在鱼类规模化育苗生产中，鱼苗死亡率较高。Lauff等(1984)研究发现，消化酶是影响仔稚幼鱼死亡率的重要因素。消化酶活力高低直接影响鱼类的消化吸收，间接影响鱼类的生长发育。因此，对仔稚幼鱼消化酶活性的研究利于了解其消化生理特征，也有利于探索早期发育中鱼苗大量死亡的原因。目前，研究的鱼类消化酶主要包括脂肪酶、淀粉酶、胰蛋白酶和碱性磷酸酶等，脂肪酶主要由鱼类的肝胰脏分泌，起分解脂肪的作用；胰蛋白酶主要由胰脏分泌，鱼类早期发育蛋白消化主要靠胰蛋白酶完成；鱼类各消化器官都有淀粉酶存在，分解碳水化合物；碱性磷酸酶主要存在于鱼类肠道上皮细胞，与葡萄糖、Ca和P等的吸收有关，这些消化酶在鱼类早期发育过程的消化生理中起重要作用。目前，对仔稚幼鱼消化酶的研究日益增多，国内外学者对大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)、金头鲷(Sparus aurata)、古巴雀鳝(Atractosteus tristoechus)和日本黄姑鱼(Nibea iaponica)等仔稚幼鱼消化酶的分泌规律已有研究(陈慕雁等, 2005; 常青等, 2005; Moyano et al, 1996; Comabella et al, 2006; 孙敏等, 2012)。

黄条(Seriola aureovittata)是大洋性全球分布的暖温性中上层大型洄游性鱼类，在我国黄海、渤海和东海都有分布，其具有生长快、养殖周期短、经济价值高等优点，是深海增养殖的优良品种(柳学周等, 2017)。近年来，随着网箱养殖规模扩大，黄条鱼苗需求也日益增加，许多国家都开展了黄条人工繁殖和养殖技术研究，但一直存在仔稚鱼死亡率高的问题。目前，已有关于黄条生殖生理学、人工繁殖技术、早期形态发育和能量代谢等研究(Poortenaar et al, 2001; Moran et al, 2007; Stuart et al, 2013; Yang et al, 2016a、b)，但是，国内尚未见黄条早期发育消化酶活性变化的研究报道。本研究测定分析黄条早期发育过程中各阶段的主要消化酶(脂肪酶、淀粉酶、胰蛋白酶和碱性磷酸酶)活性变化特征，可为阐明黄条仔稚幼鱼消化机能特性、早期饵料系列研发及人工配合饲料的研制提供参考依据。

实验所用的黄条胚胎及仔稚幼鱼取自大连富谷水产有限公司。采集大连周边黄海海域野生4龄黄条，挑选健康强壮的黄条亲鱼放入到产卵池，进行水温、光周期调控和营养强化，使其自然产卵。采用溢水法收集受精卵，盐度法分离沉浮卵；受精卵在育苗车间水泥池的孵化网箱内，经72 h破膜完成孵化；孵化期间，连续充气、微流水。孵化后3 d开始投喂微藻强化的褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)，15 d开始投喂卤虫无节幼体。仔稚幼鱼培育条件：水温为(21.5±1.0)℃，盐度为29±1，pH为8.0±0.2，初孵仔鱼培育水位为60 cm，前4 d逐渐加满，以后每天换水，随着仔鱼生长，每隔1 d吸底，保持水质优良。鱼苗培育过程中饵料投喂系列为褶皱臂尾轮虫-卤虫无节幼体-卤虫成体-鱼肉糜。

鱼苗培育期间，每天取样，观察仔稚幼鱼的生长发育情况。采集受精50 h的受精卵2份，每份1.5 g；孵化后第1、2、4、7、15和20天仔鱼，每个样品取2份(每份200~300尾)；第25、30、40、50和60天稚幼鱼，每个样品取2份(每份20~ 100尾)，随机取30尾仔稚幼鱼测量全长。为消除未消化饵料对消化酶的影响，每次在上午投喂前取样，取样后置于无饵料生物的海水中暂养3 h，保证样品鱼空腹。取样时，用双蒸水冲洗并用滤纸吸干表面水分，放入-80℃冰箱中冷冻保存。实验时，将样品于冰上解冻，20 d前的仔鱼较小，无法分离出内脏，故采取整体匀浆方法；20 d后的稚幼鱼解剖取其内脏团匀浆。每组3个平行，每个平行的取样量约为0.5 g，放入预冷的离心管中，按照w:v=1:9的比例加入预冷的生理盐水，进行组织匀浆，在4℃、5000 r/min的条件下离心30 min，取上清液作为粗酶提取液，4℃保存，并于24 h内测试完毕。黄条仔稚幼鱼发育阶段的判定依据参考Yang等(2016a)的方法。

使用碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒，测量酶液中的蛋白浓度。脂肪酶用南京建成的脂肪酶试剂盒测定，活力单位定义：在37℃条件下，每毫升酶液在反应体系中与底物反应1 min，消耗1 mmol底物为1个酶活力单位。淀粉酶用南京建成淀粉酶试剂盒测定，其活力单位定义：组织中每毫克蛋白37℃、pH 7.0条件下与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位。胰蛋白酶用南京建成胰蛋白酶试剂盒测定，其活力单位定义：在37℃、pH 8.0条件下，每毫克蛋白中含有的胰蛋白酶，每分钟使吸光度变化0.003，即为1个酶活力单位。碱性磷酸酶用南京建成碱性磷酸酶试剂盒测定，其活力单位定义：在37℃条件下，每克组织蛋白与基质作用15 min产生1 mg酚为1个酶活力单位。

采用SPSS 22.0软件对实验数据进行分析，运用单因子方差分析(One-way ANOVA)和Duncan氏检验法对各组数据进行显著性差异分析和多重比较，显著性水平为0.05，所有数值均采用平均值±标准差(Mean±SD)表示。

全长的平均日增长计算公式：

用指数函数分析全长和日龄的关系，公式：

式中，L为全长(mm)，t为日龄(d)，a、b为常数。

2.1 黄条仔稚幼鱼的全长

黄条仔稚幼鱼全长随日龄的增长见图 1，1~7 d仔稚幼鱼全长的平均日增长速度为0.11 mm/d；10~15 d的平均日增长速度为0.20 mm/d；20~25 d的平均日增长速度为0.23 mm/d；30~35 d的平均日增长速度为0.49 mm/d；40~60 d的平均日增长速度高达0.98 mm/d。黄条初孵仔鱼全长为(4.26±0.15) mm，60 d时，全长为(33.84±4.23) mm，平均日增长0.49 mm，全长(L)与日龄(d)的变化符合指数方程：

图 1(Fig. 1)

图 1 黄条仔稚幼鱼生长曲线和饵料投喂 Fig.1 The growth curve and feeding of S. aureovittata

孵化后60 d内的仔稚幼鱼全长随着日龄的增加而加快增长，25 d后全长大幅增加。

2.2 黄条胚胎、仔鱼消化酶比活力变化

黄条仔鱼脂肪酶比活力变化见图 2。从图 2可以看出，黄条胚胎发育阶段脂肪酶比活力处于低水平，仅为(1.14±0.16) U/mg。孵化后的仔鱼，脂肪酶比活力保持稳定，开口时(4 d)脂肪酶比活力达到最大值，为(5.89±0.45) U/mg，显著高于其他组(P < 0.05)，是初孵仔鱼(1 d)脂肪酶比活力的6倍。7 d时，仔鱼脂肪酶比活力低于受精卵，并且达到整个仔鱼期的最低值，为(0.97±0.14) U/mg。随后脂肪酶比活力整体呈上升趋势，15 d时，上升为(3.43±0.64) U/mg，20 d时，脂肪酶的比活力显著高于初孵仔鱼(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 2 黄条胚胎、仔鱼脂肪酶的比活力变化 Fig.2 Specific activities of lipase during embryo and larval development of S. aureovittata 胚胎阶段记为孵化后0 d。不同小写字母表示 消化酶比活力存在显著差异(P < 0.05, n=3)，下同 The embryonic stage is recorded as 0 d after hatching. Different lowercase letters mean significant differences in specific activities of digestive enzymes (P < 0.05, n=3), the same as below

黄条仔鱼淀粉酶酶比活力变化见图 3。从图 3可以看出，黄条胚胎发育阶段就可以检测到淀粉酶活性，比活力较低，仅为(0.09±0.01) U/mg。孵化后，仔鱼的比活力显著上升(P < 0.05)，2 d时又下降至(0.22±0.01) U/mg。随后比活力呈先上升后下降趋势，7 d时淀粉酶比活力达最高值，为(1.59±0.02) U/mg，并且显著高于其他组(P < 0.05)；7~20 d仔鱼淀粉酶比活力仍高于初孵仔鱼。

图 1(Fig. 1)

图 3 黄条胚胎、仔鱼淀粉酶的比活力变化 Fig.3 Specific activities of amylase during embryo and larval development of S. aureovittata

在黄条胚胎发育阶段未检测到胰蛋白酶活性，而在初孵仔鱼时可以检测到胰蛋白酶活性，但比活力较低，仅为(94.00±8.54) U/mg。初孵仔鱼至20 d仔鱼，随着生长发育，其胰蛋白酶比活力逐渐提高，各期仔鱼的胰蛋白酶比活力显著高于初孵仔鱼(P < 0.05)；在15 d时胰蛋白酶比活力达到最大值，为(1098.67± 24.03) U/mg (图 4)。

图 1(Fig. 1)

图 4 黄条胚胎、仔鱼胰蛋白酶的比活力变化 Fig.4 Specific activities of trypsin during embryo and larval development of S. aureovittata

黄条仔鱼的碱性磷酸酶比活力变化见图 5。从图 5可以看出，在胚胎发育阶段中，可以检测到微弱活性，其值显著低于其他组(P < 0.05)。孵化后碱性磷酸酶比活力上升，4 d达到最大值，为(5.56±0.41) U/mg；7~20 d碱性磷酸酶比活力略有下降，20 d时，碱性磷酸酶比活力为(2.34±0.08) U/mg。方差分析结果显示，2~20 d仔鱼碱性磷酸酶比活力显著高于初孵仔鱼(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 5 黄条胚胎、仔鱼碱性磷酸酶的比活力变化 Fig.5 Specific activities of alkaline phosphatase during embryo and larval development of S. aureovittata

2.3 黄条稚幼鱼消化酶比活力变化

黄条稚幼鱼内脏团的脂肪酶比活力的变化见图 6。从图 6可以看出，25~60 d黄条稚幼鱼内脏团的脂肪酶比活力整体呈上升趋势。25 d时，内脏团脂肪酶比活力为(1.19±0.53) U/mg，显著低于60 d (P < 0.05)；30~50 d脂肪酶比活力基本保持稳定，60 d时，呈上升趋势，比活力为(2.80±0.25) U/mg。

图 1(Fig. 1)

图 6 黄条稚幼鱼脂肪酶的比活力变化 Fig.6 Specific activities of lipase during juvenile development of S. aureovittata

黄条稚幼鱼(25~60 d)内脏团中淀粉酶比活力的变化情况见图 7。从图 7可以看出，在此期间，淀粉酶比活力整体呈下降趋势。25 d时，黄条内脏中淀粉酶比活力为(0.59±0.05) U/mg，高于30~60 d的比活力值。其中，30~60 d稚幼鱼淀粉酶比活力都保持较低水平且差异不显著(P > 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 7 黄条稚幼鱼淀粉酶的比活力变化 Fig.7 Specific activities of amylase during juvenile development of S. aureovittata

黄条稚幼鱼发育阶段的胰蛋白酶活性变化见图 8。从图 8可以看出，25~60 d黄条稚幼鱼内脏团的胰蛋白酶比活力整体呈先下降后上升的趋势。30 d时的胰蛋白酶比活力最高，为(534.33±33.01) U/mg，显著高于40~60 d的比活力值(P < 0.05)；60 d胰蛋白酶比活力略有上升。

图 1(Fig. 1)

图 8 黄条稚幼鱼胰蛋白酶的比活力变化 Fig.8 Specific activities of trypsin during juvenile development of S. aureovittata

黄条稚幼鱼的碱性磷酸酶活性变化见图 9。从图 9可以看出，25~60 d黄条稚幼鱼内脏团的碱性磷酸酶比活力呈基本平稳趋势。25 d时，内脏团的碱性磷酸酶比活力为(2.11±0.15) U/mg；至40 d时趋于稳定，差异不显著(P>0.05)；50 d时，幼鱼碱性磷酸酶比活力明显下降到(1.89±0.27) U/mg；60 d时，又上升恢复到25 d的水平。

图 1(Fig. 1)

图 9 黄条稚幼鱼碱性磷酸酶的比活力变化 Fig.9 Specific activities of alkaline phosphatase during juvenile development of S. aureovittata

黄条早期发育阶段4种消化酶比活力变化见图 10。在黄条初孵仔鱼阶段，4种消化酶比活力值大小依次为：胰蛋白酶 > 脂肪酶 > 淀粉酶 > 碱性磷酸酶；7 d仔鱼摄食轮虫阶段，4种消化酶比活力值大小依次为：胰蛋白酶 > 碱性磷酸酶 > 淀粉酶 > 脂肪酶；20 d仔鱼投喂卤虫无节幼体阶段，4种消化酶比活力值大小依次为胰蛋白酶 > 脂肪酶 > 碱性磷酸酶 > 淀粉酶；30 d稚鱼投喂卤虫成体阶段，胰蛋白酶比活力最高，碱性磷酸酶居于次位，淀粉酶比活力最低；50 d幼鱼投喂鱼肉糜阶段，胰蛋白酶比活力最高，脂肪酶和碱性磷酸酶接近，居于次位，淀粉酶比活力最低。

图 1(Fig. 1)

图 10 不同发育阶段黄条仔稚幼鱼消化酶的比活力变化 Fig.10 Specific activities during different development stage of S. aureovittata 不同小写字母表示同一日龄不同消化酶存在差异显著 Different lowercase letters mean significant differences at same age in different digestive enzymes

鱼类早期发育过程中，由于饵料转换和消化器官的发育，消化酶在不同发育阶段的活性不同，消化酶的强弱是影响鱼类消化吸收能力强弱的重要因素，因此，消化酶是消化道中影响食物利用的重要因子，反映了仔稚幼鱼的消化能力和营养需求，与鱼类早期生长和存活也有很大关系(张云龙等, 2017)。本研究发现，黄条早期发育阶段消化酶的变化显著，与其生长发育阶段和摄食的饵料密切相关。

本研究在黄条胚胎发育阶段可检测到脂肪酶、淀粉酶和碱性磷酸酶活性，认为黄条的消化酶不是外源性饵料诱导，推定由母源亲本传递而来。关于日本黄姑鱼和匙吻鲟(Polyodon spathula)的研究发现，在受精卵中就检测到脂肪酶、淀粉酶和碱性磷酸酶活性(孙敏等, 2012; 吉红等, 2012)，与本研究结果相似。不同鱼类脂肪酶最早出现时间不一样，Alvarez-González等(2008)研究表明，斑带副鲈(Paralabrax maculatofasciatus)在2 d时，检测出脂肪酶活性；陈慕雁等(2005)研究表明，大菱鲆在15 d才检测出脂肪酶活性。本研究在初孵仔鱼中第1次检测到胰蛋白酶活性，而在胚胎期没有检测到，可能是在胚胎期消化道还没形成，而在孵化后的仔鱼已有了初始的消化道结构，促使了胰蛋白酶的分泌。潘雷等(2013)研究表明，胰蛋白酶主要由胰脏分泌，但需要经过肠道的肠致活酶激活才能有活性，而鱼类的肠黏膜可以分泌有活性的肠致活酶。在大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)和细点牙鲷(Dentex dentex)初孵仔鱼也可以检测到胰蛋白酶活性(潘雷等, 2013; Gisbert et al, 2009)，与本研究结果相似。同时，孵化后1 d仔鱼也检测到脂肪酶、淀粉酶和碱性磷酸酶活性，此时，可通过消化蛋白质、脂肪和碳水化合物等营养物质，促进胚后发育。

3.2 黄条仔稚幼鱼4种消化酶活力的变化

脂肪酶主要是由鱼类的肝胰脏分泌的，在海水仔稚鱼的消化生理中占据很重要的地位。在不同鱼类中，脂肪酶变化趋势不同，Martínez等(1999)研究表明，塞内加尔舌鳎(Solea senegalensis)孵化后第10天脂肪酶比活力最高。陈慕雁等(2005)研究表明，大菱鲆在15 d才检测出脂肪酶活性。Alvarez-González等(2008)研究表明，斑带副鲈中脂肪酶比活力随着生长发育而增加。本研究发现，黄条0~4 d仔鱼体内的脂肪酶逐渐提高，在仔鱼开口(4 d)时比活力最高，随后下降。这可能是内源性营养向外源性营养转化时，仔鱼在摄取食物前为了积累游泳及摄食行为所需能量，做出提高自身的消化能力的准备，增强消化酶的活性是有效途径。Oozeki等(1995)研究表明，早期仔鱼体内存在2种脂肪酶，1种是磷脂酶A2，用于卵黄囊的吸收；另1种是脂酶，主要用于外源性脂肪的消化，7 d黄条仔鱼脂肪比活力下降，可能因为2种脂肪酶转换不稳定。稚鱼期，随着生长发育，黄条内脏团中脂肪酶比活力上升并趋于稳定；幼鱼期，黄条脂肪酶比活力上升，说明黄条脂肪代谢系统趋于完善，对食物中脂肪消化能力增强。

本研究结果显示，黄条体内淀粉酶比活力在7 d达到最大值，表明在早期仔鱼具备消化碳水化合物的能力。这变化趋势和白鲷(Diplodus sargus)、菊黄东方鲀(Takifugu flavidus)、中华倒刺鲃(Spinibarbus snensis)等的研究结果相似，即仔鱼淀粉酶比活力较高具有普遍性(Cara et al, 2003; 刘永士等, 2014; 李芹等, 2010)。Moyano等(1996)研究发现，金头鲷淀粉酶比活力在早期发育阶段不高，随着生长发育，淀粉酶比活力逐渐提高，这与本研究结果不一致，猜测金头鲷杂食性的食性是主要原因。稚鱼期和幼鱼期黄条淀粉酶比活力下降，可能是随着黄条生长发育，其加强对脂肪和蛋白的利用而减少对糖分的需求，这可能与黄条肉食食性有关，可以考虑在此期间投喂低碳水化合物水平的饲料。

本研究表明，仔鱼阶段胰蛋白酶比活力逐渐升高，稚幼鱼阶段也保持较高水平，说明整个发育阶段其对蛋白质的需求强烈。细点牙鲷胰蛋白酶比活力变化趋势和黄条胰蛋白酶比活力变化趋势相似(Gisbert et al, 2009)。潘雷等(2013)研究表明，大泷六线鱼中胰蛋白酶活力随生长发育而增强，在100 d时，胰蛋白酶比活力最高，变化趋势和黄条不同，从大泷六线鱼的研究方法看，整个实验过程的样本均采用整体鱼体匀浆的方法，而本实验20 d前，仔鱼整体研磨，20 d后，稚幼鱼为了更精确测得消化酶数值，采用分离黄条内脏团匀浆进行测量，样品的取样部位不同导致实验结果不同。

碱性磷酸酶是一种膜结合金属酶，主要存在于鱼类前肠上皮细胞的浅部和纹状缘，一般认为对脂类、葡萄糖、Ca和P的吸收有促进作用(Tengjaroenkul et al, 2000)。本研究结果显示，在仔鱼期黄条碱性磷酸酶比活力逐渐增高，在4~7 d最高，随后略有下降。陈慕雁等(2005)研究表明，大菱鲆碱性磷酸酶比活力总体呈增加趋势，在70 d到达顶峰。Babaei等(2011)研究表明，波斯鲟(Acipenser persicus)碱性磷酸酶比活力在19 d最高，随后下降。黄条稚幼鱼期内脏团中碱性磷酸酶活性保持稳定的较高水平，推测其消化组织器官的消化功能不断发育完善，加强了对饵料的消化和吸收。

黄条初孵仔鱼在未开口摄食阶段为内源性营养阶段，其生长发育所需能量主要来源于自身的卵黄、油球中的蛋白质和脂肪，故胰蛋白酶和脂肪酶比活力高，有利于消化吸收卵黄囊和油球中的蛋白质和脂肪，促进生长发育。研究发现，在7 d时，黄条淀粉酶比活力升高，随后又下降，可能与投喂的饵料有关。Kim等(2001)认为，淀粉酶比活力提高是摄食轮虫所致，若不投喂轮虫，其淀粉酶比活力显著降低。20日龄以后的各阶段，黄条胰蛋白酶比活力最高，碱性磷酸酶和脂肪酶比活力也保持较高水平而居次位，淀粉酶基本处于较低水平。黄条仔稚鱼阶段主要是肌肉和骨骼的生长发育，同时，其游泳、摄食等行为也不断消耗能量。因此，需要从食物中消化吸收大量的蛋白质、脂肪和Ca、P等灰分物质。此时，碱性磷酸酶比活力快速升高，也表明其骨骼的生长发育对Ca、P等的需求增强。淀粉酶比活力不高，认为稚幼鱼发育阶段碳水化合物只作为能量消耗而进行补充，不是主要营养所需。另外，从投喂的饵料营养成分来看，轮虫和卤虫的粗蛋白含量高达60%~65%，粗脂肪含量为20%~24%，灰分为8%~10%(童圣英等，1988)，有利于黄条仔稚幼鱼大量吸收蛋白质、脂肪及矿物质，以保证其肌肉和骨骼生长发育，4种消化酶在各阶段的比活力值的高低也验证了对各种营养物质的需求。因此，在黄条育苗生产中，可根据其营养需求和不同阶段消化酶变化特点调整饵料种类，提高对仔稚幼鱼对饵料的消化吸收，以提高鱼苗的生长速度和存活率。