渔业科学进展  2020, Vol. 41 Issue (2): 95-102  DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20190123002
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引用本文 

李安, 李高俊, 王世锋, 柳淑芳, 周永灿, 申志新, 薛献坵, 蔡岩. 海南南渡江唇䱻染色体核型和银染分析[J]. 渔业科学进展, 2020, 41(2): 95-102. DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20190123002.
LI An, LI Gaojun, WANG Shifeng, LIU Shufang, ZHOU Yongcan, SHEN Zhixin, XUE Xianqiu, CAI Yan. The Karyotype and Ag-NORs of Hemibarbus labeo from Nandujiang River of Hainan[J]. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(2): 95-102. DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20190123002.

基金项目

农业基础性长期性科技工作(ZX08S1623)、中央级科研院所基本科研业务费专项(20603022018009)和海南省省属科研院所技术开发研究专项(R100030.304;R100263.3)共同资助

作者简介

李安, E-mail:2541431771@qq.com

通讯作者

蔡岩, 高级实验师, E-mail:azsure_caiyan@163.com

文章历史

收稿日期:2019-01-23
收修改稿日期:2019-02-22
海南南渡江唇䱻染色体核型和银染分析
李安 1, 李高俊 2, 王世锋 1, 柳淑芳 3, 周永灿 1, 申志新 2, 薛献坵 1, 蔡岩 1     
1. 海南大学海洋学院 海南省热带水生生物技术重点实验室 海口 570228;
2. 海南省海洋与渔业科学院 海口 570100;
3. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071
摘要:本研究以海南南渡江野生唇䱻(Hemibarbus labeo)为材料,采用腹腔注射植物血球凝集素(PHA)、秋水仙素,肾细胞直接制片法,分析唇䱻染色体核型和银染(Ag-NORs)。结果显示,唇䱻的二倍体染色体数目为50,核型公式为2n=18m+12sm+12st+8t,其染色体臂数(NF)为80,未发现异型染色体,Ag-NORs出现在第5对和第11对同源染色体的短臂末端。鮈亚科鱼类染色体进化综合分析结果表明,唇䱻具有鮈亚科鱼类的原始核型。本研究不仅补充了唇䱻的细胞遗传学数据,为研究鮈亚科/䱻属鱼类的分类与进化提供了数据资料,也为唇䱻的种质资源保护、种质改良等工作奠定了理论基础。
关键词唇䱻    染色体    核型    银染    鮈亚科    
The Karyotype and Ag-NORs of Hemibarbus labeo from Nandujiang River of Hainan
LI An 1, LI Gaojun 2, WANG Shifeng 1, LIU Shufang 3, ZHOU Yongcan 1, SHEN Zhixin 2, XUE Xianqiu 1, CAI Yan 1     
1. Ocean College, Hainan University, Key Laboratory of Tropical Aquatic Biotechnology of Hainan Province, Haikou 570228;
2. Hainan Academy of Ocean and Fisheries Sciences, Haikou 570100;
3. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071
Abstract: In this study, the karyotype and Ag-NORs of wild Hemibarbus labeo from Nandujiang River of Hainan were analyzed using the methods of intraperitoneal injection of phytohemagglutinin (PHA) and colchicine, and direct preparation of head kidney cells. Results showed that H. labeo had a diploid chromosome number of 50, the karyotype formula was 2n=18m + 12sm + 12st + 8t, the number of chromosome arms (NF) was 80, no heterotypic chromosome was observed, and Ag-NORs were located on the ends of the short arms of pair No.5 and pair No.11. Comprehensive analyses of the chromosomal evolution in subfamily Gobioninae indicated that H. labeo had the primitive karyotype of Gobioninae fish. Our study will not only supplement the cytogenetic data of H. labeo and provide information on the taxonomy and evolution of the subfamily Gobioninae, genus Hemibarbus, but will also lay the theoretical foundation for germplasm protection and germplasm improvement of H. labeo.
Key words: Hemibarbus labeo    Chromosome    Karyotype    Ag-NORs    Gobioninae    

唇䱻(Hemibarbus labeo)属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲤形目(Cypriniformes)、鲤亚目(Cyprinoidei)、鲤科(Cyprinidae)、鮈亚科(Gobioninae)、䱻属(Hemibarbus) (伍献文等, 1982; 乐佩琦, 1995),广泛分布在我国南北各大水系,是名贵土著品种,国外见于朝鲜、日本、俄罗斯远东地区及越南北部(Nelson et al, 1976)。唇䱻以底栖无脊椎动物、虾、昆虫幼虫等为主食,是偏肉食性鱼类,幼鱼期以浮游动物为食,兼食一些藻类及水生植物。唇䱻具有体形优美、杂食性、适应性强、肉质细嫩、味道鲜美等优点,是一种经济价值较高的中小型淡水鱼类,具有很好的养殖前景(李军等, 2015)。目前,关于唇䱻的研究主要集中在胚胎发育(楼允东, 1997)、机体代谢(宁博等, 2013; 吴旋等, 2012)、遗传育种(徐伟等, 2009; 练青平等, 2011)以及人工养殖(李军等, 2015; Gan et al, 2006)等方面。

染色体是细胞核内承载生物遗传信息的重要物质。鱼类染色体核型研究对鱼类的遗传、变异、系统分类、杂交育种以及环境污染的监测等具有重要意义(梁述章等, 2019; Sharma et al, 1983)。目前,与唇䱻染色体相关的研究仅见王雪等(1989)对我国黑龙江流域唇䱻的二倍体数目的报道,及李康等(1984)对广东韶关唇䱻的核型研究。但李康等(1984)并未对染色体上的核仁组织区分布进行研究。海南岛大约在6500万年前与大陆分离形成独立的海岛,本研究以海南南渡江野生唇䱻为研究对象,对其染色体核型和银染(Ag-NORs)的分布进行分析,旨在补充唇䱻的细胞遗传学数据,为研究鮈亚科/䱻属鱼类的分类与进化提供数据资料,也为唇䱻的种质资源保护、种质改良等工作提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验用鱼于2017年11月取自海南省南渡江定安河段,共5尾,2雄3雌,为野生唇䱻洋生物养殖实验室。

1.2 实验方法 1.2.1 染色体标本的制备

染色体标本的制备参考布氏石斑鱼(Epinephelus bleekeri)的染色体标本制备方法(蔡岩等, 2012),每尾鱼按10 μl/g鱼体重静脉抽血,再按10 μg/g鱼体重剂量腹腔注射植物血凝素(PHA);3.5 h后,按照1 μg/g鱼体重腹腔注射秋水仙素,15 min后,剪鳃放血,取头肾制备细胞悬液,经500 r/min离心收集细胞,加入0.075 mol/L KCl溶液,37℃水浴低渗30 min,离心后加入新配制的卡诺氏固定液,室温固定20 min,之后重复固定2次。再次离心后取沉淀,加入适量新配制的卡诺氏固定液重悬细胞,用吸管吸取细胞悬液滴在玻片上,过酒精灯火焰3次,自然凉干,备用。

1.2.2 核型分析

染色体标本经Giemsa染液染色后,置于显微镜下进行观察拍照和统计分析。选取100个来自不同细胞的分散良好、形态清晰的中期分裂相,在显微镜下计数并记录,通过统计分析确定唇䱻的染色体数目。选取6个数目完整、形态清晰、分散良好、长度适中、着丝点清楚、2条单体适度分开的分裂相显微摄像,经放大打印后进行长度测量,参照Tan等(2004)的方法计算其染色体相对长度和臂比值,并按Levan等(1964)提出的标准进行分类、配对和排列核型,得出唇䱻的染色体核型公式。

1.2.3 Ag-NORs显带

参考Howell等(1980)的方法,将滤纸铺于培养皿底部,用蒸馏水润湿,上面放2根牙签,置于60℃水浴锅中保温;将制备好的新鲜玻片标本样品面朝上平放在培养皿中,玻片上加20 μl明胶显影液,再加40 μl 50%硝酸银溶液,盖上盖玻片,在水浴锅中温浴至标本呈金褐色为止;用蒸馏水快速冲洗,去除盖玻片,干燥后显微镜观察和拍照。

2 结果 2.1 唇䱻的染色体核型特征 2.1.1 唇䱻二倍体染色体数目

对5尾唇䱻进行直接头肾细胞制片法获得染色体标本,选取100个形态清晰、分散良好的中期分裂相进行观察和计数,结果见表 1,83%的中期分裂相中二倍体染色体数为50条,由此可以判定,唇䱻二倍体染色体数目为2n=50。

表 1 唇䱻分裂中期染色体数统计结果 Tab.1 The results of the metaphase chromosome number of H. labeo
2.1.2 唇䱻染色体核型

唇䱻染色体相对长度和臂比的统计结果见表 2,其染色体组由25对同源染色体所组成,相对长度最长为5.69,最短为2.92,最长染色体跟最短染色体的比值为1.95,总体分析,唇䱻的各染色体长度差异不大。根据Levan等(1964)提出的标准进行分类,可分为4组,m类型染色体(中部着丝粒,r=1.0~1.7)有9对,sm类型染色体(亚中部着丝粒,r=1.7~3.0)有6对,st类型染色体(亚端部着丝粒,r=3.0~7.0)有6对,t类型染色体(端部着丝粒,r=7.0~∞)有4对,其染色体核型公式为2n=18m+ 12sm+12st+8t,臂数(NF)=80。

表 2 唇䱻染色体相对长度(RL)和臂比(AR)(平均值±标准差) Tab.2 The relative length and arm ratio of chromosome of H. labeo (Mean±SD)

根据表 2数据,对染色体形态和长度进行分析,整个染色体组的长度差异并不显著,按照长度由大到小排列,创建唇䱻的染色体核型图(图 1)。

图 1 唇䱻中期分裂相及染色体核型 Fig.1 The mataphase chromosome (a) and karyotype (b) of H. labeo
2.2 唇䱻的Ag-NORs带型

对50个唇䱻银染位点清晰、染色体数目完整的中期分裂相进行观察和统计,显示85%的中期分裂相能够清晰地观察到4个银染位点,其他的中期分裂相只能观察到低于4个银染位点或者只在同源染色体的其中一条上有显示,根据形态相似性和长度分析可知,唇䱻的银染位点位于第5对和第11对同源染色体的短臂上,且姐妹染色单体上均有银染位点。

图 2 唇䱻中期分裂相Ag-NORs Fig.2 Mataphase chromosome of H. labeo with Ag-NORs 实心箭头和空心箭头所示分别为第5对和第11对染色体的Ag-NORs Solid arrows and hollow arrows indicated the Ag-NORs on chromosome No.5 and No.11, respectively
3 讨论

李康等(1984)和王雪等(1989)对广东韶关和黑龙江的唇䱻进行了染色体研究,王雪等(1989)仅仅得到2n=50的二倍体染色体数目结果,李康等(1984)则报道了唇䱻染色体核型2n=16m+16sm+14st+4t。本研究得到的海南南渡江唇䱻二倍体染色体数目与王雪等(1989)相同,但核型研究结果(2n=18m+12sm+12st+8t)与李康等(1984)的结果存在一定差异:在m型染色体上多了1对、sm型染色体少了2对、st型染色体少了1对以及t型染色体多了2对。研究结果存在差异的原因可能为:(1)不同地理群体存在的染色体多态现象。这在鮈亚科鱼类中较常见,如产于黑龙江(李康等, 1984)和湖北(常重杰等, 1984)以及广东(余先觉等, 1989)的棒花鱼(Abbottina rivularis)染色体核型在地理群体上存在差异,麦穗鱼(Pseudorasbora parva)等也存在不同地理群体染色体多态现象(李康等, 1984; Ren et al, 2014; Cui et al, 1991; 李树深等, 1983),另外,比较大黄鱼(Pseudosciaena crocea)岱衢族和闽粤东族群体的染色体核型,显示出2个地理群体间染色体核型存在显著差异,因适应不同生长环境、长期地理隔离,可能是大黄鱼不同地理群体间染色体核型存在显著差异的重要原因之一(王德祥等, 2006);(2)实验方法不同导致染色体凝缩程度不同,进而影响测量结果(王雪等, 1989; Arai, 2011; 常重杰等, 1984; 梁述章等, 2019)。在实验操作中,PHA与秋水仙素的剂量和效应时间不易把握,PHA作用时间过长或过短都不易得到较好的分裂相,秋水仙素处理时间较长或浓度较高时,染色体凝缩严重,导致所制备的标本中染色体不同程度的皱缩(史宝等, 2017),均可能使得分析结果存在一定的差异。唇䱻是否存在地理群体上的染色体多态性,还需要同一实验室利用相同的实验方法和操作进行进一步的研究。

目前,我国已对鮈亚科鱼类的染色体核型进行了较多研究(表 3)。根据表 3可见,鮈亚科的鱼类染色体核型虽然有所差异,但2n值均为50,染色体臂数的变动范围为80~98,其中,䱻属谱系鱼类的染色体臂数平均为82.0,鳈属谱系为88.6,鮈属谱系为94,似鮈属谱系为94.1。李钧祥(2008)认为,这种染色体数目不变而染色体臂数增加是由染色体着丝粒位置颠倒所致。在特定的分类类群中,染色体臂数少的核型被认为是原始核型(李渝成等, 1986; 王雪等, 1989; 史宝等, 2017),因而䱻属谱系鱼类为鮈亚科鱼类中较为原始的类群。有趣的是,以上基于染色体核型所得到的鮈亚科鱼类进化关系分析结果与利用分子标记技术所得到的鮈亚科鱼类的系统发育关系研究结果是高度一致的,鮈亚科鱼类的分子系统发育研究亦表明,䱻属谱系位于系统发育树的基部,为较原始的类群,其次为鳈属谱系,然后是鮈属谱系,似鮈属谱系位于系统发育树的最顶端,属于最为特化的类群(杨金权, 2005)。此外,在䱻属内的鱼类也体现了与鮈亚科一致的染色体进化特征:唇䱻与花䱻位于系统发育树的基部,染色体臂数亦最少(80);长吻䱻和似䱻位于系统发育树的顶部,染色体臂数也相对较多(分别为86和88)。因此,唇䱻为鮈亚科鱼类中的原始种类,其染色体组成和形态特征可代表鮈亚科鱼类的原始核型特征,即2n=30m(sm)+20st(t),NF=80。而染色体核型研究结果与分子系统发育研究结果的相互印证,也进一步体现了传统细胞遗传学方法在生物进化研究方面的重要价值。

表 3 我国鮈亚科鱼类的染色体核型研究 Tab.3 Research on chromosome karyotypes of several Cyprinidae fishes in China

核仁组织区(Nucleolus organizer regions, NORs)是具有组织形成核仁能力的染色质区,含有多拷贝核糖体RNA基因,在生物进化过程中起着至关重要的作用(任修海等, 1996; 舒琥等, 2014)。银染与染色体上的NORs区域的特殊蛋白质有关,可显示出具有转录活性的NORs,Ag-NORs的数目、分布和形态特征也可以作为研究物种间亲缘关系和染色体进化的一个指标(李树深, 1983; Sola et al, 2000; 任修海等, 19931996)。鮈亚科鱼类在进化过程中Ag-NORs向减少的方向发展,原始型具有4个,特化型具有2个,而基本型两种情况皆具备(Martinez-Rodriguez et al, 1989; Medrano et al, 1988; Yang et al, 2006; Perazzo et al, 2011; Natarajan et al, 1974)。本研究发现,唇䱻的NORs共有4个,分别分布在第5对和第11对染色体上。可见,基于NORs的染色体进化分析亦表明唇䱻为鮈亚科鱼类的原始类群。

综上所述,唇䱻具有䱻属鱼类的原始核型特征(2n=50, NF=80),其银染位点4个,分布在2对染色体上。此结果补充了唇䱻的细胞遗传学数据,从染色体水平为鮈亚科/䱻属鱼类的分类与进化提供了数据资料,也为唇䱻的种质资源保护、改良等工作奠定了理论基础。

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