条斑紫菜(Pyropia yezoensis)是大型潮间带藻类，自然分布较广，自辽宁至浙江，适合紫菜生长的岩礁海域均可发现其踪迹(曾呈奎等, 1985)。条斑紫菜的栽培主要集中在中国、日本和韩国，其味鲜美，含有丰富的必需氨基酸、维生素和矿物质，是中国两大紫菜栽培品种之一。

随着条斑紫菜栽培规模的扩大，密集栽培技术的发展，其病害问题表现越来越突出，严重影响紫菜的产量和商品质量。据不完全统计，条斑紫菜育苗和栽培过程中现已发现病害16种，已报道和发现的包括绿斑病、赤腐病、拟油壶菌病、丝状细菌症、癌肿病、缩曲症、黄斑病和色圈病等多种紫菜病害(Nakao et al, 1972; Fujita, 1973; Lin et al, 1984; 陈秋萍等, 1991; 马家海, 1992、1996;马家海等, 1999; 闫咏等, 2002)。紫菜的病害是由多方面原因引起的，致病机理非常复杂，微生物是不可忽视的重要因素之一。本研究针对山东省日照地区条斑紫菜叶状体绿斑病，开展了病原分离鉴定、致病性检测、发病进程及环境因子影响等一系列研究，旨在探明绿斑病的病因和病理，并为该病的防治提供参考数据。

患绿斑病条斑紫菜于2010年11月采自山东省日照岚山海区条斑紫菜养殖场，水温为18℃；健康条斑紫菜采自山东省青岛汇泉湾以及团岛，养殖于PES海藻培养基中(马家海, 1996)。

选择症状明显的条斑紫菜叶状体，无菌海水漂洗数次，剪取病斑藻段、匀浆，用无菌海水梯度稀释匀浆液，涂布2216E海水培养基于28℃培养5 d，挑取菌落形态一致的优势菌，采用15%的甘油保种、保存于–80℃冰箱备用。

挑选颜色正常的健康条斑紫菜叶状体，除去藻体表面杂质，置于0.7% KI溶液中浸泡15 min(方文雅, 2010)，用灭菌海水冲洗后用于回感实验。

将分离得到的疑似病原菌在2216E液体培养基中培养过夜，离心收集菌体，用灭菌PES-海水冲洗3次后重悬。吸取一定量菌悬液加到灭菌PES-海水中，制备细菌终浓度为10⁸和10⁷ CFU/ml的PES-海水，以灭菌PES-海水作为阴性对照。每个浓度感染5片紫菜叶状体，培养温度为15℃，光照周期L︰D=12︰12 (h)，光强为62.5 μmol/m²·s (5000 lx)。每个感染组和对照组设置3个平行，观察紫菜叶状体的病理发展过程，实验结束时，选择具有病症的紫菜进行细菌分离鉴定，以确证病原菌。

采用革兰氏染色法对细菌进行染色，镜检；采用Vitek 2-GN和API-ID32E生理生化检测试剂盒(生物梅里埃公司, 法国)，参照产品使用说明书对病原菌进行生理生化特征测定；利用16S rRNA基因引物27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R (5'- CTACGGCTACCTTGTTACGA-3')，PCR扩增Y1 16S rRNA基因序列；根据NCBI中20余种假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)的dnaA和dnaN基因序列，通过BioEdit软件对比序列分析，选择保守区设计2对简并引物dnaAF (5'-GTGTATYTGTCGGTTTGGC-3')、dnaAR(5'-TNARYTCTTTWGAYARHGCC-3')和dnaNF (5'-CCDYTRRTRCARGTDTCDGGYGC-3')、dnaNR (5'-AYARDCGCATHGGCATSACNAC-3')，PCR扩增Y1 dnaA和dnaN基因片段，片段长度分别为1301和1124 bp，PCR反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35个循环，72℃延伸7 min。将扩增得到的PCR产物送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序，获得的序列信息在GenBank中用Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行同源性比较，利用MEGA 5.0软件，采用邻位相连法(Neighbor-Joining)构建系统进化树(Bootstrap=1000)。

培养温度分别设置为8℃、15℃、18℃和22℃，检测温度对绿斑病发病的影响；条斑紫菜密度分别设置为0.05 g/100 ml、0.1 g/100 ml和0.2 g/100 ml，检测紫菜养殖密度对绿斑病发病的影响；用无菌超纯水调节海水比重为1.019、1.022和1.025(相对应的海水盐度分别为24.5、29.1和32.7)，检测海水比重对绿斑病发病的影响。每个实验组设置3个平行，除变化的环境因子，其他培养条件：温度为18℃、密度为0.1 g/100 ml，海水比重为1.022。实验组分别加入终浓度为10⁸ CFU/ml的病原菌，对照组在同样条件下不加入病原菌培养。观察叶片的变化，并计算感染1周后病烂部分面积所占整个叶片面积的百分比和培养体系中细菌数量的变化。

条斑紫菜绿斑病发病部位多位于叶状体的中部和边缘，初期发病紫菜叶片出现红色小点，扩大后逐渐转变成灰绿色，在叶状体表面形成若干孔洞，叶片腐烂变绿(图 1A)。在2216E培养基上共分离得到5株优势菌，分别编号为Y1、Y2、Y3、Y4和Y5。

图 1(Fig. 1)

图 1 海区自然发病条斑紫菜(A)和人工感染发病条斑紫菜(B) Fig.1 Naturally infected P. yezoensis (A) in the sea area and experimentally infected P. yezoensis(B)

菌株Y1感染紫菜可以产生明显绿斑病症状(图 1B)，Y2、Y3、Y4和Y5各个浓度梯度感染的条斑紫菜均未观察到发病。Y1菌株10⁸ CFU/ml感染组紫菜在培养2 d后出现病症，10⁷ CFU/ml感染组在10 d出现病症。显微镜观察可见，在病斑形成位置，最初单个紫菜细胞发生明显变化，原生质浓缩，颜色由正常的紫褐色变为紫红色，细胞形状变成不规则状(图 2A)，进一步周围的细胞渐渐失去细胞正常结构(图 2B)，后期以这些病变细胞为中心，呈放射状蔓延(图 2C)，边缘的细胞颜色渐渐变绿并最终形成肉眼可见的病斑(图 2D)。条斑紫菜叶状体病变部分与健康部分区别明显，且病变部分细胞由于颜色不同可以清晰地分为多个不同状态的细胞层(图 2E、图 2F)。

图 1(Fig. 1)

图 2 人工感染条斑紫菜 Fig.2 Experimentally infected P. yezoensis A：单个紫菜细胞浓缩变色；B：多个紫菜细胞浓缩变色；C：初期形成的绿斑；D：叶片破碎形成孔洞；E和F：绿斑和正常细胞交界处细胞质颗粒降解的细胞层 A: Concentration and discoloration of Porphyra single cell; B: Concentration and discoloration of Porphyra cells; C: Early stage of green spot disease; D: Holes on laver; E and F: Cytoplasmic granules degradation at the junction of diseased and normal cells

革兰氏染色结果显示，Y1属于革兰氏阴性短杆菌。Vitek 2 GN鉴定结果显示，其丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶(APPA)、β-半乳糖苷酶(β-GAL)、脂酶(LIP)、酪氨酸芳胺酶(TyrA)、α-半乳糖苷酶(α-GAL)、磷酸酶(PHOS)以及ELLM反应为阳性，其他均为阴性。经ID-32E鉴定，α-葡萄糖(α-GLU)、α-麦芽糖苷酶(α-MAL)和L-天门冬素芳胺酶(ASPA)反应为阳性，其他反应为阴性。ATB系统分析结果显示，Y1为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)。

对Y1的16S rRNA、dnaA和dnaN基因进行扩增测序和GenBank比对，并构建系统发育进化树，结果显示，Y1的基因序列与海洋假交替单胞菌(Pseudoalteromonas marina)相似度均为99%~100%，且系统进化树与海洋假交替单胞菌聚为一支(图 3)，表明Y1与海洋假交替单胞菌进化关系最为相近，确定引起此次条斑紫菜绿斑病的病原为海洋假交替单胞菌。

图 1(Fig. 1)

图 3 Y1系统进化发育分析 Fig.3 Phylogenetic analysis of strain Y1 A:基于16S rRNA基因序列构建的系统发育进化树; B:基于dnaA序列构建的系统发育进化树; C:基于dnaN序列构建的系统发育进化树 A: Phylogenetic tree constructed for isolates based on 16S rRNA gene sequences; B: Phylogenetic tree constructed for isolates based on dnaA sequences; C: Phylogenetic tree constructed for isolates based on dnaN sequences

设置4个不同的感染温度，检测了温度对条斑紫菜绿斑病发病的影响。结果显示，在感染温度为18℃时，条斑紫菜发病最快，感染36 h后，可观察到红色斑点；感染温度为15℃和22℃时，感染48 h后出现症状；感染温度为8℃时发病较慢，感染72 h后出现1~2个很小的斑点。除22℃高温组，各组的对照组在整个实验过程中未观察到明显病烂症状。感染培养7 d后，除8℃组仅有几个斑点外，其余各实验组叶状体均可见多个病烂区，并伴有组织脱落。各实验组叶状体病烂部分面积所占总面积的比例如图 4A所示，当感染温度为22℃时，叶状体病烂最严重，几乎看不到正常的叶片部分。

图 1(Fig. 1)

图 4 环境因子对条斑紫菜绿斑病发病的影响 Fig.4 Effects of environmental factors on green spot disease of P. yezoensis

设置3个不同的养殖密度，检测了密度对条斑紫菜绿斑病发病的影响。低密度条件下病烂部分最少，随着养殖密度的增大，病烂程度有所加剧。感染72 h后，0.2 g/100 ml组出现多个明显的病斑，0.1 g/100 ml组仅出现1~2个病斑，0.05 g/100 ml组没有出现病斑。感染7 d后，各组都出现严重病烂。经计算，各实验组叶状体病烂部分面积所占总面积的比例如图 4B所示，0.05 g/100 ml实验组病烂面积最小，约45%的叶片出现病烂；0.1 g/100 ml组与0.2 g/100 ml组病烂面积较大，超过60%的叶片出现病烂。

设置3个不同比重的海水，检测海水比重对条斑紫菜绿斑病发病的影响。正常海水比重组叶状体(1.022)在感染2 d后出现红色斑点，7 d后明显病烂；低海水比重组(1.019)和高海水比重组(1.025)分别在感染4 d和5 d之后，出现红色斑点，且发生病烂的面积较小。7 d后，各实验组叶状体病烂部分面积所占总面积的比例如图 4C所示，1.019低海水比重组和1.025高海水比重组海水都能一定程度上延缓病情的发生进展。

绿斑病是紫菜栽培过程中的常见疾病，在整个紫菜栽培期都可能发生，但以每年11、12月份最为严重(丁怀宇, 2008)。绿斑病多发生于栽培密度较大的海区，尤其是在高温后极易发生，病变的部位不定，在条斑紫菜叶状体的梢部、中部、基部、中央和边缘部位均可出现病斑。绿斑病一旦发生，传染的速度极快，病斑可在短时间内连成一片，并迅速变绿，在适宜条件下，藻体1周即可全部溃烂，严重时，网帘上紫菜完全脱落。绿斑病会使紫菜表面粗糙、无光泽，影响其商品价值。2013~2014年，韩国舒川郡紫菜养殖场绿斑病爆发造成110万美元的损失，相当于总销售额的10.7%(Kim et al, 2014)。

1968年绿斑病在日本首次发现，其病原较为广泛，从患病紫菜中可以分离出微球菌(Micrococcis sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)以及弧菌(Vibrio sp.)(Nakao et al, 1972)，中国已报道柠檬假交替单胞菌(Pseudoalteromonas citrea)引起的条斑紫菜绿斑病(闫咏等, 2002)，本实验室在前期研究中发现弧菌也可以引起坛紫菜(Pyropia haitanensis)绿斑病(韩晓娟等, 2015)。目前报道的绿斑病病原菌大部分具有较强的胞外酶活性，这些胞外酶导致的宿主损伤可能是引起紫菜叶片绿斑的重要原因。近年来研究发现，叶绿体病毒(Chloroplast virus)也可以引起条斑紫菜绿斑病的发生(Kim et al, 2016)。

绿斑病只是一种表观特征，多种因素造成的藻体破坏、藻红素溶出，均可呈现绿斑病症状。海水温度异常升高、降雨或有机质污染引起藻体代谢失常都可能引起紫菜绿斑病(Gachon et al, 2010)，但环境胁迫条件下导致的附生微生物菌群失控是引起紫菜病烂的主要因素(Egan et al, 2016)。通过环境因子实验结果，发现高温、高密度养殖是引起紫菜绿斑病发生的主要因子，而海水比重的变化在一定程度上可以减缓病烂速度，这也与海区栽培情况相印证。每年11、12月份，海区紫菜进入快速生长期，此时网帘上紫菜密度较大，为致病菌提供了丰富的营养和良好的环境。在正常养殖条件下，条件致病菌数量一般维持在一定范围内，不具备致病力。当出现升温或降雨等环境变化，条件致病菌的致病性可能增强，造成紫菜绿斑病的发生。合理控制养殖密度，及时疏苗，密切注意水温等气象环境的变化，充足的干出以改变紫菜表面海水比重等方法可以有效抑制绿斑病的发生。

本研究通过人工回接感染实验、细菌生理生化和基因序列分析，发现海洋假交替单胞菌可以引起条斑紫菜的绿斑病，养殖密度、温度和海水比重等环境因子会影响绿斑病的发病进程，其具体感染和致病机制有待进一步深入研究。