Piwi(P-element-induced wimpy testis)基因属于Argonaute (AGO)蛋白家族，该蛋白家族包括AGO亚家族、PIWI亚家族和Caenorhabditis elegans亚家族(Kawaji et al, 2008)。其中，PIWI亚家族主要与piRNA (Piwi- interacting RNAs)结合形成PIWI/piRNA复合体，在配子发生、DNA甲基化及维持基因组完整性等方面起重要作用(Houwing et al, 2007; Bak et al, 2011)。PIWI亚家族的研究起步较晚，Lin等(1997)首次在果蝇(Drosophila melanogaster)卵巢的生殖干细胞中发现piwi基因，并证实该基因在果蝇生殖干细胞修复方面扮演重要角色，之后在小鼠(Mus musculus) (Kuramochi-Miyagawa et al, 2001)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)(Cox et al, 1998)和斑马鱼(Danio rerio)(Tan et al, 2002)等模式生物中也发现了piwi同源基因。小鼠中piwi同源基因有miwi、mili和miwi2(Kuramochi-Miyagawa et al, 2001; Carmell et al, 2007)；秀丽隐杆线虫中发现prg-1和prg-2两个同源基因(Cox et al, 1998)；斑马鱼同源基因有ziwi和zili (Tan et al, 2002; 李丹等, 2010)。Piwi基因在生殖系细胞发育中发挥着重要作用，如原始生殖细胞(PGC)特化、生殖系细胞分化和生殖干细胞(GSC)维持(Megosh et al, 2006)。Piwi基因突变体果蝇表现为生殖干细胞分裂失调，最终导致不育(Hartig et al, 2007)；小鼠的piwi基因分别在精子发生的不同时期表达，miwi、mili和miwi2的基因突变都会导致雄性个体的不育(Kim, 2006)；秀丽隐杆线虫中prg-1和prg-2活性的降低会导致其生殖细胞数目明显减少(Cox et al, 1998)；斑马鱼中ziwi和zili两个基因在生殖腺特异性高表达，ziwi突变体的生殖细胞出现细胞调亡现象(Houwing et al, 2007)，zili突变体的生殖细胞不能实现雌雄分化(Houwing et al, 2014)。研究表明，piwi基因编码的氨基酸具有2个高度保守的结构域，分别为PAZ(Piwi Argonaute Zwille)和PIWI(Parker et al, 2006)。PAZ结构域位于氨基酸链中间部分，包括1个寡聚核苷酸折叠区，结合PiRNAs 3'端的核苷酸突出端；PIWI结构域靠近氨基酸链的C末端，具有RNaseH活性(Simon et al, 2011)，PAZ和PIWI结构域可能在piwi-piRNA通路中起结合piRNAs的作用。随后，在鲤鱼(Cyprinus carpio)(Zhou et al, 2012)、鲫鱼(Carassius auratus)(Tao et al, 2018)、黄鳝(Monopterus albus)(Yi et al, 2014)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)(Xiao et al, 2013)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)(Wang et al, 2016)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)(张丽燕, 2014)和大菱鲆(Scophthalmus maximus)(Wang et al, 2017)等硬骨鱼类中也陆续发现piwil2基因。大菱鲆piwil2基因的研究显示，Smpiwil2可能在胚胎和雌雌鱼性腺发育中发挥重要作用(Wang et al, 2017)；piwil2基因是半滑舌鳎雄性精子发生过程中的关键基因，在精子发生早期，特别是精原干细胞发育过程中起重要作用(张丽燕, 2014)；piwi基因不仅能决定青鳉(Oryzias latipes)生殖干细胞数量，甚至能控制生殖干细胞的迁移(Li et al, 2012)。

圆斑星鲽(Verasper variegates)俗称花斑宝，是一种冷温型的大型底栖鱼类，分布于我国北部的黄渤海和东海，具有食性范围广、生长速度快、抗病能力强、营养价值高、口味鲜美等特点，是优良的养殖品种。圆斑星鲽在生长过程中雌性个体的生长明显快于雄性个体，同龄雌雄个体的大小更是相差悬殊(谢忠明等, 2004)。鱼类性别决定机制研究有助于推动单性繁育技术的深入开展，目前，圆斑星鲽性别决定和生殖调控的分子机制仍不清楚，相关研究较少。柳学周等(2013)在圆斑星鲽脑中克隆到3种gnrh基因，认为sbgnrh可能是圆斑星鲽生殖调控的关键gnrh类型；张乐乐(2018)分离到2个性别相关基因(sox3和sox9)，sox3基因在卵巢特异性高表达，而sox9基因在精巢高表达，但在圆斑星鲽中尚未确定性别决定基因。在大菱鲆等鲽形目鱼类及其他模式生物中均发现，piwi基因在生殖细胞系发育、胚胎发育及雌雄性腺发育等过程中起着重要的作用，这种功能上的保守性在圆斑星鲽中是否存在值得进一步研究。

本研究通过RACE末端扩增技术得到Vvpiwil2基因的全长，分析其序列特征及编码的蛋白结构，并通过实时荧光定量PCR研究Vvpiwil2基因在各个发育时期的胚胎、仔稚鱼及雌雄成鱼不同组织的表达差异，旨在为阐明Vvpiwil2基因在性别分化和性腺发育过程中的作用奠定基础。

圆斑星鲽受精卵、仔稚鱼和成鱼均取自山东省烟台开发区天源水产有限公司。收集不同发育时期的胚胎和仔稚鱼若干，单细胞期(卵裂前胚盘隆起时期)(0 h)、2细胞期(4 h)、8细胞期(10 h)、16细胞期(12 h)、32细胞期(13 h)、桑椹期(18 h)、高囊胚期(20 h)、低囊胚期(26 h)、原肠早期(27 h)、原肠中期(29 h)、原肠晚期(77 h)、神经胚期(98 h)、晶体形成期(136 h)、心跳出现期(163 h)、孵化前期(188 h)、脱膜孵化期(197 h)的胚胎及孵化后5、10、20、30、45、58、68、78、92 d的仔稚鱼，其中，受精卵孵化水温保持在(8.0± 0.5)℃，DO≥6 mg/L，pH为8.0左右，微量充气。仔鱼孵出后，移入水泥池培育，随着其生长发育，活动能力不断增强，充气量也应逐渐增大。初孵仔鱼的培养温度为(8.0±0.5)℃，以后逐日升高0.5℃，直至(12.0±0.5)℃稳定培育。再分别采取雌雄成鱼各3尾[体长(24.0±0.5) cm，体重(330±20) g]的不同组织(脑、眼、鳃、心、肝、肠、脾、性腺、肾及肌肉)。以上样品均迅速放入装有RNA later试剂的离心管中，将离心管放入液氮中冷冻，然后转到−80℃冰箱保存，用于总RNA的提取。

本实验采用Trizol法分别提取圆斑星鲽各个发育时期的胚胎、仔鱼及雌雄鱼不同组织的总RNA，用紫外分光光度计(NanoDrop 2000 Thermo Scientific)和1.2%琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的浓度及质量。cDNA利用反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)合成，RACE-cDNA利用SMART^TM RACE cDNA Amplification RACE (TaKaRa)试剂盒合成。

从本实验室构建的转录组数据库中查找比对获得Vvpiwil2基因部分序列，利用Primer 5.0设计引物Vvpiwil2-S1和Vvpiwil2-A1(表 1)，对该cDNA序列进行验证，以圆斑星鲽成鱼性腺组织的cDNA为模板进行扩增。PCR反应体系(20 µl)为：Premix Taq^TM (LA Taq^TM Version 2.0) 10 µl、Vvpiwil2-S1(10 µmol/L) 0.8 µl、Vvpiwil2-A1(10 µmol/L) 0.8 µl、cDNA (1 µg/µl) 1 µl及ddH₂O 6.4 µl。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并在紫外线下切胶，之后，用SanPrep柱式DNA凝胶回收试剂盒、pMD18-T Vector试剂盒(TaKaRa)和DH5α进行纯化、连接与转化培养，挑取阳性单克隆，经菌落PCR鉴定后，筛选目的菌液送至华大基因进行测序，测序结果与原始Vvpiwil2基因cDNA序列进行比对，确定为Vvpiwil2基因的核心序列。之后根据Vvpiwil2基因的核心序列设计特异性引物Vvpiwil2- 3'GSP-1、Vvpiwil2-3'GSP-2、Vvpiwil2-5'GSP-1及Vvpiwil2- 5'GSP-2，利用巢式PCR反应获得目的片段，PCR反应体系(20 µl)：Premix Taq^TM(LA Taq^TM Version 2.0) 10 µl、3'或5'特异性引物0.8 µl、UPM 0.8 µl、RACE- cDNA 1 µl及ddH₂O 6.4 µl。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。将目的片段进行切胶回收、纯化、连接、转化、挑取阳性单克隆，最终将经过菌落PCR鉴定的目的菌液送到华大基因公司测序。

表 1(Tab.1)

表 1 本研究所使用的引物 Tab.1 Nucleotide sequences of the PCR primers used in this study 引物Primers 序列Sequences (5'~3') 目的Purpose Vvpiwil2-S1 ATAACGATTGGCTCAAACCACA 核心验证 Vvpiwil2-A1 TTTGCTTTCCTCCGGGCTT 核心验证 Vvpiwil2-3’GSP-1 TGGCATTGAGTGGAACAAGTCG RACE Vvpiwil2-3’GSP-2 ATCACAATCAAAGAGATGGACC RACE Vvpiwil2-5’GSP-1 CTTGATGCCAGTTGAATAGCCT RACE Vvpiwil2-5’GSP-2 CTGAGCACCACATTGTAGAAAG RACE UPM-long CTAATACGACTCACTATAGGGCAA GCAGTGGTATCAACGCAGAGT RACE通用引物 UPM-short CTAATACGACTCACTATAGGGC RACE通用引物 NUP AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT RACE通用引物 Vvpiwil2-S2 CGGGTCACCGTCTATTT 全长验证 Vvpiwil2-A2 GTCATTCTCTTCTTTCTGC 全长验证 Vvpiwil2-RT-S CAAGCAGACAGACGGAG qPCR Vvpiwil2-RT-A CATCCATCAAAGTGAAGGT qPCR β-actin-S TTCTGGTGATGGTGTGAC qPCR β-actin-A GTGGTGGTGAAGGAGTAG qPCR M13-S CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 菌落PCR M13-A GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 菌落PCR

表 1 本研究所使用的引物 Tab.1 Nucleotide sequences of the PCR primers used in this study

使用软件Contig Express对Vvpiwil2基因的测序结果进行拼接、验证，利用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi)预测Vvpiwil2基因的开放阅读框。利用ExPASy(https://web.expasy.org/compute_pi/)、SMART(http://smart.emblheidelberg.de/)、Signal4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在线生物学软件分析Vvpiwil2编码蛋白的基本物理性质、信号肽、跨膜结构及结构域。用NCBI搜索同源蛋白序列，并使用DNAMAN软件对其进行蛋白序列的多重比较，利用MEGA5.2(Tamura et al, 2011)软件，采用邻接法(Neighbor-joining)构建系统进化树。

根据Vvpiwil2基因的核心序列，利用Primer 5.0设计荧光定量特异性引物Vvpiwil2-RT-A/S，β-actin-A/S作为内参，以不同发育时期的胚胎、仔稚鱼及雌雄成鱼的不同组织的cDNA为模板，使用Applied Biosystems^TM 7500 Real Time PCR instrument定量仪，采用2^–∆∆Ct的计算方法分析Vvpiwil2基因的相对表达量。20 μl反应体系: SYBR Premix Ex Taq(2×) 10 µl、ROX Reference Dye Ⅱ (50x) 0.4 µl、RT-piwil2-S (10 μmol/L) 0.8 µl、RT-piwil2-A (10 μmol/L) 0.8 µl、cDNA(50ng/µl) 2 µl及ddH₂O 6 µl，反应程序：95℃ 10 min；95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环；95℃ 15 s；60℃ 1 min；95℃ 15 s。

数据处理为Vvpiwil2基因相对表达量的平均值±标准误(Mean±SE)，生物学重复n=3。使用SPSS 20.0软件对实时荧光定量PCR结果进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan多重比较，P < 0.05表示差异显著，并用OriginPro 2017软件作图。

克隆得到基因全长为3872 bp，将其命名为Vvpiwil2，其开放阅读框(ORF)长为3192 bp，编码1063个氨基酸，5'-UTR和3'-UTR分别长140 bp和540 bp。经过ExPASy、SMART、Signal4.1和NCBI在线生物学软件分析，推断Vvpiwil2的1063个氨基酸分子量为118.6 kDa，理论等电点为9.02，无跨膜结构及信号肽，有3个结构域，分别为428~473位46个氨基酸的ArgoL1结构域、477~616位140个氨基酸的PAZ结构域及602~1046位445个氨基酸的PIWI结构域(图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 Vvpiwil2基因cDNA序列全长及其编码的氨基酸序列 Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of Vvpiwil2 起始密码子ATG和终止密码子TGA均用黑色阴影标出，PolyA用下划线标出，ArgoL1结构域、PAZ结构域及PIWI结构域分别用双线边框、单线边框及灰色阴影标出 Start codon (ATG) and stop codon (TGA) are marked with dark shadow, and PolyA is marked with underline. The ArgoL1, PAZ and PIWI domains are separately marked with double lines border, single line border and gray shadow

利用在线软件NCBI blastx，对本研究中得到的Vvpiwil2氨基酸序列与其他物种的piwi基因编码的氨基酸序列进行比对，结果显示，该氨基酸序列与牙鲆同源性最高(92%)，其次是尖吻鲈(Lates calcarifer) (84%)、黄尾(Seriola lalandi)(84%)、大菱鲆(79%)、半滑舌鳎(79%)、尼罗罗非鱼(78%)、黄鳝(76%)。利用DNAMAN软件对不同物种的氨基酸序列进行比对，结果显示(图 2)，包括圆斑星鲽在内的鱼类均含有保守的PAZ结构域和PIWI结构域。利用MEGA 5.2软件对piwil2基因编码的氨基酸序列进行系统进化分析。所选物种包括牙鲆(XP_019949653.1)、尖吻鲈(XP_018524808.1)、黄尾(XP_023249908.1)、大菱鲆(AQY15996.1)、黄鳝(XP_020445956.1)、尼罗罗非鱼(XP_003445710.1)、半滑舌鳎(NP_001281165.1)、斑马鱼(ACH96370.1)、青鳉(NP_001153909.1)、人(Homo sapiens)(NP_060538.2)、小鼠(NP_067283.1)及爪蟾(Xenopus tropicalis)(NP_001106470.1)。结果显示(图 3)，包括圆斑星鲽在内的鱼类聚为一个大支，其中，圆斑星鲽与牙鲆在进化上关系最近，其次是大菱鲆，随后是鲈形目鱼类等；哺乳类、鸟类及两栖类聚为一个大支。

图 1(Fig. 1)

图 2 Vvpiwil2基因编码氨基酸与其他物种piwil2基因编码氨基酸的多序列比对 Fig.2 Amino acid sequences alignment of Vvpiwil2 gene with other species 黑色边框为PZA结构域，红色边框为PIWI结构域 各物种piwil2基因序列登录号：牙鲆(XP_019949653.1)、尖吻鲈(XP_018524808.1)、黄尾(XP_023249908.1)、大菱鲆(AQY15996.1)、黄鳝(XP_020445956.1)、尼罗罗非鱼(XP_003445710.1)、半滑舌鳎(NP_001281165.1) Black frame: PZA domain; Red frame: PIWI domain The GenBank accession numbers of piwil2 gene are followed: Paralichthys olivaceus (XP_019949653.1), Lates calcarifer (XP_018524808.1), Seriola lalandi (XP_023249908.1), Scophthalmus maximus (AQY15996.1), Monopterus albus (XP_020445956.1), Oreochromis niloticus (XP_003445710.1), Cynoglossus semilaevis (NP_001281165.1)

图 1(Fig. 1)

图 3 piwil2氨基酸序列NJ进化树 Fig.3 NJ phylogenetic tree for amino acid sequences of piwil2 各物种piwil2基因序列登录号：牙鲆(XP_019949653.1)、尖吻鲈(XP_018524808.1)、黄尾(XP_023249908.1)、大菱鲆(AQY15996.1)、黄鳝(XP_020445956.1)、尼罗罗非鱼(XP_003445710.1)、半滑舌鳎(NP_001281165.1)、斑马鱼(ACH96370.1)、青鳉(NP_001153909.1)、人(NP_060538.2)、小鼠(NP_067283.1)、及爪蟾(NP_001106470.1) The GenBank accession numbers of piwil2 gene are following: Paralichthys olivaceus(XP_019949653.1), Lates calcarifer (XP_018524808.1), Seriola lalandi (XP_023249908.1), Scophthalmus maximus(AQY15996.1), Monopterus albus (XP_020445956.1), Oreochromis niloticus(XP_003445710.1), Cynoglossus semilaevis(NP_001281165.1), Danio rerio (ACH96370.1), Oryzias latipes(NP_001153909.1), Homo sapiens(NP_060538.2), Mus musculus(NP_067283.1), Xenopus tropicalis (NP_001106470.1)

通过实时荧光定量PCR研究Vvpiwil2基因在胚胎发育中的表达量。结果显示(图 4)，Vvpiwil2基因在整个胚胎发育阶段都有表达，从发育早期开始直到高囊胚期都大量表达，之后呈下降趋势，直至孵化阶段。研究Vvpiwil2基因在仔鱼不同发育时期中的表达量，结果显示(图 5)，Vvpiwil2基因在68 d时的表达量显著高于其他时期(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 4 Vvpiwil2基因在胚胎发育不同阶段中的表达 Fig.4 Relative expression characterization of Vvpiwil2 gene at different development stages of the embryo 1:单细胞期; 2: 2细胞期; 8: 8细胞期; 16: 16细胞期; 32: 32细胞期; M:桑椹胚期; Hb:高囊胚期; Lb:低囊胚期; Eg:原肠早期; Mg:原肠中期; Lg:原肠晚期; N:神经胚期; El:晶体形成期; Hp:心跳出现期; Bh:孵化前期; H:脱膜孵化 不同字母间表示差异显著(P < 0.05)，下同 1: 1-cell stage; 2: 2-cell stage; 8: 8-cell stage; 16: 16-cell stage; 32: 32-cell stage; M: Morula stage; Hb: High blastula; Lb: Low blastula; Eg: Early gastrula; Mg: Mid gastrula; Lg: Late gastrula; N: Neurula stage; El: Formation of eye len; Hp: Heart pulsation; Bh: Before the hatch; H: Hatching Different letters indicate significant difference (P < 0.05), the same as below

图 1(Fig. 1)

图 5 Vvpiwil2基因在不同发育时期仔鱼中的表达 Fig.5 Relative expression characterization of Vvpiwil2 gene at the different stages of the larvae

通过实时荧光定量PCR研究Vvpiwil2基因在雌雄成鱼各个组织的表达量，结果见图 6。Vvpiwil2基因在雌雄成鱼的各个组织中均有表达。在雄鱼中，Vvpiwil2基因在精巢的表达量显著高于其他组织(P < 0.05)；在雌鱼中，Vvpiwil2基因在卵巢的表达量也显著高于其他组织(P < 0.05)。雌雄成鱼之间进行比较可以发现，Vvpiwil2基因在卵巢中的表达量显著高于精巢(P < 0.05)；此外，雄性成鱼的脑、眼的表达量高于雌性成鱼，雌性成鱼的心脏、肝的表达量高于雄性成鱼。

图 1(Fig. 1)

图 6 Vvpiwil2基因在不同组织中的表达 Fig.6 Relative expression characterization of Vvpiwil2 gene in various tissues Br:脑; Ey:眼; Gi:鳃; He:心脏; Li:肝脏; In:肠; Sp:脾; Go:性腺; Ki:肾; Mu:肌肉 Br: Brain; Ey: Eye; Gi : Gill; He: Heart; Li: Liver; In: Intestines; Sp: Spleen; Go: Gonad; Ki: Kidney; Mu: Muscle

本研究从实验室构建的圆斑星鲽转录组数据库中查找比对获得Vvpiwil2基因部分序列，通过RACE末端扩增技术获得piwil2基因，将其命名为Vvpiwil2，基因全长为3872 bp，ORF长为3192 bp，编码一个由1063个氨基酸组成的多肽。同源性比对结果显示，包括圆斑星鲽在内的鱼类均含有保守的PAZ结构域和PIWI结构域，表明Vvpiwil2基因表达的蛋白具有结合小分子RNA的潜力。分子系统进化树分析显示，圆斑星鲽与硬骨鱼类单独聚成了一支，Houwing等(2014)的研究显示，斑马鱼zili基因在生殖细胞分化中起重要作用，Li等(2012)研究表明，在青鳉中piwi基因不仅能决定生殖干细胞数量，甚至能控制生殖干细胞的迁移。在进化树中，圆斑星鲽与鲽形目中的牙鲆、大菱鲆及半滑舌鳎关系较近，大菱鲆piwil2基因可能在胚胎和雌雄性腺发育中发挥重要作用，而半滑舌鳎piwil2基因在雄性精子发生过程中起关键作用，特别是在精原干细胞发育的过程中起重要作用。基于系统进化分析，推测Vvpiwil2基因在圆斑星鲽可能具有相似的功能，即在生殖细胞系发育、胚胎发育及雌雄性腺发育等过程中发挥作用。

利用实时荧光定量PCR技术对Vvpiwil2基因在胚胎发育不同阶段的表达模式进行了分析。结果显示，该基因在整个胚胎发育期间都有表达，从发育早期直到高囊胚期都呈高表达，之后开始呈下降趋势，直至孵化阶段，这一表达模式与斑马鱼(Tan et al, 2002)、青鳉(李名友, 2008)相似。从卵裂开始至囊胚时期的发育阶段主要受细胞质成分引导，一直到卵裂较晚的原肠早期，胚胎mRNA才大量转录合成，实现由母源型向合子型的过渡，因此，认为Vvpiwil2基因是母源性基因。研究Vvpiwil2基因在不同发育时期仔鱼中的表达量，结果显示，Vvpiwil2基因在仔鱼68 d时的表达量显著高于其他发育时期。张乐乐(2018)研究表明，圆斑星鲽仔鱼在60日龄左右性腺开始分化，幼鱼出现卵巢腔，与本研究中Vvpiwil2基因表达量显著上升的时间接近，表明Vvpiwil2基因可能在圆斑星鲽的性别分化过程中发挥功能。张丽燕(2014)研究表明，piwil2基因不是性别分化的相关基因，半滑舌鳎的piwil2基因与雄鱼精子发生相关，主要作用于精子发生的早期阶段，而非性别分化期，表明piwil2基因的功能存在一定的种间差异。

利用实时荧光定量PCR对雌雄鱼中Vvpiwil2基因的表达模式进行了分析。结果显示，Vvpiwil2基因在精巢与卵巢中的表达量均显著高于其他组织，与大菱鲆(Wang et al, 2017)、半滑舌鳎(张丽燕, 2014)、斑马鱼(Tan et al, 2003)及青鳉(Zhao et al, 2012)的piwi同源基因表达相似，与人和鼠等哺乳动物仅在精巢中特异表达不同(Zeeman, 2002; Beyret et al, 2011)。Vvpiwil2基因在圆斑星鲽卵巢中的表达量显著高于精巢，说明Vvpiwil2基因可能在卵巢功能的维持中发挥重要作用。这一结果与大菱鲆中的表达相似，但在半滑舌鳎、斑马鱼等研究中，piwil2基因在精巢的表达量显著高于卵巢，再次表明piwil2基因的功能在不同种类间存在一定差异。本研究还发现，Vvpiwil2基因在脑、眼、鳃、心脏、肝、肠、脾、肾及肌肉组织中均有表达，并且雄鱼的脑、眼的表达量高于雌鱼，雌鱼的心脏、肝的表达量高于雄鱼。李名友(2008)研究发现，在青鳉中Opiwi不仅在性腺组织中大量表达，在眼和脑组织中也有表达；Tao等(2016)研究发现，罗非鱼piwil1和piwil2除在性腺中大量表达外，在骨骼肌中也有表达；Wang等(2017)研究发现，在大菱鲆中piwil2还在肌肉、鳃和肾脏在内的体细胞组织中表达，认为Piwi蛋白不仅在生物生殖发育过程中是必需的，而且在体细胞组织中也发挥重要功能；张丽燕等(2014)研究发现，半滑舌鳎piwil2基因在脾脏、肝脏、心肌、肠、脑、皮肤、肾脏、肌肉、鳃及血液中也有微量表达。本研究也表明，Vvpiwil2基因不仅在性别分化等生殖发育过程中发挥作用，而且在其他的生命过程中也具有重要功能。关于Vvpiwil2基因在圆斑星鲽雄鱼的脑、眼的表达量高于雌鱼，雌鱼的心脏、肝的表达量高于雄鱼这一结论，尚未在其他相关物种中发现相似观点，仍需要进一步研究。

本研究以圆斑星鲽性腺为模板，扩增得到了piwil2基因全长，并将其命名为Vvpiwil2。在线保守结构域分析显示，Vvpiwil2基因具有PIWI亚家族典型的PAZ结构域和PIWI结构域。利用实时荧光定量PCR技术对圆斑星鲽不同发育时期胚胎、仔稚鱼的表达模式进行了分析。结果显示，Vvpiwil2基因为母源性基因，可能与圆斑星鲽性腺分化过程相关。组织表达分析发现，Vvpiwil2基因在雌雄成鱼性腺中的表达量显著高于其他组织中，卵巢中的表达量显著高于精巢，推测Vvpiwil2基因可能在卵巢功能的维持中发挥重要作用。本研究结果为解析圆斑星鲽性别决定机制提供了新的靶标基因，为建立全雌化苗种繁育技术奠定了理论基础。