2. 中国科学院大学 北京 100049;
3. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部海水养殖病害防治重点实验室 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 青岛 266071
2. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049;
3. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071
近年来，中国水产养殖业发展迅速，已成为国民经济的重要组成部分，但随着养殖规模的扩大，水产病害也越来越严重，成为制约中国水产业发展的一个重要因素。据统计，2017年水产养殖因病害造成的直接经济损失达约361亿元，在监测到的96种病原中，细菌性疾病种类占了46种(张显良等, 2018)。中国海水养殖地域范围分布广，从辽宁到海南的纬度跨度达23°，同时，养殖品种多，导致不同地区养殖病害种类复杂，极大地增加了病害防控的难度。鲆鲽类是中国海水养殖的重要品种，在辽宁、河北、山东、江苏等多个省份均有养殖。对养殖鲆鲽类进行流行病学调查，可为中国水产流行病学的监控提供基础数据，并可进一步有针对性地对细菌性病害进行防治，对中国水产事业的发展有重要意义。
水产养殖动物的病原主要有细菌、病毒、真菌和寄生虫四大类。其中，细菌性疾病是鱼类中最为常见且是危害最大的一类疾病。现已报道的海水鱼类细菌病原超过40种，包括弧菌(Vibrio)、爱德华氏菌(Edwardsiella)、气单胞菌(Aeromonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、屈桡杆菌(Flexibacter)、巴斯德氏菌(Pasteurella)、肾杆菌(Renibacterium)、链球菌(Streptococcus)、分枝杆菌(Mycobacterium)和诺卡氏菌(Nocardia)等(Austin et al, 2007; Fryer et al, 1993)。
目前，16S rRNA基因的高通量测序在环境细菌组成分析研究中已得到广泛应用，通过提取、扩增和分析水体、鱼体表和组织的总DNA，对16S rRNA基因进行扩增、测序和比对，判断细菌的种类组成，并可获得大量的非可培养细菌的数据。16S rRNA是高度保守的分子，又有中度保守和高度变化的序列区域，适合于研究进化距离不同的各类原核生物的亲缘关系，目前已广泛应用于细菌的分类研究(东秀珠等, 2001; Borrell et al, 1997)。但由于病原需要通过柯赫氏法则进行确定，因此，在病原的鉴定过程中，分离培养依旧是不可缺少的一部分。鲆鲽类是中国重要的海水养殖品种，本实验室自1999年以来，开展了海水养殖鲆鲽类病害调查，从江苏、山东、河北、天津等沿海养殖场的发病鱼分离收集菌株。本研究通过分析分离菌株的16S rRNA基因序列，对其进行分类，并对其中的鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌进行致病性检验，以期对中国海水养殖鲆鲽类的细菌性病原种类有深入的了解，为病害控制提供基础资料。
1 材料与方法 1.1 菌株来源本研究所用菌株为1999~2012年从江苏、山东、河北、天津等沿海地区海水养殖场发病鲆鲽类内脏分离纯化(表 1)，用甘油保存于-80℃冰箱中。
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表 1 分离菌株16S rRNA基因序列在GenBank核酸数据库BLAST分析 Tab.1 BLAST analysis of 16S rRNA gene sequences in GenBank Nucleotide Database |
取保存于-80℃冰箱的菌株在胰大豆蛋白胨平板(TSA)划线，28℃培养24~36 h，挑取单一菌落悬浮于50 μl无菌蒸馏水，在100℃水浴5 min裂解细胞，离心沉淀细胞碎片，取上清液作为细菌DNA模板。以细菌16S rRNA基因通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTT GTTACGAC TT-3')进行PCR扩增(Lane, 1991)。50 μl PCR反应体系：5 μl 10×Taq buffer，1 μl 2.5 mmol/L dNTPs (Thermo, 美国)，3 μl 25 mmol/L MgCl2，10 μmol/L引物各1 μl，Taq酶0.5 μl (Thermo, 美国)，DNA模板2 μl，ddH2O补至50 μl。反应程序：95℃ 5 min; 95℃ 1 min，52℃ 1 min，72℃ 1 min 40 s，30个循环; 72℃ 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行纯化，纯化产物送上海桑尼生物科技有限公司测序。
1.3 16S rRNA基因序列比对分析所得序列在GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)核酸数据库进行Blast比对分析，根据序列相似性 > 95%为同属细菌，在70%~95%为不同属细菌(杨霞等, 2008)，初步确定所测细菌在属水平上的分类地位。采用BioEdit的ClustalW Multiple alignment比对分析，运用Mega5.05以Neighbor-Joining法，重复1000次计算bootstrap值，Kimura 2-parameter模型构建系统发育树。
1.4 人工感染实验选择均重约为30 g的健康大菱鲆(Scophthalmus maximus)，养殖水温为16℃~18℃，通过肌肉注射方式进行人工感染。选取鉴定为鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌的菌株接种于TSB液体培养基，28℃摇床培养12 h。离心收集菌体，用生理盐水将菌液依次稀释至106、105、104和103 CFU/ml。每个浓度注射10尾鱼，每尾注射0.1 ml，对照组注射等体积的灭菌生理盐水。每天正常饲喂、换水，记录发病和死亡情况，对死亡鱼及时解剖，并对病原进行分离。同时，平板计数稀释液以确定菌液具体浓度。根据改进的寇氏法(杨茂成, 1990)计算菌株的半数致死量(50% lethal dose, LD50)。
2 结果与分析 2.1 细菌16S rRNA基因扩增及序列分析以引物对27F/1492R进行PCR扩增，获得1500 bp左右的DNA片段。对纯化的DNA片段进行测序，获得的16S rRNA基因序列提交至GenBank，登录号见表 1。Blast结果显示，所得124个16S rRNA基因序列与GenBank核酸数据库序列的最高相似性达99%~100%，可鉴定到属的地位，其中，弧菌属(Vibrio sp.)数量最多，共分离到83株，占66.9%;其次依次为气单胞菌属(Aeromonas sp.) (共11株, 占8.9%)、爱德华氏菌属(Edwardsiella sp.) (4株, 占3.2%)、假交替单胞菌属(Pseudaltermonas sp.) (3株, 占2.4%)和假单胞菌属(Pseudomonas sp.) (3株, 占2.4%)等(表 2)。在1999~2004年，分离到的细菌大部分属于弧菌属，占77.3%;在2005年以后，随着养殖技术的提高和养殖条件的改善，弧菌的比例逐渐下降，仅占29.6%，气单胞菌属和爱德华氏菌属的菌株逐渐增多，分别占40.7%和11.1%。
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表 2 分离菌株在属水平上的分类地位 Tab.2 Classification status of the isolated strains on genus level |
根据在GenBank核酸数据库中进行Blast比对的结果，并从GenBank选取属内具有代表性的16S rRNA基因序列作为参考序列，与所得序列共同构建系统进化树(图略)。综合相似性和系统进化结果，将66株细菌鉴定到种的水平，其中，15株为溶藻弧菌(占12.1%)，9株为哈氏弧菌(占7.3%)，9株为鳗弧菌(占7.3%)，6株为杀鲑气单胞菌(占4.8%)，4株为迟缓爱德华氏菌(占3.2%)，以及其他种类的细菌(表 3)，其余菌株均须结合其他方法鉴定到种的水平。
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表 3 分离菌株在种水平上的分类地位 Tab.3 Classification status of the isolated strains on species level |
选取鉴定为鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌的菌株对大菱鲆进行人工感染实验和半数致死量计算。结果显示，在9株鳗弧菌中，7株对大菱鲆具有较强的致病性; 在4株迟缓爱德华氏菌中，3株有较强的致病性。细菌的半数致死量如表 4所示，鳗弧菌M3、SMP1和SMQ29对大菱鲆的半数致死量在105 CFU/尾左右，L4、L62、SMP3和SMP4的半数致死量在106 CFU/尾左右，鳗弧菌MHK9和MHK13的半数致死量都在107 CFU/尾以上，属于非致病性菌株。迟缓爱德华氏菌JN、SMQ34和MHK2对大菱鲆的半数致死量在103~104 CFU/尾，MHK25的半数致死量超过107 CFU/尾，也属于非致病性菌株。
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表 4 分离菌株对大菱鲆的半数致死量 Tab.4 The 50% lethal dose of isolates in turbot |
本研究采用16S rRNA基因序列测定及比对分析方法，对1999~2012年从发病海水养殖鲆鲽类中分离到的124株细菌进行了分类地位的分析。结果表明，分离到的弧菌菌株最多，占66.9%，表明弧菌病仍然是中国鲆鲽类养殖的主要疾病。弧菌广泛分布于海洋和河口环境，共发现有66个种(Garrity et al, 2004)，其中，对于水生动物危害严重的常见种类有鳗弧菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌(V. mimicus)和河弧菌(V. fluvialis)等。本研究表明，溶藻弧菌、鱼肠道弧菌、大菱鲆弧菌、哈氏弧菌和鳗弧菌为江苏、山东、河北和天津鲆鲽类养殖场发病鱼分离到的优势种。鳗弧菌是鲆鲽类常见的致病菌，本研究共分离到9株鳗弧菌，占分离弧菌的10.84%。另外，还分离到创伤弧菌、河弧菌、灿烂弧菌、费氏弧菌(V. fischeri)、梅氏弧菌(V. metschnikovii)、美人鱼弧菌(V. damsela)、病海鱼弧菌(V. ordalii)、栖黑海弧菌(V. ponticus)，这些弧菌感染水产动物并引起疾病的事件在国内外均有报道(Austin et al, 2007; Xie et al, 2007)。在分离得到的弧菌中，溶藻弧菌、创伤弧菌为食源性致病菌，可引起人类食物中毒(Austin, 2010)，这表明对水产品来源的弧菌监测应当成为食品安全监管的重要内容。
气单胞菌属的细菌为人鱼共患病原，其中，杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌(A. hydrophila)、维隆气单胞菌(A. veronii)是引起鱼疾病的主要病原(Austin et al, 2007)。本研究鉴定的11株气单胞菌，分别为杀鲑气单胞菌、维隆气单胞菌和异常嗜糖气单胞菌(A. allosaccharophila)。杀鲑气单胞菌是鲑科鱼类的主要病原，引起鲑鳟鱼的病害并造成严重经济损失(Austin et al, 2007)，在中国已发现该病原可感染石鲽(Kareius bicoloratus)、刺参(Apostichopus japonicus)等养殖对象(曹成易等, 2009; 杨嘉龙等, 2007; 张晓君等, 2005); 维隆气单胞菌宿主广泛，可感染多种淡水养殖鱼类(Janda et al, 2010)，在海水鱼类的肠道中也广泛存在(Herrera et al, 2006)，在养殖环境恶化或病原感染的情况下，可能会入侵鱼体引起继发性感染; 异常嗜糖气单胞菌也在西班牙养殖的欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)中有感染报道(Martinez-Murcia et al, 1992)。
迟缓爱德华氏菌能感染许多动物并引发爱德华氏菌病，感染的动物包括鱼类、两栖类、爬行类直到哺乳类(Thune et al, 1993)。多年来，中国北方的重要水产养殖品种如大菱鲆、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)等常受到迟缓爱德华氏菌感染，经济损失严重(王印庚等, 2007; 李杰等, 2008)，给水产养殖业造成了严重影响。目前，迟缓爱德华氏菌是该属唯一可以感染人的致病菌，给水产食品安全带来威胁，应引起广泛的重视。
鳗弧菌和迟缓爱德华氏菌是近年来常见的鲆鲽类致病菌，针对这2种病原，对分离得到的菌株进行了大菱鲆感染实验。在分离到的9株鳗弧菌中，7株对大菱鲆具有较强的致病性; 4株迟缓爱德华氏菌中，3株对大菱鲆有较强的致病性。近年来，随着鲆鲽类养殖业的发展，疾病种类也不断增加(李杰等, 2019)。中国鲆鲽类大规模养殖起源于20世纪90年代，本研究中检测的菌株大多是实验室在2000年左右分离(表 1)，这表明在规模化养殖初期，这些病原就开始危害中国的养殖鲆鲽类，在今后的水产养殖疾病预防中需对其进行特别关注和重视。
有26株细菌未能鉴定到种的地位，分别为假单胞菌属、假交替单胞菌属、冷杆菌属(Psychrobacter sp.)、嗜盐单胞菌属(Halomonas sp.)等15个属。假单胞菌属细菌是动植物、人类常见的病原，能引起养殖鲆鲽类的脱鳞症(Li et al, 2018)。假交替单胞菌对海洋动物致病性的报道不多，在中国已发现该属细菌可引起刺参、七带石斑鱼(Epinephelus septemfasciatus)疾病(王印庚等, 2006; 孟庆国等, 2006; 乔迁等, 2010)。其他13个种属的细菌为水环境的菌株，对水生动物的致病性尚未有报道，其致病性需要通过进一步的研究来确定。
鲆鲽类的规模化养殖在中国已有20多年历史，病害是影响鲆鲽类养殖业的重要因素，不仅引起鱼类死亡造成直接经济损失，而且可能导致药物滥用引起药残超标，造成消费者恐慌，进而影响市场价格。目前，国内对养殖鱼类的发病情况报道多集中于个体病例分析，缺乏对产业病害的整体分析，更缺乏规模化养殖起步阶段的病害情况资料。本研究对实验室自1999年以来从发病养殖鲆鲽类中分离的124株菌株进行了鉴定和综合分析，初步确定了中国养殖鲆鲽类主要流行的细菌性病原，为病害防治、流行病衍化和疫苗开发提供了基础数据。
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