日本米虾(Caridina japonica)，又称大和藻虾、珍珠虾，隶属于软甲纲(Malacostraca)，十足目(Decapoda)，匙指虾科(Atyidae)，米虾属(Caridina)。其习性温和，体色透明，喜食藻类和有机碎屑，具有洄游习性，对盐度适应性强，易于饲养，常作为水族箱中的“清道夫”以及生态学与环境学研究的实验材料(Tlusty, 2002; 赵朝阳等, 2012; 高淑娇, 2012; 蔡生力等, 2006; 李帆, 2007)。近年来，日本米虾的市场需求量日益增加，价格逐年攀升，然而对其生物学的研究甚少。日本学者对此虾的洄游等生物学习性进行了初步的研究，发现盐度16.9，温度25℃为胚胎发育的适宜条件，其幼体经过9个时期发育成为仔虾(Hamano, 1992; Hayashi et al, 1984)。国内鲜有此虾的相关报道，而对于没有洄游习性、在淡水中繁殖的中华锯齿米虾(Neocaridina denticulata sinensis)生物学相关研究较多(薛俊增等, 1995; 孙世杰等, 2007)。这2种米虾胚胎发育等繁殖特性的差异有待进一步研究。

腹胚亚目的虾蟹类有抱卵习性，但在环境不适或受惊扰时会发生弃卵现象。一些人工繁殖的种类其亲体在抱卵过程中会发生死亡，造成一定的经济损失，因此，虾蟹类胚胎离体孵化技术研究具有重要的应用价值。阎斌伦(2002)的研究表明，虾蟹受精卵与亲体仅以刚毛连接，腹肢摆动保证发育过程中氧气充足，但没有营养上的联系。因此，在进行虾蟹类胚胎离体孵化时，研究者通常关注于水中的溶解氧，多采用充气的方法。迄今，已有关于日本沼虾(Macrobrachium nipponense)、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)等离体孵化的研究报道，但离体孵化的效果往往与胚胎离体的时间呈负相关(王吉桥等, 2006; 康现江等, 1996; 顾功超等, 1995)。也有研究者认为，水中微生物及死卵滋生的原生动物会影响离体胚胎的孵化率，尝试使用化学药物对胚胎及水体进行消毒处理，但这一方法有可能会对胚胎产生潜在的毒性，同时也会造成环境的污染(廖永岩等, 2001; 鲍鹰等, 1999)。如何能提高较早离体胚胎的孵化效果具有一定理论与应用意义。

日本米虾抱卵亲体在胚胎临近孵化的后期常出现弃卵现象，推测原因为胚胎发育不同步，部分幼体先孵出后刺激亲体去除剩卵。现阶段尚缺乏对日本米虾胚胎发育的系统报道，限制了对弃卵机理的深入研究，而弃卵如何再利用也是需要解决的问题。本研究用自制水产动物胚胎孵化装置对不同时期胚胎进行离体孵化，研究了日本米虾的胚胎发育特征及温度对其离体孵化效果的影响，以期为此种类繁殖生物学研究及甲壳动物胚胎离体孵化技术的优化提供参考。

1 材料与方法 1.1 材料

本研究于2017年2~4月在大连海洋大学实验室进行。日本米虾购于广州花地湾花鸟鱼虫批发市场，平均体长为(3.5±0.8) cm，平均体重为(4.9±0.9) g，经促熟培育至产卵。养殖容器为9.0 L玻璃鱼缸，配有温度计、50 W加热棒(闽江HK-50)、5 W水泵(森森JP-032)和气石等辅助装置。自制离体孵化装置见图 1。

1.2 方法 1.2.1 胚胎形态学观察

将抱卵亲虾挑出单独饲养。抱卵后，前3 d每隔6 h取卵1次，以后每24 h取卵1次，取卵时将抱卵亲虾置于表面皿中，用解剖针轻轻将胚胎从附肢上剥离，再将粘连的胚胎分开，并及时放入已经消毒的水中备用。每次随机取胚胎4~5个，4组平行。使用Nikon E100显微镜观察胚胎发育特征，测量胚径，并拍照，最后计算发育积温。发育积温计算公式(周洲等, 2015)为：

发育积温=胚胎发育天数×平均水温

1.2.2 胚胎离体孵化

离体孵化装置中的水泵将水抽入管道，管道上有小孔，水从小孔喷洒到孵化槽中的滤棉上，其上放置离体胚胎(图 1)。将卵裂期、囊胚期、原肠胚、前无节幼体期、后无节幼体期、前溞状幼体期和膜内溞状幼体期的胚胎分别置于离体孵化装置，每组置有100个胚胎，同时在孵化装置的玻璃缸中放入胚胎发育至相应时期的抱卵亲虾。孵化期间盐度为17.0±1.0，温度为(25.5±1.0)℃，每组重复5次。

1.2.3 温度对胚胎离体孵化的影响

设置15.0℃、18.5℃、22.0℃、25.5℃、29.0℃和32.5℃共6个温度组，盐度为17.0。每个温度组在实验时，于离体孵化装置中放入处于前溞状幼体期的胚胎100个，每组实验重复5次。

1.3 数据分析

实验数据使用SPSS 20进行单因素方差分析和Turkey多重比较计算各数据间的差异显著性，以P < 0.05作为显著差异判定条件。

2 结果 2.1 胚胎发育分期与形态特征

日本米虾产卵后由卵柄将卵粘在一起，抱于腹部。根据胚胎发育过程中形态学特征的变化，将胚胎发育过程分为受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠期、前无节幼体期、后无节幼体期、前溞状幼体期和膜内溞状幼体期8个时期，各个发育期主要形态特征见表 1。

受精卵(图 2A)：不规则椭圆形，呈深灰色，卵径为(0.48±0.03) mm×(0.28±0.01) mm，4~6 h后进入卵裂期。

卵裂期(图 2B、图 2C)：胚胎发育至卵裂期，呈深灰色，不透明。分裂过程中明显可见卵裂沟。新分裂的2个细胞中央颜色较深，充满整个胚胎内。卵裂期阶段持续约36 h。

囊胚期(图 2D)：产卵后42 h，胚胎发育进入囊胚期，此期胚胎边缘颜色变浅，中央颜色加深。胚径与受精卵相当。囊胚期胚胎内分化出大量小细胞，胚胎表面细胞呈多边形且排列紧密，形状如同桑葚。由于分裂的细胞较小，无法区分植物极、动物极与囊胚腔。

原肠期(图 2E)：产卵后96 h，胚胎发育进入原肠期，此时阴影区域外圈颜色变浅至半透明，中央颜色也略变浅，呈浅灰色。随着胚胎发育，透明区域扩大到整个胚胎的1/4后开始发育形成腹板。胚径明显增大，为(0.52±0.03) mm×(0.33±0.01) mm。胚体不断吸收利用卵黄，胚胎细胞继续分裂，细胞数量更多更加微小。胚胎的一端出现月牙状透明区域，为进入原肠期的重要标志。

前无节幼体期(图 2F)：产卵后192 h，胚胎发育进入前无节幼体期，该期仅持续24 h。此期胚胎一端的透明区域约占整个受精卵的1/3，阴影区域与透明区域相连接的位置出现凹陷，阴影区域颜色变浅，仅中央部分呈深灰色，其他部分均呈半透明。透明区域出现分节现象，将发育为幼体的腹部。阴影区域开始积累复眼色素，将发育为复眼。卵径略有增大，为(0.55±0.01) mm×(0.35±0.01) mm。

后无节幼体期(图 2G)：产卵后216 h进入后无节幼体期，此期胚胎卵黄继续缩小，透明区域继续扩大，约占胚胎的1/2。卵径与前无节幼体期相当。本期胚胎中出现明显可见的黑色复眼，为胚胎进入后无节幼体期的重要标志。胚胎腹部透明区域隐约出现1个棒状结构，未来发育成肠道，出现5对附肢，但不分节。约48 h后，头部及胸部出现分化，腹部分节进一步明显，附肢及肠道进一步分化，附肢数目增加为7对。

前溞状幼体期(图 2H)：胚胎发育288 h进入前溞状幼体期，由于卵黄持续减少，胚胎颜色进一步变浅，几乎为半透明状。卵径与前无节幼体期相当。此期隐约可见分节，复眼增大，头部及胸部进一步发育分化，头部出现弯曲的条状结构，将发育成额角，胸部出现类似心脏的组织，并不规律的跳动，为胚胎进入前溞状幼体期的重要标志，心跳60~100次/min，有心跳间隔，此时胚胎发育积温约达到306.0℃。72.0 h后心跳逐渐稳定，心跳间隔出现次数减少，心跳约为100次/min。

膜内溞状幼体期(图 2I)：雌虾产卵后408 h进入膜内溞状幼体期，此时卵黄仅存少量于胚体的头胸部背面，透明区域几乎充满整个胚胎。卵径增大明显，为(0.63±0.03) mm×(0.39±0.02) mm。复眼发育成亮黑色，四周隐约出现放射状条纹，出现眼柄，复眼呈半球状突出于背部表面。头部额角变粗，头胸部附肢分节，附肢末端出现色素块。胚胎组织结构清晰可见，肠道发育完全，偶尔可见蠕动。身体仍然弯曲，偶见抽动。膜内溞状幼体期胚胎心脏发育日趋完全，心跳稳定且加快，不再出现心跳间隔。此时胚胎发育基本完成，体型与溞状幼体类似。

溞状幼体Ⅰ期(图 2J)：胚胎发育至600 h左右，发育积温达到637.5℃，心跳增加到约180次/min，陆续开始有幼体孵出，幼体破膜时用头部的额角及附肢刺破卵膜。出膜后的幼体游泳能力弱，头部垂直向下，随水流而浮动。自此，日本米虾完成胚胎发育阶段，将进入幼体变态发育阶段。

2.2 不同时期的胚胎离体孵化效果

水温25.5℃时，不同时期离体胚胎均能于离体孵化装置中孵出幼体，但孵化率有较大差异(表 2)。卵裂期离体胚胎孵化率为(28.2±2.6)%，囊胚期离体胚胎孵化率为(33.1±4.4)%，二者无显著差异(P > 0.05)；前无节幼体期离体胚胎孵化率为(64.9±6.5)%，后无节幼体期离体胚胎的孵化率为(66.8±13.2)%，其无显著差异(P > 0.05)，但与非离体孵化的对照组(79.1±4.9)%差异显著(P < 0.05)。前溞状幼体期胚胎的离体孵化率为(78.9±2.2)%，膜内溞状幼体期孵化率为(80.7±2.4)%，与对照组差异不显著(P > 0.05)。各组离体胚胎所孵化出的Ⅰ期溞状幼体(ZⅠ)到Ⅱ期溞状幼体(ZⅡ)的变态率无显著差异(P > 0.05)。

2.3 温度对离体孵化效果的影响

由表 3可知，当盐度为17.0时，不同温度组日本米虾前溞状幼体期胚胎离体孵化时间和孵化率有明显差异。从15.0℃到32.0℃，随着水温的升高，胚胎孵化时间逐渐缩短，15.0℃组孵化时间需要(436.8± 124.8) h，而32.0℃组缩短至(228.0±88.8) h。温度对胚胎离体孵化率有显著影响，从15.0℃到29.0℃，随着水温升高而呈逐渐升高趋势，29.0℃时孵化率最高，为(78.2±2.8)%，但在32.5℃时下降至(73.2±3.2)%。由此可知，温度过高或过低均不利于离体胚胎的发育与孵化。

温度对离体孵化出幼体的质量也有影响。25.5℃组中溞状幼体变态率最高，为(67.2±1.8)%，32.5℃组溞状幼体变态率最低，为(57.3±4.0)%，与其他各组均有显著差异(P < 0.05)；15.0℃、18.5℃、22.0℃ 3组间溞状幼体变态率差异不显著(P > 0.05)。综合孵化率和溞状幼体变态率，胚胎离体孵化温度控制在25.5℃到29.0℃间，有利于提高孵化率和幼体质量。

3 讨论 3.1 胚胎发育的分期

虾蟹类胚胎发育可分为胚胎早期和晚期2个主要阶段，早期阶段为卵裂期、囊胚期和原肠胚；而晚期阶段也就是绝大部分虾蟹具有的膜内幼体期，其因种类而异，分期尚无统一标准。适宜的条件下，锦绣龙虾(Panulirus ornatus)膜内幼体期为14~15 d，根据附肢数量和复眼色素形成等特征分为7对附肢期、9对附肢期、11对附肢期、复眼色素形成期、准备孵化期和孵化期(梁华芳等, 2012)；白须条斑鞭腕虾(Lysmata amboinensis)膜内幼体期约为8.5 d，根据复眼色素形成和心跳等特征分为无节幼体发生期、复眼色素形成前期、复眼色素形成后期、孵化前期和孵化期(张雅静等, 2012)；远海梭子蟹(Portunus pelagicus)的膜内幼体期也为8.5 d左右，但根据身体分节和心跳等特征仅分为无节幼体、后无节幼体和原溞状幼体(廖永岩等, 2011)。对中华新米虾的研究表明，其胚胎发育分为卵裂期、囊胚期、原肠期、无节幼体期Ⅰ、无节幼体期Ⅱ、无节幼体Ⅲ期和无节幼体Ⅳ期，在水温为22℃~26℃条件下发育历时376 h (薛俊增等, 2009)。也有研究者将中华锯齿米虾的胚胎发育分为卵裂期、囊胚期、原肠期、前无节幼体期、后无节幼体期、复眼色素形成期和溞状幼体期(孙世杰等, 2007)。本研究参考已报道的虾蟹类胚胎分期方法(薛俊增等, 2009; 徐慈浩等, 2015)，将日本米虾早期胚胎分为受精卵、卵裂期、囊胚期和原肠胚期，而将晚期胚胎分为前无节幼体期、后无节幼体期、前溞状幼体期和膜内溞状幼体期。日本米虾胚胎发育过程与中华新米虾等大多数淡水虾类胚胎发育特征相似，其发育时间长，膜内幼体期多。但多数淡水虾类孵化出的幼体直接或者经过短暂的变态发育进入仔虾期(薛俊增等, 1995; 孙世杰等, 2007; 刘哲玉, 2009)，日本米虾幼体孵化后要经历较长的浮游期，这一点又与多数海水虾类相似(蔡生力等, 2006; 季文娟, 1996; 梁俊平, 2013)。日本米虾的胚胎发育及幼体的行为表现兼具淡水和海水种类的特征，与其降河洄游特性相一致。

3.2 不同发育时期胚胎离体孵化的效果

虾蟹类胚胎离体孵化过程中除了要保证足够的溶解氧，最主要的影响因素来自于真菌和原生动物等有害生物的滋生，由于没有亲体的及时清理，大量的有害生物附着于胚胎表面，导致胚胎腐烂，或被这些生物直接进食。为提高胚胎的离体孵化率，不少研究者使用药物处理胚胎。廖永岩等(2001)研究表明，使用0.2 mg/dm³浓度的孔雀石绿处理远海梭子蟹离体卵效果显著；鲍鹰等(1999)对中华绒螯蟹胚胎离体孵化研究表明，福尔马林与孔雀石绿联用比其单独使用的效果明显。虽然使用药物处理离体胚胎取得了一定成果，但规模化生产中这无疑将增加生产成本，且很多作用明显的化学药物会对环境造成危害，已被列入禁用药品。本研究没有使用任何药物处理离体胚胎，获得了较好的孵化效果，这主要取决于装置的持续流水，以及精细的过滤装置，其不仅能保证充足的溶解氧，及时冲洗胚胎表层的有害生物，而且能将水中的悬浮物滤除，减少细菌或原生动物对胚胎的影响。实验中还发现水流过大易击破卵膜，过小又不能彻底清除有害生物，水流大小对胚胎孵化效果的影响需要进一步研究。

日本米虾各阶段胚胎均能够离体孵化出幼体，且所孵出的ZⅠ幼体均能够发育至ZⅡ幼体，其与抱卵亲虾所孵出幼体的变态率无显著差异，表明本研究所采用的胚胎离体孵化装置及操作对幼体质量无显著影响。因此，本实验装置经过规模放大及适当的技术优化可以满足生产需求，对抱卵过程中因亲体死亡而废弃的受精卵重新利用，为虾蟹人工育苗技术创新提供参考。

3.3 温度对日本米虾胚胎离体孵化效果的影响

虾蟹类生长繁育中温度是重要环境因子，不仅影响其抗逆能力(冯亚萍等, 2018)和生长性状(王明珠等, 2018)，更对胚胎发育起决定性作用，但迄今有关温度对虾蟹离体胚胎发育及孵化效果影响的研究较少。本研究发现，在15.0℃~32.0℃范围内，日本米虾的离体孵化胚胎孵化时间逐渐缩短，15.0℃组孵化需要(436.8±124.8) h，而32.0℃组缩短至(228±88.8) h。在15.0℃~29.0℃范围内，孵化率也随着水温的升高而呈上升趋势，但温度高于29.0℃时，孵化率和幼体的变态率会明显下降。已有研究表明，在19.0℃~31.0℃范围内，脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)胚胎发育时间随温度升高而缩短，但高于28.0℃时随着温度升高幼体存活率开始下降，达到36.0℃时幼体无法变态(梁俊平等, 2013)。这可能由于温度升高导致胚胎代谢加快，机体发育时各组织器官发育又不完善，造成各器官的衰竭。另外，与机体代谢相关的酶及其他大分子物质的活性也均受到温度影响，过高的温度可能会直接导致其功能受损。水生生物胚胎通常要达到一定的积温才能孵化，本研究计算了日本米虾离体孵化的积温，约为637.5℃，与锦绣龙虾的642.4℃相近(梁华芳等, 2012)，但远高于一般虾蟹的300.0℃~ 400.0℃(蔡生力等, 2006; 顾功超等, 1995)。人工繁育时应建立起孵化温度、孵化率和幼体质量间的平衡，在保证胚胎正常发育和幼体质量的前提下，参考积温数值，利用温度调控胚胎发育时间，以合理安排生产计划，降低生产成本。