IL-15是白介素(Interleukin, IL)家族的重要成员之一，它与IL-2、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)等，同属于4α螺旋细胞因子家族(Lodolce et al, 2002)。转录水平的IL-15存在于多种类型细胞和组织器官中，包括表皮细胞、上皮细胞、神经细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及心脏、肺、脾和骨骼肌等(Carson et al, 1995; Lee et al, 1996)。但蛋白水平的IL-15在血清或培养细胞的上清液中却很难被检测到。这种现象与IL-15基因的蛋白表达受严谨调控相关，这些调控方式包括5′-UTR多个翻译起始位的存在、特殊的信号肽及羧基末端的某些结构等(Bamford et al, 1996、1998; Kurys et al, 2000)。IL-15是一种多效细胞因子，具有增强淋巴细胞活性、促进粒细胞吞噬(Ratthé et al, 2004)和NK细胞发育并增强其细胞毒性的作用(Fehniger et al, 2001; Lodolce et al, 2002)。此外，IL-15还具有刺激T细胞/B细胞增殖、诱导免疫球蛋白分泌、刺激特异性抗原产生、诱导信号转导和转录激活蛋白表达等多种功能(王东勇等, 1996)。

尽管功能多样，但由于白介素等细胞因子在趋异进化过程中的变异程度相当高，导致鱼类相关基因的开发难度加大，免疫功能研究相对滞后(贝锦新, 2006)。2004年之前，硬骨鱼IL-15的相关研究工作几乎未见报道。随着红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)和斑马鱼(Danio rerio)等物种基因组计划的完成，一系列细胞因子包括IL-15才开始被陆续发现和鉴定(Bei et al, 2006; Fang et al, 2006; Gunimaladevi et al, 2007)。除了以上3种鱼，目前，lL-15也仅在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)、金头鲷(Sparus aurata)、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)、露斯塔野鲮(Labeo rohita, Hamilton)等少数鱼类中克隆得到(方玮, 2009; Das et al, 2015; Pérez-Cordón et al, 2014; Wang et al, 2007)。研究发现，鱼类lL-15可以由多种组织和细胞产生，组织分布广泛；受到不同诱导物免疫刺激后，lL-15表达上调，但上调时间和不同组织的表现有所不同(贝锦新, 2006; 方玮, 2009)。此外，lL-15还参与了鱼体对抗寄生虫的免疫反应(Pérez-Cordón et al, 2014; Das et al, 2015)。虹鳟体外重组表达lL-15蛋白能诱导虹鳟脾脏细胞产生IFN-γ (Wang et al, 2007)。红鳍东方鲀重组表达的lL-15，能活化鱼的外周血白细胞、小鼠T淋巴细胞(CTLL-2)、鱼的头肾细胞和胸腺细胞，说明重组蛋白具有活化增殖免疫细胞的生物学功能(贝锦新, 2006; 孙赛红等, 2015)。这些研究为今后进一步深入开展重组lL-15在鱼类健康养殖上的应用研究提供了基础。

松江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel)，隶属于鲉形目(Scorpaeniformes)、杜父鱼科(Cottidae)、松江鲈属(Trachidermus)，是一种近海溯河洄游的肉食性鱼类(于诗群等, 2008; 陈学昭等, 2016)。近年来，由于种群数量剧减，被列为国家Ⅱ级保护动物(陈学昭等, 2016)。目前，关于IL-15基因在松江鲈体内的研究尚未开展，本研究克隆了松江鲈IL-15(命名为TfIL-15)的基因，分析了序列结构特征，应用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技术研究了其在鱼体内的分布和免疫刺激后基因应答情况，并利用原核表达系统体外表达了IL-15成熟肽的重组蛋白。研究结果可进一步丰富鱼类细胞因子的研究内容，有利于阐明鱼类细胞因子与鱼类免疫系统的关系。重组蛋白的表达为进一步开展对TfIL-15的功能研究和抗体制备奠定了基础。

9~10月龄的松江鲈(体重约15~23 g)取自山东文登埠口松江鲈自然保护区，实验前置于充气海水中(12℃~14℃)饲养1周。选取正常健康个体，麻醉后心脏取血，然后解剖取其心脏、肝脏、鳃、肠、皮肤、肾脏、脾脏、脑、卵等组织，立即放入Trizol中研磨，用于提取正常组织RNA。

LPS (Lipopolysaccharides, 脂多糖)刺激实验，将松江鲈平均分成2组(每组50条)，一组腹腔注50 μl (0.04 mg/kg)的LPS，对照组注射等体积无菌生理盐水。刺激后0、2、6、12、24、48、72、96 h麻醉取样(每次6条)，分别取其血、皮肤、肝脏和脾脏用于组织总RNA提取。

依据Trizol (Invitrogen公司)操作说明提取各样品的组织总mRNA。cDNA第一链的合成参照Clontech公司SMART(Switching mechanism at 5′ end of RNA template)的指导说明进行(表 1)(史晓丽等, 2018)。

表 1(Tab.1)

表 1 PCR引物名称及序列 Tab.1 PCR primers and the sequences 引物Primers 引物序列Primer sequence (5′~3′) 目的Purpose 15F ACTACCCTGTTGACTGTCCACC 5′ RACE and 3′ RACE 15R CACAGAAGTACTCAGGAGGC 3′ anchor R GACCACGCGTATCGATGTCGAC 5′ Primer TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAA Oligo-anchor R GACCACGCGTATCGATGTCGACT16(A/C/G) 反转录PCR Reverse transcription PCR Smart F TACGGCTGCGAGAAGACGACAGAAGGG 15RTF CTGACGCTATGCTGTATGCTCCG qRT-PCR 15RTR CGTTGTCCGACTATTCATTTCTTGC ActinF TGAGACCACCTACAACAGCATC qRT-PCR ActinR GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 15EMF TACTCAGAATTCGCTGAGCGTCCTTCGGTTTAT 蛋白表达Protein expression 15EMR TACTCACTCGAGTTACGTTGTCCGACTATTCAT

表 1 PCR引物名称及序列 Tab.1 PCR primers and the sequences

根据LPS刺激后cDNA文库的构建获得TfIL-15基因的EST序列，利用Primer 5.0设计特异性后引物15R与5′ primer配对进行5′ RACE克隆；设计特异性前引物15F与3′ anchor R配对进行3′ RACE克隆。所用模板为松江鲈刺激后肝脏cDNA，反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸40 s，30个循环；72℃延伸7 min。然后将PCR纯化产物与pMD-18T载体连接，克隆测序，得到5′端和3′端序列片段。

利用软件BioEdit对RACE获得的两端cDAN序列进行拼接，以获得TfIL-15的cDNA全长序列；通过在线软件ExPASy(http://www.au.expasy.org/)对TfIL- 15的cDNA序列进行蛋白翻译、等电点及分子量预测；TfIL-15编码蛋白的信号肽、糖基化位点分别应用SignalIP 4.1和NetNGlyc1.0 Server进行分析；蛋白的三级结构预测在SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)进行，然后用PyMol软件进行三维结构的建构与标注；在NCBI下载同源序列，利用ClustalW、BioEdit和DNAman进行同源序列比对分析，利用MEGA5.0软件以邻位法(Neighbor-joining, NJ)构建系统发育树。

TfIL-15的组成型表达及刺激后表达模式的变化通过qRT-PCR分析来进行。根据TfIL-15 cDNA序列设计qRT-PCR引物(表 1)，以正常各组织及刺激组和对照组的不同时间点cDNA为模板，进行反应。反应条件：94℃ 3 min；94℃ 15 s，60℃ 60 s，40个循环(陈学昭等, 2016)，结束后进行熔解曲线分析。以β-actin作为内参基因，每个样品cDNA设3个平行实验。反应和分析使用7300实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems, 美国)进行。基因的相对表达量根据2^-ΔΔCt法计算，结果用平均值±标准差(Mean±SD)表示(马慧鑫等, 2018)。差异显著性使用T检验的方法分析，当差异显著性水平P < 0.05时认为差异显著。

TfIL-15基因成熟肽的两端引物分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，插入到pET-30a(+)表达载体的多克隆位点中，构建pET-30a(+)/TfIL-15表达载体转化入大肠杆菌克隆菌株DH5α中。经阳性克隆筛选后，提取构建好的质粒载体转化表达菌株BL21(DE3)并进行阳性筛选。

将筛选出的菌落分别置于LB液体培养基中过夜培养。次日，将过夜菌转培养(1 : 100的比例)至新的液体LB培养基中约3 h。待其OD_{600 nm}为0.6~0.8时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG进行诱导。诱导结束后，收集菌体，通过SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。进一步的超声破碎检测发现，蛋白以包涵体形式表达。

在确定重组蛋白表达的情况下，进行蛋白的大规模培养表达，表达结束用PBS重悬菌体超声破碎1 h。将超声破碎后沉淀进行包涵体洗涤，然后用GenScript的His-tag亲和层析柱进行纯化，具体操作步骤参见Yu等(2013)的方法。重组蛋白的复性采用尿素梯度透析法，每个梯度4℃透析16 h (王彤等, 2013)。透析结束后，通过SDS-PAGE检测重组蛋白的纯化结果。

松江鲈IL-15全长cDNA序列(图 1，GenBank登录号为MH299805)为1140 bp，其中，5′-非编码区(5′-UTR) 165 bp，开放阅读框(ORF)522 bp，3′-UTR 453 bp。在5′-UTR区域，存在4个读码框外的AUG翻译起始位点。基因ORF编码173个氨基酸(aa)，其中，前59 aa为信号肽序列。成熟肽全长为114 aa，预测分子量为12.975 kDa，理论等电点为5.15。成熟肽含有2个可能的N糖基化位点：NASM，132~134；NITV，153~155。

图 1(Fig. 1)

图 1 TfIL-15的cDNA序列及其编码序列 Fig.1 The nucleotide and deduced amino acid sequences of TfIL-15 下划线标出的分别为起始密码子和终止密码子。阴影部分为N-糖基化位点。箭头表示信号肽切割位点。方框内为5′-UTR区读码框外的ATG翻译起始位点 The start codon and stop codon are underlined, the N-glycosylation sites are shadowed by gray, the arrow indicates the signal peptide cleavage site, and the four out-of-frame ATG initiation codons in the 5′ UTR are indicated in the boxes

将TfIL-15与其他物种同源序列进行比对，发现TfIL-15与条石鲷(BAN84544.1)的同源性最高为61%，其次为三刺鱼(NP_001254613.1) 59%，与斑马鱼同源性为23%，与鱼类序列同源性在23%~61%之间。与鸡(Gallus gallus, AAF61446.1)同源性为24%，与人类IL-15(Homo sapiens, AAA21551.1)同源性为25%，与哺乳类同源性在20%~25%之间(表 2)。氨基酸序列多序列比对发现，鱼类IL-15与鸟类和哺乳类IL-15的成熟肽区域的同源性较信号肽高，鱼类lL-15同源序列含有与鸟类和哺乳类相同的4个保守的半胱氨酸残基(图 2)。

图 1(Fig. 1)

图 2 不同物种IL-15氨基酸序列的多序列比对 Fig.2 Alignment of the amino acids of IL-15 protein sequences 保守的半胱氨酸以方框表示，箭头表示形成的二硫键结构，信号肽切割位点以]表示。序列的GenBank登录号分别为：人H. sapiens (AAA21551.1), 褐家鼠R. norvegicus (AAB94536.1), 牛B. taurus (AAA85130.1), 野猪S. scrofa (ABI81495.1), 鸡G. gallus (AAF61446.1), 黑青斑河豚T. nigroviridis (AAR25702.1), 红鳍东方鲀T. rubripes (CAF28987.2), 金头鲷S. aurata (AGS55349.1), 大西洋鲑S. salar (AFB81536.1), 虹鳟鱼O. mykiss (CAD88594.1) The letters in box are the four conserved cysteine residues, the arrows indicate the formed two potential disulphide bonds, and semi square bracket indicates the potential signal peptide cleavage site

表 2(Tab.2)

表 2 脊椎动物IL-15同源性比对分析 Tab.2 Amino acid identity of TfIL-15 with other vertebrate IL-15s 物种Species 同源性Identity (%) 条石鲷Oplegnathus fasciatus 61 三刺鱼Gasterosteus aculeatus 59 金头鲷Sparus aurata 51 红鳍东方鲀Takifugu rubripes 49 牙鲆Paralichthys olivaceus 47 黑青斑河豚Tetraodon nigroviridis 42 大西洋鲑Salmo salar 31 虹鳟Oncorhynchus mykiss 28 斑马鱼Danio rerio 23 人Homo sapiens 25 鸡Gallus gallus 24 牛Bos taurus 23 野猪Sus scrofa 23 褐家鼠Rattus norvegicus 20

表 2 脊椎动物IL-15同源性比对分析 Tab.2 Amino acid identity of TfIL-15 with other vertebrate IL-15s

用SWISS-MODEL软件进行三维结构预测，发现TfIL-15具有典型4个α螺旋二级结构(图 3A)。将TfIL-15与人类的IL-15叠合时(图 3B)，发现蛋白结构较吻合，并且二硫键形成位点相互重合。此外，松江鲈另外2个半胱氨酸形成了第3个二硫键(图 3A)，TfIL-15成熟肽起始氨基酸丙氨酸(A)与人类成熟肽起始氨基酸天冬酰胺(N)重合。

图 1(Fig. 1)

图 3 理论预测的TfIL-15蛋白(A)及与人类IL-15(灰色)结构叠合图(白色) (B) Fig.3 Three-dimensional structure of modeled TfIL-15 protein (A) and the structural superposition of TfIL-15 protein (white) with human IL-15 (Grey) (B) 二硫键位置以白色箭头表示 The disulfides are indicated with arrows

系统进化分析表明，所有鱼类的IL-15聚为一大支，鸟类和哺乳动物的IL-15聚为另外一大支(图 4)。

图 1(Fig. 1)

图 4 基于不同物种IL-15的氨基酸序列构建的系统发育树 Fig.4 Phylogenetic tree constructed with amino acid sequences of IL-15 from various species 三刺鱼G. aculeatus的GenBank登录号为NP_001254613.1，其余物种的GenBank登录号同图 2，星号表示本研究物种 GenBank accession number of G. aculeatus is NP_001254613.1, and the others accession numbers are the same as in Fig.2. The position of TfIL-15 is marked by an asterisk

qRT-PCR结果表明，TfIL-15 mRNA广泛表达于松江鲈各组织中。其中，在心脏中的表达量最高，其次为鳃(图 5)。

图 1(Fig. 1)

图 5 TfIL-15基因在正常组织中的表达模式 Fig.5 The constitutive expression of TfIL-15 mRNA in different tissues of normal roughskin sculpin

腹腔注射LPS后，TfIL-15 mRNA在血液、皮肤、肝脏和脾脏中均呈上调表达(图 6)。在皮肤中，刺激后2 h表达量迅速上调至最高峰，为对照组的74倍，之后一直呈现较高的表达水平直至刺激后96 h；在血液中，刺激后2 h表达量上调至对照组的41倍，6 h表达量下降至对照组的0.23倍，之后表达量一直显著低于对照组直至实验结束；在脾脏中，刺激后2 h表达量开始上调至对照组的1.3倍，6 h略有下调，12 h达到对照组的3倍左右，之后恢复至对照组水平。在肝脏中，刺激后表达量逐渐上调，2 h、6 h表达量分别上调至对照组的2.2倍和2.4倍，12 h达到对照组的18倍，后恢复对照组水平；但在刺激后96 h，表达量再次上调至在对照组的86倍。

图 1(Fig. 1)

图 6 LPS刺激后TfIL-15在不同组织的表达模式变化 Fig.6 The temporary expression of TfIL-15 mRNA in different tissues post LPS challenge A:皮肤; B:血; C:肝脏D:脾. “*”表示实验组与对照组差异显著(P < 0.05) A: Skin; B: Blood; C: Liver; D: Spleen. The asterisks indicate significant differences (P < 0.05)

将构建的TfIL-15原核表达菌株经IPTG诱导后进行SDS-PAGE，在19 kDa处出现一条高表达蛋白的特异性条带，与预期大小相符(图 7)。将以包涵体形式表达的重组蛋白经亲和层析柱纯化、尿素梯度透析复性，可用于后续的活性检测。

图 1(Fig. 1)

图 7 TfIL-15的原核表达 Fig.7 Prokaryotic expression of TfIL-15 1:诱导前细菌总蛋白; 2:诱导后细菌总蛋白; 3:超声破碎上清液; 4:破碎后的包涵体; M:蛋白Marker; 5:纯化蛋白 Lane 1: Lysate of E. coli without induction; Lane 2: Lysate of E. coli with induced with IPTG; Lane 3: Supernatant of recombinant pET-30a(+)TfIL-15 after ultrasonication; Lane 4: Sedimentation of recombinant pET-30a(+)/TfIL-15 after ultrasonication; M: Protein marker; 5: Purified protein

本研究成功克隆到松江鲈IL-15基因cDNA全长序列，跟其他鱼类、哺乳类和鸟类的IL-15基因一样，TfIL-15的5′-UTR含有多个(4个)读码框外的AUG翻译起始位点(红鳍东方鲀2个，斑马鱼4个，黑青斑河豚2个，虹鳟7个)。TfIL-15含有一段很长的信号肽序列，这也与其他鱼类(松江鲈59 aa，红鳍东方鲀53 aa，斑马鱼68 aa，虹鳟65 aa，黑青斑河豚53 aa)以及哺乳类和鸟类相似(人类含有48 aa信号肽，鸟类66 aa)。脊椎动物IL-15这种现象的存在可能与IL-15的转录后表达受到严谨的调控有关(Bamford et al, 1996、1998; Kurys et al, 2000)。TfIL-15与条石鲷IL-15的同源性最高，尽管如此，也只有61%。与鱼类同源性在23%~61%之间，可以看出不同物种鱼类IL-15变异程度比较大，这可能是为了适应不同的生长环境而进化所致(TfIL-15与同为海水或者咸淡水鱼类同源性高于淡水鱼类)，同时这可能也是目前鱼类IL-15研究较少的原因之一。

氨基酸序列多序列比对结果显示，不同物种动物IL-15的成熟肽区域的同源性较信号肽区域高，这可能由于成熟肽参与执行细胞因子的功能，而信号肽仅参与引导IL-15的胞内转运与分泌。在人类IL-15成熟肽序列中存在4个半胱氨酸残基，能形成两对二硫键(Bernard et al, 2004)。这4个半胱氨酸在鱼类lL-15同源蛋白序列中高度保守。蛋白质三级结构预测结果显示，TfIL-15与人类IL-15三级结构基本吻合，同属于4α螺旋家族，TfIL-15的2个二硫键位置与人类二硫键位置重合。这说明这些保守残基对于维持脊椎动物IL-15空间构象的形成和功能发挥可能起重要作用。三刺鱼、红鳍东方鲀、金头鲷和本研究松江鲈中，还含有另外的2个半胱氨酸，在三维结构预测中，这2个半胱氨酸形成了第3个二硫键(图 3A)。这2个半胱氨酸是否确实形成新的二硫键，对于维持构象起到怎样的作用，尚需要进一步验证。

qRT-PCR结果显示，TfIL-15广泛表达于松江鲈各个组织器官中，这与以往研究鱼类IL-15的表达模式相同，并且类似于人类IL-15的广泛分布特征，这表明IL-15可能在多个生理过程中发挥重要的作用。值得注意的是，在卵中，IL-15也表现出了较高的转录水平表达。在对红鳍东方鲀的研究中也发现，IL-15在性腺中表达量较高。Das等(2015)在对露斯塔野鲮IL-15的研究中发现，IL-15在卵巢组织和未受精卵中也呈现出较高的表达量，而且在受精后发育初期表达量持续上调，都表明了IL-15转录本以母系遗传的形式给予待发育的后代被动免疫保护。IL-15在卵中遗传性的组成型高表达在卵排出体外、受精卵或幼体尚未获得自身免疫的时候，对于鱼类的体外受精及幼体发育过程中对抗水体复杂的病原微生物侵袭起着至关重要的作用。

为了进一步探讨TfIL-15在机体免疫中的作用，对LPS刺激后TfIL-15在松江鲈主要免疫组织内的表达情况进行了检测。结果发现，在血液和皮肤中，LPS刺激后2 h，TfIL-15迅速上调至最高峰，在肝脏和脾中12 h达到表达高峰，比皮肤和血液稍有延迟。这可能是因为血液作为承载各种免疫细胞和细胞因子的全身免疫器官，皮肤作为机体接触外界复杂水体环境的首个免疫组织，是最直接和快速的LPS应答和反应器官；而脾脏是鱼类红细胞、中性粒细胞和粒性白细胞等各种免疫细胞生产、贮存和成熟的主要场所，肝脏是鱼类多种重要免疫相关蛋白的合成场所，因而上调时间与皮肤和血液相比有所滞后。肝脏TfIL-15MRNA在刺激后96 h又出现一个新的高峰，这在对转铁蛋白、C-型凝集素、白介素1β等的研究中也有发现(Liu et al, 2012a、b; Yu et al, 2013)，原因可能是首次免疫激活的免疫细胞产生的新的信号分子，又激活了新的免疫细胞类型，从而再次上调表达TfIL-15基因。在对红鳍东方鲀的研究中发现，在LPS刺激对IL-15的表达没有明显的影响。而在黑青斑河豚的研究中，LPS可引起几乎所有组织IL-15表达量的上调。本结果与黑青斑河豚的研究类似，推测可能IL-15在不同鱼体内的功能存在一定的差异。鱼类作为低等脊椎动物，其适应性免疫机制相对不完善，因此在抵御外界病原体入侵时主要依靠先天免疫发挥作用。细胞因子IL-15的上调表达正是适应了机体所需，通过其激活淋巴细胞、促进免疫相关蛋白表达等作用，在机体对抗外来病原入侵过程中发挥重要的抵御作用。鉴于TfIL-15可能在鱼类抵抗外界刺激的免疫反应中的作用，本研究成功地对松江鲈IL-15的成熟肽进行了体外表达，这为进一步研究TfIL-15蛋白的功能奠定了基础。