2. 上海海洋大学水产与生命学院 上海 201306;
3. 连云港市启明水产有限公司 连云港 222100
2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306;
3. Lianyungang Qiming Aquculture Ltd, Lianyungang 222100
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国对虾养殖业中占据比重最大、产业化发展程度最高的对虾养殖种类。近年来，对虾养殖业存在多种病原传播，导致养殖中不断出现急性或慢性死亡、生长停滞、摄食减少等，使养殖业的可持续健康发展面临严重的威胁(Crab et al, 2012; Bachère, 2000; Lafferty et al, 2015)。在应对病害威胁中，养殖过程中的药物滥用，影响了养殖产品安全，引起了社会的关注和忧虑，探索可持续的健康养殖模式成为养殖业发展的迫切需求。
益生菌为活体微生物制剂，可以促进养殖动物的健康和生长，近年来，其应用得到迅猛发展，受到广大水产养殖者的关注。益生菌的作用包括提供营养物质、分泌分解酶促进消化吸收、分泌拮抗物或争夺生态位抑制有害微生物、降解养殖废物改善水质、激发机体的非特异性免疫提高抗病力等(楼丹等, 2009)，是一类可替代药物的绿色饲料添加剂，在斑节对虾(Penaeus monodon)(Moriarty, 1998)、日本对虾(Marsu- penaeus japonicas)(Zhao et al, 2012)和凡纳滨对虾(Ziaei-Nejada et al, 2006; 胡毅等, 2008; Rengpipat et al, 2000; Lin et al, 2005; 王志杰等, 2015)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)(王福强等, 2005)等的养殖中均获得了较好的结果。
研究表明，假交替单胞菌(Pseudoalteromonas spp.)是海水养殖环境中经常出现的一类细菌，该类细菌能够分泌多种胞外的生物活性物质，多具有抗细菌、抗真菌、溶藻等活性(Rodrigues et al, 2015; Isnansetyo et al, 2009; 梁静娟等, 2014; 席宇等, 2005; Holmstr m et al, 1998、1999; Bowman, 2007; Chen et al, 2010; Lucas-Elio et al, 2005)。微小杆菌(Exiguobacterium spp.)是农业常用到的益生菌，主要用来杀灭土壤中的有害真菌(张莹等, 2013; Selvakumar et al, 2009; Bharti et al, 2013; Dastager et al, 2010)，该类菌有较高的胞外蛋白酶活性，目前，没有发现对动物或人类有致病作用，可以作为有益微生物。已有研究显示，分离自海底沉积物中的微小杆菌SWJS2有金属蛋白酶活性，所提取的蛋白酶对鱼蛋白具有酶解活性((Lei et al, 2016; 赵谋明等, 2014)；海洋中分离的微小杆菌CFR26M能分泌胞外蛋白酶，同时，产生抗氧化物质(Kumar et al, 2014)。
前期研究中，作者分离鉴定到1株假交替单胞菌KL-3 2010和1株微小杆菌KL-C2 2014，确认这2株菌对凡纳滨对虾没有致病作用。本研究用上述2株菌的菌液浸润颗粒饲料后饲喂带病原的凡纳滨对虾幼虾，观察对虾的存活、生长、非特异性免疫力和肠道菌群的变化，以期为益生菌防控对虾病害提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验对虾凡纳滨对虾于2016年8月28日购于江苏连云港赣榆某对虾养殖场，暂养于自建的φ80 cm × 150 cm的室内圆形水泥池中，平均体重为(0.42±0.02) g。
1.1.2 实验用菌假交替单胞菌KL-3 2010，2010年10月分离自山东昌邑健康大菱鲆(Scophthalmus maximus)鱼苗肠道，保存于-80℃冰箱；微小杆菌KL-C2 2014于2014年10月分离自江苏赣榆对虾养殖池塘的底泥，保存于-80℃冰箱；致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)VPAHPND 20130629002S01、芽孢杆菌(Bacillus sp.) KL-Y 2013、酵母菌(Saccharomyces sp.) KL-5 2016均为本实验室分离，保存于-80℃冰箱。
1.2 实验方法 1.2.1 实验用菌制备分别将冰箱保存的假交替单胞菌KL-3 2010和微小杆菌KL-C2 2014菌种复苏，经在2216E平板上划线活化，挑取单菌落接种于2216E海水液体培养基，于28℃摇床振荡培养过夜，采用涂布平板计数法确定菌浓度约为1011 CFU/ml。
1.2.2 2株菌对VPAHPND 20130629002S01的拮抗实验在2216E液体培养基中培养VPAHPND 20130629002S01，取100 μl 1.0×107 CFU/ml菌液涂布于新鲜的2216E固体培养基平板上，用无菌镊子夹取5片φ6 mm的无菌滤纸片等距离放置在涂布VPAHPND 20130629002S01的平板上，分别取8 μl假交替单胞菌KL-3 2010和微小杆菌KL-C2 2014的新鲜菌液滴于滤纸片上，28℃培养24 h后观察抑菌圈。
1.2.3 2株菌的蛋白酶活性检测配制酪蛋白平板(Dang et al, 2009)，用无菌镊子夹取4片φ6 mm无菌滤纸片在平板上等距离放置，分别取8 μl假交替单胞菌KL-3 2010和微小杆菌KL-C2 2014的新鲜菌液滴于滤纸片上，28℃培养24 h后观察透明圈。用芽孢杆菌KL-Y 2013和酵母菌KL-5 2016作为对照菌株。
1.2.4 2株菌的生物安全性取凡纳滨对虾270尾，设置对照组和2个实验组，每组3个重复，每个重复均为30尾，养在10 L盐度为20的海水中；实验组水体分别加入新鲜的假交替单胞菌KL-3 2010和微小杆菌KL-C2 2014菌液，使终浓度为1.0×108 CFU/ml，观察72 h，记录对虾的活动及存活状况。
1.2.5 实验用饲料的制作市售0号和1号对虾颗粒饲料(正大集团有限公司)，含35%蛋白，粒径分别是0.5~1.0 mm和1.2 mm，室温保存。以上饲料中以料液比1:0.5 (W/g:V/ml)添加假交替单胞菌KL-3 2010(P饲料)或微小杆菌KL-C2 2014(E饲料)菌液，使饲料中最终含菌量为1011 CFU/g左右，室温浸润10 h作为实验组用饲料。对照组饲料为按照料液比1:0.5(W/g:V/ml)将0号和1号颗粒饲料与无菌2216E液体培养基混合，于室温浸润10 h(C饲料)。
1.2.6 实验对虾的病原检测随机取实验对虾30尾，分为2个样品进行合并检测，使用无菌手术刀片切取对虾肝胰腺、鳃丝和肌肉组织，放入95%乙醇(3倍体积)内保存。送至实验室后，使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根)和RNAiso Plus(TaKaRa)分别提取保存组织的总DNA和总RNA，分别按OIE (2016)和Tourtip等(2009)的方法对对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、虾肝肠胞虫(EHP)、致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(VPAHPND)、桃拉综合征病毒(TSV)、黄头病毒(YHV)、传染性肌坏死病毒(IMNV)和偷死野田村病毒(CMNV) (Zhang et al, 2014)进行PCR检测。
1.2.7 实验分组及养殖管理在江苏赣榆某室内对虾养殖场随机取实验对虾1680尾，分别置于12个φ80 cm ×150 cm的圆形水泥池，水体为0.5 m3，每个池子放置140尾。在正式分组饲喂开始之前，进行15 d暂养，并在暂养期间取样，对其可能携带的病原进行检测。
实验设P组、E组、PE组和空白对照C组，每组3个平行。实验对虾每天投喂3次(07:00、13:00和19:00)，投喂量为对虾体重的3%~5%(随养殖时间而增加)。其中，C组投喂C饲料；P组以6 d为周期，前3 d投喂P饲料，后3 d投喂C饲料；E组以6 d为周期，前3 d投喂E饲料，后3 d投喂C饲料；PE组以6 d为周期，前3 d每餐等量交替投喂E饲料和P饲料，后3 d连续投喂C饲料。前30 d投喂0号饲料，后30 d投喂1号饲料，养殖实验进行60 d。每隔2 d换水1次，换水量约30%，水体温度为(26±2)℃，盐度为15±1，pH 8.1±0.1，连续充气，每天检查对虾摄食及存活情况，及时取出死亡对虾。
1.2.8 生长指标测定养殖过程中，每隔15 d每组每个重复取20尾，快速称重后再放回原池，计算特定生长率；养殖结束时，记录各组对虾存活数量，测量各组对虾初始和实验结束时的体重，计算各组对虾的存活率和生长率；统计各组对虾饲料投喂量，计算饲料系数。
存活率(Survival rate, SR)(%)=存活尾数/总尾数×100
特定生长率(Specific growth rate, SGR)(%/d) =[T(i+15)平均体重-Ti平均体重]/(Ti平均体重×15)×100
平均生长率(Average growth rate, AGR)(%/d)=(终末平均体重-初始平均体重)/(初始平均体重×60)×100
饲料系数(Feed conversion ratio, FCR)=摄食饲料量/(终末体重-初始体重)
1.2.9 肠道可培养优势菌分离鉴定在养殖实验的中后期(40、50和60 d)测定对虾肠道细菌优势菌群。测定方法参考李继秋等(2006)的方法，提前2 d从每组随机取8尾虾，置于新鲜海水中暂养，不投喂饲料，待排空肠道内容物后，无菌操作取对虾肠道，置于灭菌海水中清洗后匀浆，将肠道匀浆液梯度稀释，将各稀释度的肠道匀浆液涂布2216E平板，于28℃培养箱中培养24 h后，挑取各组平板中的优势菌落，进行分离纯化培养。
按水煮法(唐晔盛等, 2002)提取DNA作为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增(李筠等, 2006)；将产物送生工生物工程(上海)有限公司测序。
1.2.10 血淋巴取样及血淋巴免疫相关指标测定养殖实验结束后，对虾饥饿24 h后，每池取10尾对虾，用1 ml无菌注射器自对虾围心腔中抽取血淋巴，每组血淋巴液混合置于无菌离心管中，于4℃冰箱中静置过夜，3000 r/min离心10 min，取上层血清，置于-80℃超低温冰箱保存，待测。
酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和溶菌酶的活力以及总蛋白的浓度测定均采用测试盒(南京建成生物工程研究所)按说明书方法操作。其中，1个ACP活力单位为血清在37℃与底物作用30 min产生1 mg酚；1个SOD活力单位为反应液中SOD抑制率达50%；1个POD活力单位为37℃条件下每分钟催化产生1 μg的产物；溶菌酶活力单位为溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)在pH=6.4和37℃下经30 min裂解使570 nm处光吸收值下降的比率(Hultmark et al, 1980)。总蛋白浓度根据碱性条件下蛋白将Cu2+还原为Cu+后，与BCA试剂形成紫色络合物，在562 nm处吸光度与已知浓度蛋白标准曲线对应计算而得。
1.3 数据分析实验数据采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，P < 0.05为差异显著，若差异显著，则进行Duncan多重比较，显著性水平为P < 0.05。
2 结果 2.1 2株菌对VPAHPND 20130629002S01的拮抗作用假交替单胞菌KL-3 2010和微小杆菌KL-C2 2014用滤纸片法贴附于VPAHPND 20130629002S01涂布的平板，经24 h培养后，观察到KL-3 2010对VPAHPND 20130629002S01具有拮抗作用，抑菌圈直径为(10.42±0.23) mm，而KL-C2 2014对VPAHPND 20130629002S01没有显示拮抗效果(图 1)。
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图 1 假交替单胞菌KL-3 2010和微小杆菌KL-C2 2014对VPAHPND 20130629002S01的拮抗作用 Fig.1 Antagonism of Pseudoalteromonas sp. KL-3 2010 and Exiguobacterium sp. KL-C2 2014 against VPAHPND 20130629002S01 |
假交替单胞菌KL-3 2010和微小杆菌KL-C2 2014在酪蛋白平板上均能形成透明圈，对照菌株芽孢杆菌KL-Y 2013没有观察到透明圈，另一株对照菌株酵母菌KL-5 2016观察到透明圈。表明2KL-3 2010和2KL-C2 2014均具有胞外蛋白酶活性(图 2)。
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图 2 假交替单胞菌KL-3 2010和微小杆菌KL-C2 2014胞外蛋白酶活性 Fig.2 Extracellular protease activity of Pseudoalteromonas sp. KL-3 2010 and Exiguobacterium sp. KL-C2 2014 |
分别用1.0×108 CFU/ml的假交替单胞菌KL-3 2010和微小杆菌KL-C2 2014浸浴凡纳滨对虾72 h，未引起任何对虾死亡和异常表征，表明这2株菌对凡纳滨对虾无致病性。
2.4 实验用虾病原检测实验用凡纳滨对虾用PCR方法对多病原进行检测。结果显示，所用虾苗在第2轮PCR扩增中检出了VPAHPND、WSSV和EHP阳性，表明病原携带量较低，其中，WSSV和VPAHPND在2个合并样品中均只有1个出现阳性，EHP在2个合并样品中均出现了阳性；而IHHNV、TSV、YHV、IMNV和CMNV均为阴性(表 1)。
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表 1 实验用虾多种病原检测 Tab.1 Detection of multiple pathogens in experimental shrimp |
每15 d进行的特定生长率统计结果表明，投喂16~30 d各组对虾的特定生长率比0~15 d的有所提升，但前30 d内P、E和PE组对虾的特定生长率与对照组相比没有显著差异(P>0.05)；在第31~45天，对照组的特定生长率出现明显下降，P组和PE组与16~30 d基本保持同一个水平，而E组显著上升，各实验组对虾的生长速度显著高于对照组(P < 0.05)；在第46~60天，各组生长速度有不同程度的下降，但P组和E组的特定生长率仍然维持在较高的水平，并显著高于对照组(P < 0.05)(图 3)。
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图 3 投喂添加不同益生菌饲料过程中各组对虾特定生长率变化过程 Fig.3 Special growth rate of L. vannamei fed with diets with different probiotics addition C:投喂对照商品饲料; P:投喂添加假交替单胞菌KL-3 2010饲料(P饲料); E:投喂添加微小杆菌KL-C2 2014饲料(E饲料); PE:间隔投喂P饲料和E饲料；标注相同小写字母表示无显著差异(P>0.05)，标注不同小写字母表示有显著差异(P < 0.05)。下表同 C: fed with commercial feed; P: fed with Pseudoalteromonas sp. KL-3 2010 added feed (P feed); E: fed with Exiguobacterium sp. KL-C2 2014 added feed (E feed); PE: fed interruptedly with P feed and E feed. Columns marked with same lowercase mean no significant difference (P>0.05); different lowercases mean significant difference (P < 0.05). The same as in following tables |
养殖60 d后，对各组对虾体重、存活率和饲料系数进行统计。结果显示，对照组存活率仅为25.5%± 1.8%，而P组对虾存活率达79.3%±7.6%，比对照组提高了213%±43% (P < 0.01)；PE组对虾存活率为72.1%±10.1%，比对照组提高了184%±52% (P < 0.05)。对照组总平均生长率为(7.69±0.30)%/d；E组对虾总平均生长率为(15.78±1.76)%/d，比对照组提高了105.5%± 28.1%(P < 0.05)；PE组对虾总平均生长率为(13.10± 2.12)%/d，比对照组提高了70.6%±32.8% (P < 0.05)；P组对虾总平均生长率为(11.16±0.71)%/d，比对照组提高了45.3%±12.5% (P < 0.05)。
各实验组获得的单位水体产量与对照组比有显著差异(P < 0.05)(表 2)。从高到低依次为PE组(702.5± 64.2)、P组(626.7±97.6)、E组(422.7±67.6)和C组(138.2±10.8) g/m3，分别是对照组的511%±71%、456%± 92%和308%±63%；E组、PE组和P组的饲料系数分别是对照组的68.6%±9.2%、73.0%±5.1%和76.3%± 1.0%，有显著差异(P < 0.05)(表 2)。
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表 2 投喂添加不同有益微生物饲料的凡纳滨对虾生长、存活和生产特性 Tab.2 Growth, survival, and production properties of L. vannamei fed with diets with different probiotics addition |
养殖第40、50和60天时，取各组停喂2 d排空的对虾肠道，进行肠道内定植的优势菌培养和鉴定。结果显示，益生菌添加的颗粒饲料长期投喂改变了肠道内定植的优势菌群。在养殖40 d时，对照组对虾的肠道中定植菌量最少，无明显优势菌落，而P组肠道定植菌只有1株占绝对优势的副溶血弧菌，对该株副溶血弧菌进行了pirA和pirB基因检测，结果呈阴性，表明为非VPAHPND菌株；50 d时，P组肠道定植的优势菌除了副溶血弧菌还多了美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)，而E组和PE组肠道定植的优势菌则分别为施罗氏弧菌(Vibrio shilonii)和施瓦氏菌(Shewanella sp.)，次优势菌为美人鱼发光杆菌；在60 d时，对照组肠道定植有美人鱼发光杆菌和副球菌(Paracoccus sp.)2株优势菌；而P组的肠道定植优势菌是微杆菌；E组和PE组肠道定植优势菌均为欧文斯弧菌(Vibrio owensii)，且优势菌的密度要比对照组优势菌高2个数量级。其中，美人鱼发光杆菌是对照组和实验组都出现过的共同优势菌(表 3)。
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表 3 各实验组对虾肠道中定植的优势菌 Tab.3 Dominant bacteria colonized in midgut of the experimental shrimp |
在养殖实验结束后，对各组凡纳滨对虾血清免疫相关酶活力以及总蛋白浓度进行了测定，结果显示，P组和E组对虾的血清ACP、SOD和POD明显高于对照组(P < 0.05)；E组的ACP、POD、SOD和血清总蛋白浓度明显高于对照组(P < 0.05)；但PE组除了SOD明显高于对照组(P < 0.05)外，其他免疫指标均低于对照组(表 4)。
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表 4 不同有益菌添加饲料对凡纳滨对虾免疫的影响 Tab.4 Effect of different dietary probiotics on immunity of L. vannamei |
病害为当前对虾养殖业面临的主要问题之一。当前，多数养殖者缺少病原检测能力，使得携带病原的虾苗大量进入流通过程，给养殖者造成较大经济损失(黄倢等, 2016)。很多研究者开展的以健康虾苗为对象的益生菌应用报道中，对照组在存活率上不会受到实验对象本身携带病原所带来的死亡的影响，其对照组的存活率只略低于添加益生菌的实验组(胡毅等, 2008; 刘泓宇等, 2014; 王军等, 2015; 王玲等, 2011)，这种情况下，用存活率难以反映益生菌的应用对虾苗产生的保护效果。本研究在普通养殖场进行，对该养殖场仅能获得的凡纳滨幼虾检出WSSV、VPAHPND和EHP病原弱阳性，反映了当前生产中面临的实际问题。在这种背景下，对照组在养殖中表现出很低的存活率，而益生菌添加组在生长和存活方面均获得了显著的正向效果，尤其是添加了假交替单胞菌KL-3 2010的P组和PE组，其存活率比对照组提高了约2倍，这可能由于投喂的假交替单胞菌KL-3 2010可以分泌对VPAHPND有抑制作用的活性物质，使得携带VPAHPND的虾苗体内的病原没有机会繁殖暴发，从而获得比对照组显著提高的存活率。这为目前普遍携带VPAHPND的虾苗养殖中益生菌的开发和应用提供了更接近生产实际的实例。
已有研究表明，饲喂益生菌后，对虾肠道消化酶活性得到提高，显著促进对虾生长(Ziaei-Nejada et al, 2006; 胡毅等, 2008; 丁贤等, 2004)；饲料中添加单一益生菌或多种益生菌，均可在一定程度上改变对虾肠道菌群而影响其消化，从而影响其生长特性(李桂英等, 2013)。本研究中，添加益生菌的实验组生长率比对照组均显著提高，尤其是添加了微小杆菌KL-C2 2014的实验组，其特定生长率成倍提高，推测这一方面由于实验对象携带可导致对虾生长缓慢的EHP (刘珍等, 2016; 刘亚梅等, 2017)，而使对照组特定生长率从养殖中期开始出现显著下降(图 3)；另一方面，由于实验组投喂的2株益生菌分泌的胞外活性物质，包括各种抗菌物质和酶活性物质，改变了对虾肠道环境，直接或间接地影响了肠道菌群的组成，促进了对虾消化吸收，从而获得了显著提高的生长率。其中，添加微小杆菌KL-C2 2014的E组对虾特定生长率在整个养殖过程中都保持上升趋势(图 3)，直到养殖末期获得最高的平均生长率(表 2)，这可能与其分泌胞外蛋白酶和产生抗氧化物质有关(Kumar et al, 2014)，其机理有待于进一步研究。该结果提示以上2株益生菌的使用可以为目前普遍存在的EHP阳性虾苗的生长难题提供一种可替代药物的解决方案。
Tannock(1998)研究表明，对肠道环境遭到破坏的动物通过饲喂有益微生物可以重新建立宿主正常的微生物群落。本研究饲喂添加益生菌的饲料60 d后，对虾肠道定植的可培养优势菌落中没有检测到所饲喂的2株益生菌，这可能是由于它们不适合对虾肠道环境生长繁殖，在2 d的停喂排空后，被其他易在肠道中定植的菌群取代。但这2株益生菌分泌的某些胞外产物及菌体本身可能在长期投喂中改变了肠道内环境，使得实验组对虾肠道定植的优势菌群与对照组相比产生显著差异。该结果表明，外源添加益生菌即使不能在肠道内优势定植，也可能通过改变宿主肠道环境而影响肠道定植的优势菌群结构，这种现象在其他一些对虾益生菌的研究报道中也被证实(郝凯, 2013; 胡毅等, 2008; 李桂英等, 2013)。
益生菌具有良好的免疫刺激作用，其作用机理可能是通过细菌本身或细胞壁成分刺激非特异性免疫系统使其发挥作用，从而提高动物免疫力(Rengpipat et al, 2000; 雷质文等, 2001; Stephensen et al, 1996; Thompson et al, 1995)。本研究中的P组和E组各项免疫指标都高于对照组，而PE组免疫指标除了SOD显著高于对照组，其他免疫指标都低于对照组(表 4)，但其存活率和生长率却显著高于对照组并介于P组和E组之间。以上结果提示，本研究所检测的几项免疫指标当中，SOD的水平可能在对虾抗病力和生长方面具有一定的指示性意义。
目前，对虾益生菌饲料添加多使用芽孢杆菌并以健康虾为对象，其实验组对虾在生长和存活方面与对照组相比都没有显著差异(胡毅等, 2008; 刘泓宇等, 2014; 王军等, 2015; 王玲等, 2015)。本研究以携带病原的虾苗为实验对象，使用1株假交替单胞菌和1株微小杆菌添加饲料投喂60 d，实验组获得了极显著的促生长和存活的效果，最终单位水体产量是对照组的3~5倍。其中，假交替单胞菌KL-3 2010主要与存活率的提高相关联；微小杆菌KL-C2 2014主要与促生长相关联。该结果可以为目前携带可导致死亡的VPAHPND和导致生长缓慢的EHP的虾苗的养殖提供一种可替代药物的病害防治措施。
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