刀鲚(Coilia ectenes)隶属于鲱形目(Clupeiformes)、鳀科(Engraulidae)、鲚属(Coilia)，又名长颌鲚，俗称刀鱼、毛刀鱼，主要分布于我国黄渤海、东海海域及通海的江河，其中，又以长江下游的产量最高，因其鱼体丰腴肥满、肉质细嫩鲜美而享有“长江三鲜”之首的美誉(施永海等, 2014、2015; 邓平平等, 2014)。历史上，我国刀鲚的种质资源极为丰富。然而，近年来，由于酷捕滥渔、水域环境污染、水文条件改变、生态环境恶化及海岸工程建设等诸多因素，长江刀鲚自然种质资源急剧衰退，产量波动很大，且呈现出逐年降低且个体日趋小型化的趋势，甚至不能形成优势种群(施永海等, 2014、2015; 魏广莲等, 2013; 袁传宓, 1988)，亟需对刀鲚的种质资源进行保护和恢复。而刀鲚基因组信息匮乏、遗传背景不清晰、繁殖周期较长等问题亦在一定程度上制约了其种质资源的开发和恢复。刀鲚种质资源的有效保护和恢复，除了政府相关部门采取相关行政干预(建立禁渔期、加强捕捞监管、适时增殖放流等)之外，还需相关部门适时地监测洄游型刀鲚的遗传多样性，从整体上把握刀鲚野生群体的遗传多样性水平和遗传背景，同时加快刀鲚良种的选育进程，特别是分子标记辅助良种选育的研究。
分子标记由于能够对动物整个基因组的遗传变异进行探究，且相对稳定，而被应用于水产动物的遗传育种研究，其中，微卫星标记(Microsatellite)的应用最为广泛。微卫星标记，又称为简单重复序列(Simple sequence repeat, SSR)，是指由1~6个核苷酸组成的简单串联重复序列，这些序列的重复单位和重复次数的差异使其具有高度变异性和多态性，被广泛应用于水产动物种质资源评估和鉴定、遗传图谱的构建及分子标记辅助育种等方面(杨铭等, 2017; 管奥等, 2018; 白翠翠等, 2016)。近年来，学者利用线粒体基因D-loop(张燕萍等, 2017; Cheng et al, 2011)、线粒体Cytb (魏广莲等, 2012; Ma et al, 2010)、RAPD (马春艳等, 2004)、AFLP(葛家春等, 2008)等方法研究了刀鲚不同群体的遗传结构和遗传差异，而对刀鲚微卫星标记开发的报道相对较少。Rong等(2013)利用FIASO法构建了微卫星富集文库方法，从89对刀鲚微卫星引物中获得了20对多态性微卫星标记。马春燕等(2011)利用FIASO法构建微卫星富集文库的方法，从70对刀鲚微卫星引物中获得了12对多态性微卫星标记。陈芳等(2012)利用磁珠富集法，从198对刀鲚微卫星引物中获得了34对多态性微卫星标记。邓平平等(2014)利用磁珠富集法，从59对刀鲚微卫星引物中获得了9对多态性微卫星标记。利用磁珠富集法从水产动物基因组中开发的微卫星标记，多态性相对较高，但相对费时费力，效率相对较低，且标记大规模的开发成本相对较高，远远不能满足刀鲚高密度遗传图谱的构建、QTL精细定位和分子标记辅助育种等对分子标记需求量较大的研究，亟需大规模开发分子标记。而高通量转录组测序技术所开发的微卫星，又被称为表达序列标签SSR (Expressed sequence tag SSR, EST-SSR)，其多态性虽然相对低于基因组所开发的微卫星(G-SSR)，但由于数量多、通量大、周期短、成本低，且直接与某些功能基因相关联(李东明等, 2017)，而被广泛应用于水产动物分子标记大规模的开发研究。
本研究基于刀鲚肌肉和肝脏的高通量转录组数据，对长江刀鲚转录组中的微卫星位点进行筛选，分析刀鲚EST-SSR的序列特征、分布和组成等信息，并利用所筛选的多态性微卫星标记对长江刀鲚选育群体(F3)的遗传学特征进行初步评估，以期能够为刀鲚遗传多样性的分析、种质资源的保护和利用、高密度遗传连锁图谱的构建及分子标记辅助良种选育奠定基础。
1 材料与方法 1.1 实验材料与数据来源实验所用长江刀鲚来自于上海市水产研究所核心选育群体(F3)的2龄刀鲚，提取刀鲚肌肉和肝脏的RNA后，构建高通量转录组测序文库，利用Illumina HiSeq4000进行高通量转录组测序。刀鲚肌肉和肝脏的转录组测序总共获得28.20 Gb的数据量，原始测序数据经Trinity软件(http://trinityrnaseq.sourceforge.net/)组装并去冗余后，获得平均长度为932.49 bp的Unigenes 71869条，N50达到1364 bp，质量不低于20的碱基比例(Q20)为97.31%，表明测序结果良好(未发表)。
1.2 EST-SSR的筛查以刀鲚转录组中的Unigenes作为参考序列，利用MISA(MIcroSAtellite identification tool)软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)搜索刀鲚肝脏和肌肉转录组中的SSR位点，其中，单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最少重复次数分别设置10、6、5、5、5和5。复合SSR两个位点间最大间隔碱基数设置为100。
1.3 EST-SSR多态性引物的设计、筛选和初步验证利用Primer Premier 3.0软件对筛选出的微卫星序列批量设计引物，主要设置参数为：引物长度和PCR产物分别为18~25 bp和100~500 bp，55℃≤退火温度(Tm)≤65℃，40%≤GC含量≤60%，上下游引物的Tm≤2℃。考虑到四碱基重复的微卫星标记相对二碱基重复和三碱基重复具有较长的演化历史和更加稳定的突变积累，本研究随机选取100对基于四核苷酸重复微卫星序列所设计的PCR扩增引物交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并以刀鲚核心选育群体(F3)为实验材料筛选具有多态性的微卫星引物。PCR扩增产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后，利用银染法显色定影，条带显色清晰后用数码相机拍照保存，进行微卫星引物后续的多态性分析。利用GenAlEx 6.0软件(Peakall et al, 2006)计算长江刀鲚选育群体的有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Shannon多样性指数(I)等遗传多样性参数。参照Bostein等(1980)的计算公式计算多态信息含量(Polymorphism information content, PIC)：
| $ \operatorname{PIC} = 1 - \mathop \sum \limits_{i = 1}^n p_i^2 - \mathop \sum \limits_{i = 1}^{n - 1} \mathop \sum \limits_{j = i + 1}^n 2p_i^2p_j^2 $ |
式中，Pi、Pj分别为群体中第i、j个等位基因频率，n为等位基因数。
2 结果 2.1 刀鲚转录组中EST-SSR位点的数量与分布利用MISA软件挖掘刀鲚转录组中的EST-SSR标记(搜索结果见表 1)。从刀鲚71869条Unigenes中共获得33896个SSR位点，占所评估序列总数目的47.16%；22463条Unigenes包含SSR位点，占总Unigenes的31.25%；含有1个以上的SSR位点的Unigenes有7701个，约占总Unigenes的10.71%；具有复合型SSR位点的Unigenes有2989个，约占总Unigenes的4.16%(表 1)。
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表 1 刀鲚转录组中EST-SSR位点的搜索结果 Tab.1 EST-SSR search results in the transcriptome of C. ectenes |
基于微卫星重复单元的类型和重复次数，将不同的SSR位点进行分类(表 2)。结果显示，从单核苷酸重复SSR到六核苷酸重复SSR在刀鲚转录组中均有分布，但数量分布上具有不同程度的差异。其中，二核苷酸重复SSR数量最多，占SSR位点总数的49.47%；单核苷酸重复SSR数量次之，占SSR位点总数的34.94%；三核苷酸重复SSR的数量亦较为丰富，占SSR总位点数的13.34%；四核苷酸重复SSR的数量相对较少，占SSR总位点数的2.11%；五核苷酸和六核苷酸重复SSR的数量最少，分别占SSR总位点数的0.09%和0.06%。
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表 2 刀鲚转录组中EST-SSR的主要重复基序的类型和数量 Tab.2 The type and number of main repeat motif of EST-SSR in the transcriptome of C. ectenes |
此外，刀鲚转录组EST-SSR中共有94种核苷酸重复基序，主要核苷酸重复基序亦有不同类型的优势重复基序。其中，单核苷酸重复SSR的优势重复基序为A/T，占86.25%，这可能与Poly A被纳入计算结果有关；二核苷酸重复SSR的优势重复基序为AC/GT，占75.25%；三核苷酸重复SSR的优势重复基序为AGC/CTG和AGG/CCT，分别占27.16%和28.57%；四核苷酸重复SSR的优势重复基序为AAAC/GTTT和ACAG/CTGT，分别占17.51%和16.81%。
2.3 刀鲚EST-SSR不同基序重复次数分布刀鲚SSR主要重复基序的重复次数的分布情况见表 3。刀鲚SSR基序的重复次数大部分为5~24次，其他重复次数相对较少，仅ATC/ATG出现了45次重复。低重复次数(5~9次重复)的SSR位点最多，约占61.21%；中等重复次数(10~11次重复)的SSR位点次之，约占22.84%；而 > 11次重复的SSR位点仅占15.95%。其中，单核苷酸基序重复次数均≥10，且重复11次以上的最多，占45.60%；二核苷酸基序以低重复次数为主，占92.26%，重复11次以上的较少，仅占0.02%；三核苷酸至六核苷酸基序均以重复次数为5的最多，其余重复次数的重复基序相对较少。
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表 3 刀鲚转录组主要EST-SSR重复基序的重复次数 Tab.3 The repeat number of main repeat motif of EST-SSR in the transcriptome of C. ectenes |
以本单位核心选育群体F3随机选择的30尾鱼苗的基因组DNA为模板，针对100对四核苷酸重复SSR位点的引物进行多态性检验，最终筛选到16对具有多态性的微卫星引物(表 4)。
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表 4 刀鲚多态性微卫星引物 Tab.4 Polymorphic SSR primers of C. ectenes |
基于16对经筛选获得的多态性微卫星标记，对长江刀鲚核心选育群体(F3)进行遗传多样性评估(表 5)。结果显示，长江刀鲚核心选育群体(F3)的平均有效等位基因数(Ne)、平均观测杂合度(Ho)、平均期望杂合度(He)和Shannon信息指数(I)分别为1.7580、0.3414、0.3977和0.6278。基于等位基因频率计算不同位点的多态信息含量，结果显示，16对多态性微卫星标记中，有2对属于高度多态，10对属于中度多态，4对属于低度多态。可见，基于刀鲚转录组开发的多态性EST-SSR能够应用于刀鲚选育群体的种质资源评估，具有较高实用性。
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表 5 16个微卫星标记的遗传参数 Tab.5 Genetic parameters at 16 microsatellite markers |
微卫星分子标记在动物进化过程中，由于DNA分子的复制、缺失、滑移或错配及姐妹染色单体的不均交换等原因而具有高度变异性，被广泛应用于水产动物群体遗传结构分析(滕爽爽等, 2018)、亲子鉴定(张丹等, 2018)、遗传图谱构建(郭香等, 2013)、数量性状定位(顾颖等, 2016)和分子标记辅助育种(孙际佳等, 2017; 顾颖等, 2016)等方面的研究。对于具有基因组信息的物种而言，微卫星标记的大规模开发相对方便；而对于目前还没有基因组信息的物种，则可利用高通量转录组测序技术大规模开发微卫星标记。刀鲚作为我国具有较高经济、营养和养殖价值的江海洄游性鱼类，其基因组信息、转录组信息及可用分子标记资源均极为匮乏，有鉴于全基因组测序的成本相对较高，因此，亟需开展刀鲚的转录学研究以获得大量的可用分子标记。此外，我国长江流域的刀鲚产量最为丰富，相应的野生群体遗传多样性较高和资源分布较广，是开展刀鲚遗传育种研究的理想种质资源库。而本研究的刀鲚最初的繁育亲本为长江流域的野生群体，历经3代高强度的人工选育，亟需适时地利用合适的分子标记检测其遗传变异情况，以制定科学有效的育种策略。
本研究基于刀鲚转录组数据，利用生物信息学方法挖掘刀鲚EST-SSR，获得了33896条刀鲚EST-SSR，这些EST-SSR的种类较为丰富，且1~6核苷酸重复基序均有不同程度的分布。其中，以出现频率为49.47%的二核苷酸重复基序为主，其次是单核苷酸重复基序(34.94%)，三核苷酸重复基序亦较为丰富，占13.34%，其他类型的核苷酸重复基序相对较少。蔡磊等(2015)研究表明，多数物种EST-SSR中的重复基序均以二核苷酸重复基序为主，这与本研究结果一致；而其余类型的优势重复基序则有较大的差异，这可能与不同物种转录组文库构建的组织来源、不同物种的种间特异性、位点突变频率及选择性进化机制有关。在刀鲚所有EST-SSR中，不同的核苷酸重复基序具有不同的重复次数，其中，单核苷酸重复基序大部分属于中高等重复次数，其余类型重复基序的大部分重复次数在5~9之间，相对低于其他鱼类基因组中的微卫星重复次数，可能与编码区和非编码区所受到的选择压力差异有关。不同重复基序的碱基优势重复类型表现出不同程度的偏倚性，单核苷酸重复基序以A/T类型为主，可能是由于富含A/T的微卫星退火温度相对较低，利于双链DNA的解链，通过DNA复制的重组和滑动机制而增加A/T重复基序的机率(倪守胜等, 2018)。而二核苷酸重复基序以AC/GT为主，这与鱼类基因组微卫星中以AC/GT重复为主相符；其余重复基序的优势重复碱基类型在不同物种间差异极大，可能与不同物种的种间差异性有关。此外，本研究发现，刀鲚EST-SSR重复单元的拷贝次数随着重复单元长度的增加而下降，微卫星的数量亦呈现出逐步减少的趋势。
近年来，相关学者在鱼类中利用高通量转录组测序技术陆续开发出了多态性较高的微卫星标记。蔡磊等(2015)利用高通量转录组测序技术从诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobius chulae)肝脏转录组中获得6225个微卫星位点，并从76对引物中筛选获得32对具有多态性的微卫星标记。龚诗琦等(2016)利用高通量转录组测序技术从黄姑鱼(Nibea albiflora)转录组获得12254个微卫星标记，并从80对引物中筛选获得18个具有多态性的微卫星标记。岳华梅等(2016)利用高通量转录组测序技术从兴国红鲤(Cyprinus carpio var. singuonensis)的垂体和性腺转录组中获得13652个微卫星标记，并从30对引物中筛选获得了9个具有多态性的微卫星标记。本研究从100对四碱基重复的微卫星引物中筛选获得了16对具有多态性的微卫星标记，引物多态率相对低于其他鱼类的研究结果。造成多态性较低的原因，一方面是由于本研究选取的四碱基重复的微卫星相对于二碱基和三碱基重复的微卫星比较保守，且变异率低；另一方面是由于基于转录所获得的EST-SSR扩增产物可能跨越内含子或者PCR引物位于内含子和外显子的结合处，而造成扩增失败导致多态率较低。此外，筛选多态性引物所用样本的种类、数量、遗传差异程度以及不同物种的DNA序列的保守性对于微卫星位点多态性的筛选亦有不同程度的影响。
基于Botstein等(1980)对于多态信息含量(PIC)的评估标准，当PIC > 0.5、0.25 < PIC > 0.5、PIC < 0.25时分别代表高度多态、中度多态和低度多态性。Rong等(2013)利用FIASCO法所开发的微卫星标记大部分为高度多态(70%)，中度多态占25%，而本研究所获得的多态性微卫星标记则大部分属于中度多态(62.5%)，高度多态仅占12.5%，表明不同的微卫星开发方法所获得的位点多态性有所不同，而实验样本的来源、数量和位点的核苷酸的重复基序、次数的不同位点多态性亦有不同程度的影响。杂合度作为度量群体遗传变异的重要参考指标，能够有效反映出群体遗传变异程度的高低。在本研究中，基于刀鲚多态性EST-SSR所获得的刀鲚选育群体(F3)的平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)分别为0.3414和0.3977，低于Rong等(2013)(Ho=0.49, He=0.68)、Ma等(2011)(Ho=0.675, He=0.650)、Chen等(2012)(Ho=0.53, He=0.77)利用磁珠富集法所获的G-SSR的研究结果。究其原因，一方面是由于本研究选用的四核苷酸重复微卫星序列在动物进化过程中相对保守，相对磁珠富集法所获得的二核苷酸多态性和变异率较低，另一方面，本研究所选用的实验样本经过了3代高强度的人工选育，而其他研究样本大部分为野生群体。总体而言，基于转录组所获得的EST-SSR多态性虽然相对低于基于基因组所获得的G-SSR，但仍然能够有效区分个体或者群体的遗传差异，加上所开发的微卫星数量相对较多，具有相对较高的实用性。
本研究利用生物信息学方法筛选刀鲚高通量转录组Unigenes中的微卫星标记，分析刀鲚EST-SSR分布和组成特征，并利用所开发的多态性微卫星标记初步分析了刀鲚核心选育群体(F3)的遗传特征。研究结果不仅丰富了刀鲚分子标记的数量，而且对刀鲚后续选育群体的育种效果评估及分子标记辅助育种实践具有重要的指导意义。
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