耳石(Otolith)是位于硬骨鱼类内耳膜迷路内的一种碳酸钙结晶体，主要成分为碳酸钙和有机质。鱼类耳石中碳、氧稳定同位素(δ¹³C和δ¹⁸O)成分具有独特的性质，真实记录了鱼类所经历的生态环境的变化(Gao et al, 2003;高永文等, 2004)。其中，δ¹³C被证实与饵料的关系较为密切(Schwarcz et al, 1998)，而δ¹⁸O则被证实为与水温关系十分密切(Hoie et al, 2004;姜涛等, 2015;高永文等, 2011)。近年来，稳定同位素应用于鱼类研究中颇多，如鱼类的种群鉴别(Gao et al, 2010)和产卵场(Shiao et al, 2010)、索饵场的划分(Rooker et al, 2008)，以及深海鱼垂直迁移路径(Longmore et al, 2011; Lin et al, 2012)等。Gao等(1999)利用大马哈鱼(Oncorhynchus nerka)耳石中碳氧稳定同位素特征作为栖息地的指标来辨别鱼类种群。Thorrold等(2001)通过对不同海域的犬牙石鱼(Cynoscion regalis)耳石中稳定性同位素δ¹³C和δ¹⁸O的分析，确定了5个不同海域的犬牙石鱼出生地和资源群单元的差异，判别成功率达60%~81%。研究发现，加勒比海和地中海大西洋黑鲔(Thunnus thynnus)全耳石的δ¹⁸O有明显差异，地中海的大西洋黑鲔的耳石δ¹⁸O介于–1.08%与–1.30%之间，而加勒比海的大西洋黑鲔个体的耳石介于–2.09%与–2.39%之间，其判别率高达98%(Rooker et al, 2004)。因此，耳石中δ¹³C和δ¹⁸O可以反映鱼类的环境生活史，可以作为自然标记物探索鱼类种群的连通性和差异性，识别鱼类种群。

小黄鱼(Larimichthys polyactis)属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲈形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaendae)、黄鱼属(Larimichthys)，广泛分布于中国渤海、黄海和东海以及朝鲜半岛西岸海域，通常栖息于水域近底层，水深不超过100 m，具有明显的垂直移动现象(李建生等, 2009)，对温度和盐度适应范围较广(谢立峰等, 2006)。关于小黄鱼种群划分问题，从20世纪50年代至今一直存在争议，熊瑛等(2018)总结了鱼类种群划分方法在小黄鱼种群研究上的应用，并探讨了这些方法各自的可靠性和局限性。以往的研究中，一些学者将我国近海小黄鱼划分为3个种群，即黄渤海种群、南黄海种群和东海种群(林新濯等, 1965;张秋华等, 2007;毛锡林等, 1987;叶昌臣, 1991;俞连福等, 2003;严利平等, 2014)；而另一些学者则认为东、黄、渤海小黄鱼还存在第4个种群，即黄海中部种群(刘效舜, 1990;赵传, 1990;金显仕等, 2005;唐启升, 2012)。徐兆礼等(2010)在前人研究的基础上，重新审视了我国近海小黄鱼种群的划分问题，提出中国近海小黄鱼仅存在2个种群，即黄海南部和东海小黄鱼种群及渤海和黄海北部小黄鱼种群；此外，王玉堃等(2016)对不同采样站位小黄鱼耳石元素含量进行分析，将黄、渤海小黄鱼早期补充群体划分为渤海种群、黄海中部种群和南黄海种群。

本研究对黄、渤海秋季小黄鱼补充群体耳石中δ¹³C和δ¹⁸O的值进行分析，探讨了我国黄、渤海小黄鱼的种群划分问题，以及其可能的生态学意义，以期为小黄鱼资源的保护和科学管理提供基础。

本研究的样品来自2006年9~10月中国水产科学研究院黄海水产研究所进行的秋季连续航次黄、渤海渔业资源底拖网调查，调查范围为119.39°~ 124.22°E、31.30°~39.06°N。本研究采用的小黄鱼样品共92尾，体长平均值为(120.14±18.02) mm，耳石重平均值为(73.45±24.92) mg，结合张国政等(2010)研究中当年生幼鱼体长体重关系，可以确定本研究所用小黄鱼样品均为当年生个体。样品共19个站位，如图 1所示。由于耳石保存时间较久，用30%双氧水浸泡2遍，再用刷子将耳石附着的有机组织清洗干净，最后用蒸馏水冲洗数遍，烘干称重，研磨成粉末，保存于离心管待后续测定。

图 1(Fig. 1)

图 1 小黄鱼样本采集站位 Fig.1 Sampling sites of L. polyactis

每个耳石称取2 mg样品于顶空瓶中，用带硅胶隔垫的盖子密封，通过离线吹扫用氦气排空反应瓶中的空气，消除其对δ¹³C、δ¹⁸O分析结果的影响。经吹扫处理后，通过向反应瓶中加入7滴浓磷酸，在72℃条件下反应1 h，磷酸与碳酸盐反应释放出的CO₂在高纯氦气的带动下在线除水，通过30 m的Poraplot Q色谱柱与其他杂质气体分离，分离后的CO₂直接进入Delta Plus稳定同位素质谱仪(Finnigan公司生产)进行δ¹³C、δ¹⁸O测定。碳氧稳定同位素比值用国际通用的δ值表示，按以下公式计算:

式中，X为¹³C或者¹⁸O，R(以国际标准的V-PDB为基准)为¹³C/¹²C或¹⁸O/¹⁶O者的比值。为保证实验结果的精度和准确度，将CO₂标准气体作为参考气。标准物质采用NBS19(δ¹³C：1.95‰；δ¹⁸O：–2.20‰)和IAEA-CO-8(δ¹³C：–5.80‰；δ¹⁸O：–22.70‰)。其中，碳氧的精确度分别为0.10‰和0.20‰。

以耳石中δ¹³C和δ¹⁸O为指标，对各站位每尾小黄鱼进行聚类分析。聚类方法为系统聚类法(Hierarchical Cluster)，以聚类分析的结果对其进行判别分析，得出其判别成功率。对各种群之间小黄鱼耳石中δ¹³C和δ¹⁸O比值进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，采用SNK (Student-Newman-Keuls)检验，分析种群之间是否存在显著性差异(P < 0.05)。所有数据分析均采用SPSS 21.0完成。

以各站位每尾小黄鱼左矢耳石中δ¹³C和δ¹⁸O的值作为变量，对全部92尾小黄鱼进行系统聚类，得出树状图(图 2)。92尾小黄鱼被分成4类，树状图从左到右的4类记为1、2、3和4类。其中，聚类结果显示，92尾小黄鱼先单独聚类出第4类，且显示与其他类没有站位交叉现象，接着又聚类出第3类，最后聚类出第1类和第2类，总体聚类结果明显。

图 1(Fig. 1)

图 2 小黄鱼耳石δ13C和δ18O的聚类分析 Fig.2 Cluster analysis tree diagram of δ13C and δ18O in otolith of L. polyactis

根据该聚类结果，基于92尾小黄鱼耳石δ¹³C和δ¹⁸O指标绘制散点分布图。由图 3可知，92尾小黄鱼被分成明显的4类。其中，第1类包含主要站位为S1、S2、S3、S4和S5；第2类包含主要站位为S6、S7、S8、S9和S10；第3类包含主要站位为S11、S13、S14、S15和S16；第4类只包含站位S12、S17、S18和S19。结果显示，第4类与其他3类没有显著的站位交叉现象。

图 1(Fig. 1)

图 3 基于δ13C和δ18O指标对所有小黄鱼的聚类分析 Fig.3 Cluster analysis of all L. polyactis based on δ13C and δ18O 1：主要站位S1、S2、S3、S4和S5；2：主要站位 S6、S7、S8、S9和S10；3：主要站位S11、S13、S14、S15和S16；4：站位S12、S17、S18和S19 1: Main sites: S1, S2, S3 and S4, S5; 2: Main sites: S6, S7, S8 and S9, S10; 3: Main sites: S11, S13, S14, S15 and S16; 4: Sites: S12, S17, S18 and S19

对聚类结果进行判别分析，结果如表 1所示。由表 1可知，种群1共29尾小黄鱼，其中22尾进行正确聚类，其判别成功率为75.9%；种群2共20尾小黄鱼，其中16尾进行正确聚类，其判别成功率为80.0%；种群3共21尾小黄鱼，其中17尾进行正确聚类，其判别成功率为81.0%；种群4共22尾小黄鱼，其中21尾进行正确聚类，其判别成功率为95.5%。总体的判别成功率为82.6%。

表 1(Tab.1)

表 1 不同种群小黄鱼的判别结果 Tab.1 The classification results of different populations of L. polyactis 实际种群 Actual population 预测种群 Forecast population 合计 Total 正确率Accuracy (%) 1 2 3 4 1 22 6 1 0 29 75.9 2 3 16 1 0 20 80.0 3 2 2 17 0 21 81.0 4 0 1 0 21 22 95.5 注：已对所有小黄鱼样品中的82.6%进行了正确分类 Note: 82.6% of all L. polyactis samples have been correctly classified

表 1 不同种群小黄鱼的判别结果 Tab.1 The classification results of different populations of L. polyactis

根据聚类结果，对小黄鱼耳石中δ¹³C和δ¹⁸O的值采用SNK(Student-Newman-Keuls)方法进行单因素方差分析(表 2和表 3)。结果显示，第1类和第4类的δ¹³C没有显著性差异(P > 0.05)，第3类与第2类的δ¹³C也没有显著性差异(P > 0.05)，但前2类的δ¹³C与后2类之间存在显著性差异(P < 0.05)；而4个类别的δ¹⁸O相互之间存在显著性差异(P < 0.05)。由此可见，耳石中δ¹⁸O比δ¹³C具有更高的辨识度。

表 2(Tab.2)

表 2 不同种群小黄鱼δ13C的差异 Tab.2 The δ13C difference of different populations of L. polyactis 类别 Classification 数量 Number 子集Subset 1 2 1 32 –1.295a 4 15 –1.212a 3 19 –0.628b 2 26 –0.594b 注：子集中数字上字母相同，表示组间差异不显著(P > 0.05)，下同 Note: The number with the same letters in the subgroup do not show significant difference between the groups. (P > 0.05). The same as below

表 2 不同种群小黄鱼δ13C的差异 Tab.2 The δ13C difference of different populations of L. polyactis

表 3(Tab.3)

表 3 不同种群小黄鱼δ18O的差异 Tab.3 The δ18O difference of different populations of L. polyactis 类别 Classification 数量 Number 子集Subset 1 2 3 4 4 15 –1.675a 2 26 –0.685b 1 32 –0.135c 3 19 0.670d

表 3 不同种群小黄鱼δ18O的差异 Tab.3 The δ18O difference of different populations of L. polyactis

根据聚类结果，对19个站位划分出来的4个种群绘制种群划分区域图(图 4)。由图 4可知，S1、S2、S3、S4和S5站位聚为一类，该类位于渤海与黄海北部，将其定义为渤海黄海北部种群；S6、S7、S8、S9和S10站位聚为一类，该类位于黄海中部，将其定义为黄海中部种群；S11、S13、S14、S15和S16站位聚为一类，该类位于黄海南部深海区，且离陆地较远，将其定义为黄海南部离岸种群；S12、S17、S18和S19站位聚为一类，该类位于黄海南部沿岸海域，将其定义为黄海南部沿岸种群。黄海南部2个种群进行聚类分析时，2个种群间没有站位交叉现象。

图 1(Fig. 1)

图 4 不同站位小黄鱼种群划分区域 Fig.4 The population division of L. polyactis at different sites

鱼类耳石中δ¹³C受多种因素的影响，如食物来源、新陈代谢速率和溶解的无机碳(DIC)等。食物中δ¹³C主要与捕获物中δ¹³C有关，随着捕获物的年龄不同，不同生长阶段的代谢速率和温度不同，其δ¹³C也相对变化(Jamieson et al, 2004; Sherwood et al, 2003)。研究表明，盐度和δ¹³C之间存在显著的正相关关系(Bastow et al, 2002; Richard et al, 2012)。Gao等(1999)研究发现，随着大马哈鱼从淡水迁移到海水中，从耳石核心到边缘处，δ¹³C逐渐增加。本研究结果中，δ¹³C比值黄海南部离岸种群最高，渤海黄海北部种群最低。渤海黄海北部种群的站位多数位于沿岸和捕捞区，由于人类活动对沿岸海域鱼类的过度捕捞和环境污染，导致沿岸小黄鱼食物链破坏和物种丰富度降低，故渤海与黄海北部的δ¹³C低；黄海南部离岸种群的站位位于外海，受人类活动干扰小，可能富含DIC或者食物种类丰富，故其δ¹³C高。而S17、S18和S19站位位于长江口附近，由于长江口冲淡水的作用，内陆淡水汇入外海海区，造成低盐环境，因此，位于长江口附近的黄海南部沿岸种群δ¹³C比值不高，与前人研究结果相一致(Bastow et al, 2002)。因此，随着不同地理区域的水文特征和食物来源的不同，根据δ¹³C进行种群划分的方法是可行的。鱼类耳石中δ¹⁸O与周围水体环境相平衡，可以反映水体环境的温度变化(Hoie et al, 2004;姜涛等, 2015;高永文等, 2011)。本研究采用的是全耳石，反映的是鱼类整个生命周期的生境信息，而鱼类整个生命周期的温度变化则可以通过耳石核心到边缘处的δ¹⁸O分布情况来反映。本研究将黄、渤海19个站位的小黄鱼划分为4个种群，倘若邻近站位的δ¹⁸O相似，并不能直接证明这些站位之间鱼类存在混合，也有可能这些站位本身就具有相似的理化环境；相反，倘若不同站位的δ¹⁸O不同，则可认为这些站位的鱼类经历了不同的生活环境，不存在充分的混合现象。如图 3所示，不同地理种群的小黄鱼δ¹⁸O不同且存在显著性(P < 0.05)差异，说明δ¹⁸O指示其特定的生活环境没有混合现象。

研究发现，耳石中δ¹³C和δ¹⁸O的关联分析能有效区分四川裂腹鱼不同养殖年龄群体，可作为一种识别淡水鱼类养殖群体的手段(何勇凤等, 2017)；高永文等(2011)以海鱼和洄游鱼的具体研究为例，也说明了δ¹³C和δ¹⁸O的关联分析在鱼群识别方面发挥着独特的作用；Wang等(2016)应用不同站位小黄鱼耳石中δ¹³C和δ¹⁸O比值差异，将黄、渤海小黄鱼种群划分为渤海种群、黄海中部种群和黄海南部种群。故本研究基于耳石δ¹³C和δ¹⁸O划分黄、渤海秋季小黄鱼补充群体的方法是可行的，而且本研究中对每尾小黄鱼样品进行了分类，实验操作简洁有效，所得结果也更详细说明了种群划分的问题，对海洋鱼类种群划分方法加以完善。

关于我国近海小黄鱼种群的划分一直存在较大分歧，然而，不同种群之间由于生物遗传、进化和种间关系彼此分离，形成生殖隔离和地理隔离，只有了解种群结构才有利于鱼类资源的合理利用和渔业的可持续发展。对于海洋鱼类而言，其并非均匀地分布在物种分布区，而是形成一些被隔离的、相对独立的群体，这种群体是鱼类生存和活动的单位，即种群(Shen et al, 2002)。叶昌臣(1991)研究发现，小黄鱼产卵后分散在渤海、黄海及东海北部各个索饵场进行索饵，且8~11月渤海与黄海小黄鱼饵料组成丰富，摄食强度较高。本研究所取用的19个站位小黄鱼样品处于索饵阶段，且均为当年生个体，分析了各站位每尾小黄鱼左矢耳石中δ¹³C和δ¹⁸O的值，根据其差异性将黄、渤海秋季小黄鱼早期补充群体划分为4个种群，即渤海黄海北部种群、黄海中部种群、黄海南部离岸种群和黄海南部沿岸种群，此结果与以往研究有所差异。王玉堃等(2016)对不同采样站位小黄鱼耳石元素含量的平均值进行聚类分析，将黄、渤海小黄鱼早期补充群体划分为渤海种群、黄海中部种群和南黄海种群。可以看出，本研究通过对每个站位每尾小黄鱼耳石样品中δ¹³C和δ¹⁸O的值进行聚类分析，结果显示，王玉堃等(2016)研究中的南黄海种群在本研究中被进一步细分为黄海南部离岸种群和黄海南部沿岸种群，这也进一步证明了本研究方法更加详细、精确。本研究中由图 2聚类的先后顺序，把黄、渤海19个站位的小黄鱼划分为了黄海南部沿岸种群、黄海南部离岸种群、黄海中部种群和渤海黄海北部种群，且4个种群聚类结果明显，黄海南部2个种群之间没有站位交叉现象。根据种群划分结果，绘制了如图 4的种群划分区域图。除了图 4中划分的4个区域外，其他海域也可能有小黄鱼出现的情况。由于在出海资源调查时，可能因为某些因素没有捕到或者记录在案，导致后面数据统计时，以为这部分海域没有小黄鱼，例如：S11、S13、S14、S15、S16站位所属的黄海南部离岸种群，该海域北部一些海域显示没有小黄鱼，但实际情况可能该海域有小黄鱼出现的站位，只是调查时没有捕到，所以在图 4中没有对该海域进行特定划分。

综上所述，本研究将黄、渤海秋季小黄鱼早期补充群体划分为渤海黄海北部种群、黄海中部种群、黄海南部离岸种群和黄海南部沿岸种群，首次把黄海南部小黄鱼群体细分为了黄海南部离岸种群和黄海南部沿岸种群，且2种群之间很少有站位交叉现象。