杂交的实验结果如图 4所示，阳性对照(pGBKT7-53+ pGADT7-T)能够激活报告基因的表达，在QDO/X/A培养基上长出蓝色克隆；阴性对照(pGBKT7-lam+ pGADT7-T)、空白质粒对照(pGADT7+pGBKT7)不能激活报告基因的表达，在QDO/X/A培养基上不生长；证明实验体系完好。pGADT7-1-5+pGBKT7、pGADT7-4-7+pGBKT7、pGADT7-6-35+pGBKT7、pGADT7-8-23+pGBKT7、pGADT7-8-39+pGBKT7、pGADT7-8-45+pGBKT7、pGADT7+pGBKT7112酵母菌株在QDO/X/A培养基上不生长，说明编号1-5、4-7、6-35、8-23、8-39、8-45及wsv12基因无自激性。pGBKT7-112+ pGADT7-4-7、pGBKT7-112+pGADT7- 8-23菌株能够在QDO/X/A培养基上生长出蓝色克隆，说明wsv112与编号4-7和8-23基因能够相互作用。pGBKT7-112+pGADT7-1-5、pGBKT7-112+pGADT7 -6-35、pGBKT7-112+pGADT7-8-39、pGBKT7-112+ pGADT7-8-45菌株不能在QDO/X/A培养基上生长，说明wsv112不与编号1-5、6-35、8-39和8-45的基因相互作用。综上所述，本研究共筛选出2个阳性质粒，编号分别为4-7和8-23，测序分析其基因编码蛋白分别与日本囊对虾(Penaeus japonicus) C型凝集素(AGW27416.1)和克氏原螯虾(Procambarus clarkii) 40S核糖体蛋白S20小亚基蛋白(ALE99171.1)具有37%和98%的同源性。
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图 4 回复杂交的16个转化组在QDO/X/A平板上生长的情况
Fig.4 The growth of 16 transformants on highly selective medium in retest
1~8: Y2H Gold (pGBKT7-112+pGADT7-4-7, pGBKT7-112+pGADT7-1-5, pGBKT7-112+ pGADT7-6-35, pGBKT7-112+pGADT7-8-23, pGBKT7-112+pGADT7-8-39, pGBKT7-112+ pGADT7-8-45, pGBKT7-53+ pGADT7-T(P), pGBKT7-lam+pGADT7-T(N) 01~08: Y2H Gold(pGADT7-4-7+pGBKT7, pGADT7-1-5+pGBKT7, pGADT7-6-35+pGBKT7, pGADT7-8-23+ pGBKT7, pGADT7-8-39+pGBKT7, pGADT7-8-45+pGBKT7, pGADT7+pGBKT7112, pGADT7+pGBKT7) |
为进一步探讨wsv112在WSSV侵染过程中的作用机制，本研究以wsv112为诱饵利用酵母双杂交技术从凡纳滨对虾肠道cDNA文库中筛选出与wsv112互作的蛋白。根据wsv112的序列设计特异性引物构建诱饵表达载体并转入到Y2H Gold酵母菌中，观察菌株在不同缺陷型培养基上的生长情况，证明诱饵载体没有自激性和毒性，可利用酵母双杂交技术筛选与之互作的蛋白。将含有诱饵质粒pGBKT7-112的Y2HGold菌株与凡纳滨对虾肠道cDNA文库融合，利用缺陷型培养基、颜色反应、PCR检测、回复杂交等实验环节逐步筛选阳性克隆，最终得到2个与wsv112互作的蛋白，分别与日本囊对虾的C型凝集素和克氏原螯虾40S核糖体蛋白S20亚基蛋白具有同源性。
肝胰腺和血组织是甲壳动物表达C型凝集素最丰富的部位，因其含有能识别入侵病原表面糖类的C型凝集素样结构域(CTLD)，因此，被认为是一类模式识别受体，在先天免疫识别中发挥重要作用(Weis et al, 1998; Dodd et al, 2011)，如细胞粘附、酚氧化酶的激活、结节形成、吞噬和包被作用等(Lis et al, 1998; Koizumi et al, 1999; Yu et al, 1999、2004)。有些C型凝集素还具有抑菌或抗病毒的作用(Luo et al, 2003; Sun et al, 2008; 高焕等, 2012; 于金红等, 2013)。对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)敏感的C型凝集素在感染的前期发挥作用，针对WSSV敏感的C型凝集素在感染后期起作用(王显伟, 2012)。由此推测，wsv112可能在感染的后期发挥作用。
核糖体是所有生物进行蛋白质合成的场所，是具有复杂结构的蛋白核酸复合物。哺乳动物的核糖体由79个核糖体蛋白(RP)和4种RNA组成；其中，40S核糖体包含32种RPs，60S核糖体含有47种RPs (Wool, 1979; Wool et al, 1995)。由于从细菌到高等生物的广泛物种中都存在，核糖体已经成为研究分子进化的重要大分子。关于人类所有的79个RPs的结构域功能都已基本清楚，关于甲壳动物的RPs，虽然已有一些研究，但是针对40S核糖体蛋白S20亚基蛋白的结构和功能还未被了解透彻。本研究初步确定40S核糖体蛋白S20亚基蛋白及C型凝集素与wsv112的作用，为进一步揭示WSSV的侵染机制提供了一个新线索，其相互作用机制尚需进一步研究。
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