2. 海海洋大学 中国科学技术部海洋生物科学国际联合研究中心 上海 201306;
3. 上海海洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室 上海 201306;
4. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室 青岛 266071
Characteristics of Coccolithophores
2. International Research Center for Marine Biosciences, Ministry of Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306;
3. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Education, Shanghai 201306;
4. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071
浮游植物在海洋食物网和生物地球化学循环中起着至关重要的作用(Falkowski, 2012)。颗石藻作为一种单细胞定鞭藻类，其细胞表面覆盖着细胞内产生的方解石小板，是目前海洋中数量最多、分布最广的钙化浮游生物类群之一(Langer et al, 2009; Langer, 2013; Lohbeck et al, 2014; Young et al, 2014)。此外，颗石藻参与形成的碳酸盐泵，在碳生物地球化学循环中发挥着重要作用；颗石藻能够形成大规模的赤潮，这些特征被认为对全球气候变化有反馈作用(Hutchins, 2011; Riebesell et al, 2011; Jin et al, 2013; Beaufort et al, 2014)。然而，大气CO2浓度的增加引起的海洋酸化正在导致海洋表层pH值下降(预计到2100年和2300年分别减少0.5和0.7个单位)(Caldeira et al, 2003; IPCC, 2008; Ross et al, 2011)，同时改变碳酸盐系统(Beaufort et al, 2010)。表层海水的这些变化对颗石藻和其他钙化藻种产生了巨大的影响，预计将影响整个群落和生态系统，甚至破坏整个海洋环境(Turley et al, 2010; Hoppe et al, 2011; Sinutok et al, 2011; Lohbeck et al, 2012; Meier et al, 2014)。
过去十年间，许多有关实验室培养和大型半封闭野外培养(中试实验)的研究，都集中在单种颗石藻对海洋酸化的响应，这产生了不一致甚至相互矛盾的结果(Young et al, 2014)。Riebesel等(2000)发现，随着CO2浓度的增加，颗石藻的钙化作用明显减弱，同时伴随着颗粒有机碳(POC)的增加。随后对单一藻种赫氏颗石藻(Emiliania huxleyi)的研究也表明，海洋酸化导致该物种的钙化效率降低，但POC产量发生不均一(增加、减少或不受影响)变化(Zondervan et al, 2002; Sciandra et al, 2003; Delille et al, 2005; Feng et al, 2008; Müller et al, 2010; Hoppe et al, 2011)。许多其他关于E. huxley藻株应对海洋酸化的研究也显示相互矛盾的结果，例如，颗石藻钙化率的不断增加(Iglesias-Rodriguez et al, 2008; Shi et al, 2009; Jones et al, 2013)或不敏感变化(Langer et al, 2009; De Bodt et al, 2010; Fiorini et al, 2011b)。
此外，前人研究的3种钙化颗石藻(Gephyrocapsa oceanica, Caldiscus leptoporus, Coccolithus braarudii)，都对CO2浓度升高表现出不同的响应模式。例如，CO2浓度升高使G. oceanica PC7/1的钙化效率大幅下降44.7% (Riebesell et al, 2000)，Coccolithus braarudii 4762藻株的钙化率则表现出轻微增加(Rickaby et al, 2010)，而Calcidiscus leptoporus AC370藻株反应不敏感(Fiorini et al, 2011b)。鉴于这种矛盾的结果，已经出现了一些同时测试不同颗石藻品系或种类的研究(Langer et al, 2006、2009; Fiorini et al, 2011b)。Langer等(2009)指出，先前海洋酸化研究中使用的不同赫氏颗石藻品系的敏感性在本质上是不同的，这可能是由于存在特异性反应的遗传基础所致。
过去有关海洋酸化对颗石藻钙化作用影响的研究结果是不一致的，利用这些研究结果，在日益酸化的海洋环境中，准确预测未来颗石藻的命运仍然存在着问题。此外，基于短期实验的海洋表层优势种赫氏颗石藻对海洋酸化的响应也得到了深入的研究，文献范围也在迅速扩大。Langer等(2006)指出，单一品系颗石藻得到的实验结果，可能会对很好适应当前CO2条件的不同颗石藻在应对未来可能发生的海洋酸化的响应研究产生偏差，而且实验结果存在着缺乏普遍有效性的问题。此外，由于非钙化的颗石藻藻种在海洋生态系统中发挥着重要的生态作用，非钙化藻株的研究不应该被忽视，并且最近受到越来越多的关注(Kottmeier et al, 2014)。因此，当下需要同时研究更多不同的颗石藻品系，并研究CO2浓度升高对颗石藻的长期生物学效应。
本研究将CO2浓度从400 μatm升高到2000 μatm，来分别模拟当今和未来海洋酸化条件。同时，利用颗石藻的2个优势种赫氏颗石藻和大洋球石藻，包括非钙化的和钙化的品系，进行一系列实验。通过测定颗石藻的细胞密度、藻体光合参数、氮吸收速率、颗粒无机碳(PIC)产量、颗粒有机碳(POC)产量、颗粒有机氮(PON)以及它们之间的比率等生理参数，以分析不同品系颗石藻在不同CO2浓度下的潜在生理变化。此外，拟合了4个品系颗石藻相对于CO2变化的氮吸收速率响应曲线，并应用响应曲线中的动力学常数进一步分析4种品系颗石藻之间的本质响应差异。这些结果旨在了解类似条件下海洋酸化对不同颗石藻的差异影响，有助于评估未来环境条件下生物多样性和其他生态进程的改变。
1 材料与方法 1.1 实验材料和培养条件实验所用的钙化和非钙化的赫氏颗石藻(E. huxleyi, 简写为N-E; E. huxleyi CS369, 简写为C-E)以及钙化和非钙化的大洋球石藻(G. oceanica NIES-1318, 简写为N-G; G. oceanica, 简写为C-G)均来源于中国水产科学研究院黄海水产研究所微藻培养中心。藻细胞在天然过滤海水(0.22 μm)培养基中培养，海水中硝酸盐和磷酸盐的浓度分别为882 μmol/L和36.2 μmol/L，根据f/2培养基向海水中添加金属和维生素(Guillard et al, 1962)。细胞培养在含1 L培养基的2 L三角烧瓶中，放置在植物培养箱中，培养温度为20℃，盐度为32。培养光源为白色荧光灯，光强为300 μmol/m2·s，光暗比为16 h/8 h，实验采用处于指数生长期的颗石藻。
1.2 实验内容及方法 1.2.1 实验设置采用与Xu等(2014)类似的方法，在植物培养箱(GXZ，瑞华，武汉)中，将空气与CO2混合，向4种品系颗石藻泵入不同CO2分压的空气，设3个重复的1000 ml培养物进行培养。在准备阶段，在上述条件下，4种品系颗石藻被分别培养到指数生长期。在培养基中用含有不同CO2分压的空气连续充气，以提供400、750、1000和2000 μatm的CO2，各项初始值见表 1。待持续充气48 h稳定后，进行下一步实验。每次实验中，每个空气-CO2混合物均设3份平行样，以不添加细胞的实验体系作为空白对照，分别监测细胞密度和pH值。在取样点分别测定叶绿素含量、PIC、POC、DIC和碱度。
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表 1 初始碳酸盐系统参数 Tab.1 The data of the original carbonated system |
培养基pH值采用pH计检测(Orion ROSS, Thermo Electron Corp., 美国)。总碱度(TA)用Whatman GF/F膜过滤，储存在密封的100 ml三角烧瓶中，放置在-20℃，使用848自动滴定仪(Metrohm, Riverview, FL, 美国)获得总碱度值。利用CO2SYS包获得海水中碳酸盐体系的pH、温度、盐度和TA，其中碱度根据Pelletier等(2007)提供的方法计算。
1.2.3 生长测定在光学显微镜(Nikon，日本)下用血细胞计数器手动计数，获得准确的细胞数以估算微藻的生长情况。利用如下公式测定比生长速率(μ)：
| $ \mu =\left(\ln {{C}_{1}}-\ln {{C}_{0}} \right)/\left({{t}_{1}}-{{t}_{0}} \right) $ |
式中，C0和C1分别是初始时间t0和随后时间t1的藻细胞浓度。
1.2.4 叶绿素荧光参数的测定及色素分析使用Dual-PAM-100(Walz, Effeltrich, 德国)测定颗石藻的叶绿素荧光参数。测量前将样品暗适应15 min，在弱光下测定初始荧光(F0)。暗适应后的样品在饱和脉冲光下获得最大荧光值(Fm)。F'm代表被照亮后样品的Fm产量，Ft是实时荧光产量。根据公式Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm计算最大PSⅡ量子产额(Fv/Fm)。有效PSⅡ量子产率计算：Y(Ⅱ)=(F'm-Ft)/F'm。
为了确定色素含量，样品被过滤收集到GF/F过滤膜(25 mm)上，然后在4℃的黑暗条件下，用10 ml的90%丙酮提取24 h，7000 g离心10 min后，上清液用于室温下色素含量分析。叶绿素含量采用Jeffrey等(1975)的方法测定。
1.2.5 氮吸收速率的测定每个实验体系收集5 ml水样，迅速用醋酸纤维素膜过滤，置于聚乙烯离心管中，冷冻保存于-80℃。营养盐分析前，将样品解冻至室温，用营养盐自动分析仪(Bran and Luebbe AA3, 德国)对硝酸盐浓度进行光度分析。氮吸收速率计算公式：NUR=(C0-Ct)V/N/t，NUR为氮吸收速率(pmol of nitrate·N/cell·d)，C0和Ct分别为实验开始和第7天硝酸盐浓度(pmol/L)；V为水的体积(L)；N为细胞数；t为时间间隔(d)。此外，使用米氏方程曲线(Michaelis et al, 1913; Hutchins et al, 2013)拟合每个CO2浓度下的平行样品关于氮吸收的CO2响应曲线。使用Origin Pro软件进行动力学常数和曲线相关系数的计算。
1.2.6 藻体中碳和氮元素的含量分析将样品过滤到灼烧过(500℃, 5 h)的GF/F膜(25 mm)，保存在-20℃直到分析。在分析之前，颗粒有机碳的滤膜用浓盐酸熏24 h，除去无机碳，再次干燥。然后将过滤膜装好进行后续分析。POC、PON、TPC浓度由Vario ELⅢ自动元素分析仪(Elemntar Analysensysteme Co., 德国)依次测定。通过TPC与POC的差异，计算PIC浓度，POC、PIC或PON产量计算公式如下：
| $ P=比生长速率\mu \left({{\text{d}}^{-1}} \right)\times 细胞中POC、PIC或PON含量\left(\text{pg}/\text{cell} \right) $ |
实验数据的统计分析采用SPSS 17.0软件，运用单因素方差分析(One-way ANOVA)来分析各处理之间差异的显著性，以P < 0.05作为差异显著水平。
2 结果 2.1 实验中碳酸盐体系的变化本实验采用充气法模拟海水酸化，检测不同处理条件下的海水碳酸盐系统参数的变化，包括pH、DIC、HCO3-、CO32-和CO2。图 1和表 1为不同颗石藻的海水pH值随CO2浓度的变化情况。浓度为400、750、1000和2000 μatm的CO2对应的pH值分别为8.06±0.02、7.79±0.01、7.65±0.02和7.48±0.02。因为海水中含有引起碱度变化的缓冲液，本研究设定的实验条件与预期的海洋酸化条件并不完全相同。有些实验测量需要大量的生物量，因此，需要较大的细胞密度，从而导致碳酸盐体系的变化。尽管存在这些变化，但在整个实验过程中，培养藻的4种梯度的pH值始终保持着明显的差异，使研究结果具有重要意义。
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图 1 4种品系颗石藻在不同的CO2浓度下随着培养时间改变的海水pH值变化 Fig.1 Changes of seawater pH of the four strains of coccolithopsis with different incubation time at different CO2 concentrations [N-E: E. huxleyi (a); C-E: E. huxleyi CS369 (b); N-G: G. oceanica NIES-1318 (c); C-G: G. oceanica (d)] |
实验室条件下，不同CO2分压对4种品系颗石藻生长的影响如图 2所示。所有处理的藻细胞浓度随着培养时间的延长逐渐升高并达到最大值，随后，藻细胞浓度逐渐下降直至实验结束。CO2分压对每种颗石藻的细胞浓度均有显著影响。随着CO2浓度逐渐增加，C-E、N-E和N-G均显示出积极响应，然而对于N-E，CO2分压达到2000 μatm时，N-E的生长被抑制。所有处理的藻细胞在前7 d均呈指数级生长，其特定生长速率如图 2e~h所示。CO2浓度持续增加至2000 μatm，比生长速率分别增大约53% (C-E)，36% (N-G)和30% (C-G)。然而，对于N-E，当CO2浓度达到1000 μatm，比生长率增加约26%。当CO2连续升至2000 μatm时，与对照组相比，海洋酸化导致N-E的比生长率下降14%。
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图 2 不同CO2浓度下4种品系颗石藻的生长曲线(a~d)和比生长速率(e~h) Fig.2 The growth curves (a~d) and specific growth rates (e~h) of the four strains E. huxleyi (a, e), E. huxleyi CS369 (b, f), G. oceanica NIES-1318 (c, g), and G. oceanica (d, h) for different CO2 concentrations |
图 3为海洋酸化对颗石藻Fv/Fm和Y(Ⅱ)在内的光系统参数变化的影响。当CO2升高至2000 μatm时，所有处理的Fv/Fm和Y(Ⅱ)均显示出负面影响，但响应幅度在4种品系颗石藻中不同。随着培养时间的延长，除了CO2浓度达到2000 μatm时，C-E的参数Fv/Fm在第10天达到最大值，N-E一直下降之外，4种品系颗石藻的光合系统参数在第7天达到最大值，随后下降直至实验结束。随着CO2分压增加到2000 μatm，对于N-E、C-E、N-G和C-G，海洋酸化对Fv/Fm的显著抑制作用分别发生在第7、4、13和10天，而对Y(Ⅱ)的抑制作用分别发生在第4、13、13和10天。实验结束后，与对照组相比，当CO2分压升高至2000 μatm，Fv/Fm被抑制，分别下降60%、45%、55%和46%；Y(Ⅱ)也被抑制，分别下降75%、69%、76%和39%。此外，与N-E和N-G的最大Y(Ⅱ)值相比[低于400 μatm时分别为(0.32±1.90)%和(0.34±2.60)%]，C-E和C-G的最大Y(Ⅱ)值[低于400 μatm时分别为(0.39±3.10)%和(0.48±2.30)%]显著较高，而Fv/Fm无显著差异。
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图 3 培养过程CO2浓度升高对4种品系颗石藻的光合参数Fv/Fm (a~d)和Y(Ⅱ)(e~f)的影响 Fig.3 The effect of ocean acidification by increasing CO2 concentrations on the changes of Fv/Fm (a~d) and Y(Ⅱ) (e~f) in the photosystem activity parameter during growth of the four species E. huxleyi (a, e), E. huxleyi CS369 (b, f), G. oceanica NIES-1318 (c, g), and G. oceanica (d, h) for different CO2 concentrations |
当CO2浓度从400 μatm升高至2000 μatm对不同品系颗石藻细胞内叶绿素含量的影响见图 4。细胞叶绿素a含量在第20天(N-E、C-E和N-G)和第7天(C-G)达到最大值，在初始值出现微小变化后，叶绿素a含量逐渐下降，直至实验结束(图 4a~d)。然而，随着时间的推移，叶绿素c呈现出整体稳定下降的趋势(图 4e~f)。然而，随着CO2浓度从400 μatm增加至1000 μatm，每种颗石藻叶绿素含量以同样模式下降(除了个别点以不同的方式呈现)。然而，当CO2浓度达到2000 μatm时，测定的结果表现出不同的反应。与1000 μatm相比，当CO2浓度为2000 μatm时，在每个采样点，随着培养时间的延长，N-E的叶绿素a和c的含量降低。然而，对于藻株C-E、N-G和C-G，随着CO2浓度增加到1000 μatm，在每个采样点叶绿素含量趋向于增加。
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图 4 升高的CO2对4种品系颗石藻叶绿素含量的影响 Fig.4 The change of chlorophyll content of the four strains a, e: E. huxleyi; b, f: E. huxleyi CS369; c, g: G. oceanica NIES-1318; d, h: G. oceanica, at elevated CO2 conditions |
海洋酸化对4种品系颗石藻氮吸收速率的影响如图 5所示。随着CO2从400 μatm升高至2000 μatm，4种品系颗石藻的氮吸收速率均增加，分别增加了48.2%(N-E)、33.9%(C-E)、41.6%(N-G)和34.3%(C-G)。氮吸收速率的最大变异值(48.2%, N-E)比最小变异值(33.9%, C-E)增大了近1.5倍。此外，4种品系颗石藻的氮吸收速率相对于CO2增加的响应根据米氏方程曲线拟合，由响应曲线得到2个半饱和常数(Km, μatm CO2)和最大CO2饱和率(Vmax, pmol N/cell·d)得到。藻体N-E中，最大Km和Vmax值分别是307.2 μatm和24.1 pmol N/cell·d，分别大于C-E最低值约1.7倍和1.3倍。
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图 5 CO2升高对4种品系颗石藻氮吸收速率的影响 Fig.5 Nitrogen uptake rate response curves relative to CO2 changing concentrations for four E. huxleyi and G. oceanica strains a: E. huxleyi; b: E. huxleyi CS369; c: G. oceanica NIES-1318; d: G. oceanica |
图 6为CO2升高对第7天的4种品系颗石藻的POC和PON的产生情况。当CO2达到2000 μatm时，显著刺激颗石藻产生POC和PON(除了N-E)。N-E颗石藻有机碳生产率的变化是巨大的，在1000 μatm CO2浓度条件下，表现出明显的增加，但在2000 μatm时，表现出大幅下降。与对照组相比，C-E、N-G和C-G藻种的POC产量分别增长约101%、35%和49%，其中C-E品系POC产率变化分别为N-G、C-G品种的2.9倍、2.1倍。此外，在此范围内，PON较对照组分别增加233%(N-E)、289%(C-E)、148%(N-G)和129%(C-G)，增幅较大。然而，随着CO2由400 μatm升高至2000 μatm，4个藻种的颗粒有机碳和氮的变化导致颗粒有机碳与颗粒有机氮的比值(POC/PON)分别减少76.6%(N-E)、48.3%(C-E)、45.7%(N-G)和34.9%(C-G)。此外，与400 μatm CO2相比，2000 μatm CO2对颗粒有机碳的产率有负面的影响，2个钙化品系C-E和C-G的钙化率呈现更大程度的降低，分别为35.4%和68.9%。当CO2浓度增大到2000 μatm，C-G比C-E呈现更高的PIC还原力。同时，这2种藻的PIC/POC值也分别下降67.9%和79.2%。
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图 6 海水酸化对4种品系颗石藻颗粒有机碳和颗粒无机碳的生产率及碳氮比的影响 Fig.6 Effect of seawater acidification by elevated CO2 concentrations (400, 750, 1000, and 2000 μatm) on POC (a), PON production (b) and POC:PON (c) of the four species (E. huxleyi, E. huxleyi CS369, G. oceanica NIES-1318, and G. oceanica) |
本研究首次在实验中使用了非钙化品系和钙化品系的2种颗石藻，研究了它们对CO2升高的响应。同时，利用氮吸收率拟合的CO2响应曲线，获得的动力常数来分析不同颗石藻的遗传变异性。当CO2浓度升高到2000 μatm时，与其他3个藻种不同程度的积极响应相比，N-E被严重抑制。本结果表明，海洋酸化对颗石藻产生生理影响，不同颗石藻对海洋酸化具有特异响应，最近的研究表明，不同的浮游植物对CO2浓度升高的响应存在种间异质性(马莎等, 2019)，这与本研究结果类似。作者推测，海洋酸化可能导致未来海洋生物多样性、营养相互作用关系和其他生态系统进程的变化。
3.1 海洋酸化对不同颗石藻生长和光合系统参数的影响研究表明，与对照组相比，除了N-E，高CO2浓度(增加到2000 μatm)促进藻细胞的生长(图 2)。而N-E的生长在CO2浓度为2000 μatm时下降，其特定生长率在第7天显著降低了7.61%。然而，在CO2浓度升高至1000 μatm之前，N-E的生长保持增长状态(图 2a和2e)。Fiorini等(2011b)也得到了类似的结果，富含CO2 (750 μatm)的水中，颗石藻藻状细胞的生长呈现增长趋势。
前人的研究表明，由于细胞外碳酸酐酶的活性较低，导致其CO2浓缩机制(CCM)效率相对较低(Herfort et al, 2002; Trimborn et al, 2007; Rokitta et al, 2012a; Jin et al, 2013)，所以，目前海洋中的颗石藻具有碳限制性。因此，酸化的海水可利用CO2含量的增加可能会加速Rubisco附近CO2的积累，以弥补碳供应不足，进一步促进颗石藻的羧化作用和生长作用(伴随着POC的增加) (Barcelose et al, 2010; Reinfelder, 2011; Jin et al, 2013; Kottmeier et al, 2014)。本研究中，观察到4种品系颗石藻在高CO2条件下的生长情况，N-E在1000 μatm增长23%，另外3种藻在2000 μatm时分别增长53%(C-E)、36%(N-G)和30%(C-G)(图 2)。然而，每个品系对CO2升高的反应能力和策略不同。此外，对于N-E来说，在2000 μatm条件下，几乎处于白化状态。
研究表明，细胞外pH值的变化可以通过破坏恒定膜电位平衡和生理参数来影响藻细胞的活性(Langer et al, 2006; Taylor et al, 2011; Rokitta et al, 2012b)。相比于其他3种品系颗石藻，由于pH值下降及超过耐受能力(7.48, 2000 μatm)，N-E更加敏感而呈负反应。因为颗石藻是一种丰富的藻种，具有独特的生理和形态特征(Winter et al, 1994; Raven et al, 2012)，推测颗石藻对CO2增加的特异性反应具有遗传基础。Read等(2013)报道了第一次解析的基因组(来自E. huxleyi CCMP1516)在复合种内的变异性支持了颗石藻在不同生境中的繁荣发展。结合本实验结果，猜想颗石藻固有的遗传特异性可能导致其对海洋酸化产生特异性反应。
然而，由于光合系统参数和色素含量分析的藻类光合作用(与生长紧密相关)能力随着CO2增加产生多种负反应，尤其N-E几乎丧失光合能力(图 3和4)。这些涉及到光系统活动的结果表明，由于pH值下降(CO2升高)对细胞离子平衡的影响，藻细胞仍然处于光合不健康状态(Langer et al, 2006)，诱导了叶绿素含量降低(图 4)。特别是当CO2浓度达到2000 μatm，超过可调节的范围，与其他3种品系颗石藻相比，NE的FV/Fm和叶绿素a的含量被严重影响(图 3a和4a)。与CO2升高对生长的不同反应相类似，不同藻类光合作用对CO2升高响应也具有特异性。对于整个生态系统来说，一部分的微小变化可能会影响整个生态系统，颗石藻对海洋酸化的特异反应可能会影响生物多样性和其他生态过程(Orr et al, 2005; Hendriks et al, 2010)。
3.2 海洋酸化对颗石藻氮吸收速率的影响考虑到海洋酸化对营养盐吸收的影响，本研究在第7天取样测试了不同CO2水平下各品系藻株的氮吸收速率，并拟合了每种颗石藻应对CO2变化的氮吸收速率响应曲线，以供进一步分析。结果表明，当CO2浓度升高至2000 μatm时，所有品系的氮吸收速率增加(图 5)。非钙化藻株N-E和N-G的氮吸收速率显著的增加了41.6%和48.2%(图 5a和c)，而钙化藻株C-E和C-G分别在氮吸收速率提高了33.9%和34.3%。Jin等(2013)的研究表明，CO2增加导致颗石藻对无机氮的吸收增强，硅藻硝酸盐还原酶基因上调。此外，各品系藻种之间也存在差异。
先前的研究表明，在海洋酸化条件下，颗石藻细胞具有能量再分配的过程(Raven, 2011; Beaufort et al, 2011)，导致额外的ATP释放优先支持额外的氮吸收以合成更多的蛋白质(Jin et al, 2013)。然而，与非钙化细胞相比，钙化细胞需要更多的能量来转运钙化作用中的氢离子到酸性环境中(Suffrian et al, 2011; Taylor et al, 2011; Beaufort et al, 2011; Stojkovic et al, 2013)。CO2升高到2000 μatm时，钙化品系藻株的氮吸收速率显著低于非钙化藻株。此外，本研究在CO2升高下测定PON产量也间接证实了氮吸收的能量再分配偏好(图 6b)。
藻氮吸收速率相对CO2变化的响应曲线，证实了CO2对这些颗石藻的影响行为。由响应曲线推导出的动力学常数(Km)表示酶对底物的亲和力，Km值越大，亲和力越小(Michaelis et al, 1913)。最近，Hutchins等(2013)通过分析不同的动力学常数，证实了固氮作用与CO2浓度之间的品系特异性差异。在这项研究中，相比其他3种藻株，N-E显示出最高Km值，即NO3还原酶的亲和力最低(图 5)。这一结果与其他测量参数，如生长速率、光合活动等反映出相同的趋势，这表明CO2浓度升高严重抑制了N-E的生命活动。
3.3 海洋酸化对不同颗石藻元素组成的影响浮游植物的化学元素组成会对营养相互作用关系有一定影响，并最终对海洋营养元素的生物地球化学产生影响，因为海洋浮游动物的膳食价值随POC与PON的比值(C:N)变化而变化(Hutchins et al, 2009; Anderson et al, 2013)。本研究测量了不同品系颗石藻的C:N比例，以评估生物有机体的元素组成是否受到CO2浓度的影响，并探讨了影响的程度。结果显示，在2000 μatm CO2浓度下，4种品系颗石藻的元素组成均发生变化，C:N分别降低76%(N-E)、48%(C-E)、45%(N-G)和35%(C-G)(图 6)。N-E相对其他3种颗石藻的影响较大，C-G的影响最小。在之前的研究中，Fiorini等(2011a)和Rickaby等(2010)的研究表明，当CO2浓度增强时，颗石藻发生了相似的变化。当CO2浓度从400 μatm持续上升到2000 μatm时，POC(除了在2000 μatm下的N-E)和PON的产率增加(图 6)。
研究还发现，与对照组相比，PON的增加量比POC要高。前面已经讨论过，由于CO2的升高，能量的重新分配导致了更多的氮吸收，增加了PON产量。尽管不同颗石藻的品系之间存在差异，这种偏好优势使得PON产量超过POC产量，导致C:N下降的幅度不同(图 6)。与Riebesell等(2011)之前的研究结果类似，C:N比值随着CO2浓度的变化具有高度的物种特异性。此外，这种变异比例可能是不同品系藻株间遗传差异的体现。此外，也存在与目前的研究结果相反的结果，随着CO2浓度的升高，细胞C:N比值增加(Feng et al, 2010; Kottmeier et al, 2014)。
产生矛盾结果的原因可能是实验设置的不同，如温度、光照强度、藻种的选择等。此外，最终结果表现出一种非常有趣的现象，非钙化藻的C:N比值比钙化藻高。这种现象的原因尚不清楚，但很可能与颗石藻钙化作用有关。这些结果表明，CO2浓度的增加影响了颗石藻C:N比值，并且对不同颗石藻产生了不同的影响。此外，它还将进一步影响浮游植物的捕食选择压力，并对许多生物地球化学循环过程产生影响(特别是碳输出通量)(Iglesias-Rodriguez et al, 2008)。
3.4 海洋酸化对颗石藻钙化效率的影响在过去几年里，颗石藻PIC生产效率(钙化率)已被广泛用于颗石藻的研究，以预测海洋酸化的生物学影响。结果表明，当藻细胞生长在高于当前CO2水平时(400 μatm)，主要反应是钙化率下降或者至少减少PIC/POC的值(Zon-dervan et al, 2001; Langer et al, 2006; Muller et al, 2010; Hoppe et al, 2011)。本研究中，关于PIC的响应与上述的趋势是一致的。同时，当CO2浓度由400 μatm升高到2000 μatm时，钙化赫氏颗石藻和钙化大洋球藻在第7天的钙化率分别下降35.4%和68.9%(图 7)。相比大洋球藻，赫氏颗石藻更容易受海洋酸化的影响，从而导致生态不平衡的因素。但对于实验中所用的非钙化种，由于失去了表面覆盖的钙化外壳，PIC的产量几乎可以忽略不计。
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图 7 海水酸化第7天对钙化颗石藻的颗粒无机碳生产率以及颗粒无机碳与颗粒有机碳的比值的影响 Fig.7 Effect of seawater acidification by elevated CO2 concentrations(400, 750, 1000, and 2000 μatm) on PIC production (a) and PIC/POC (b) of the calcifying species (E. huxleyi CS369 and G. oceanica) on the 7th day |
最近各种生物体的研究显示，钙化很大程度上是由饱和碳酸钙而不是单靠pH值控制(Langer et al, 2006; Trimborn, 2007)。海水中的饱和碳酸钙由(DIC)和pH值共同控制(Iglesias-Rodriguez et al, 2008)。当表层海水过饱和碳酸钙由于海洋酸化或其他自然过程条件下饱和程度下降时，分布在贝壳和骨骼中的碳酸盐矿物开始溶解(Feely et al, 2009)。该研究表明，当CO2浓度由400 μatm升高到2000 μatm，钙离子的饱和度降低，但依然处于溶解发生的阈值。结果明确表明，与对照组相比，PIC的产量(钙化效率)最终有所下降(图 7)。
Langer等(2009)的研究结果也出现同样的现象，虽然钙离子的饱和度大于1，但颗粒无机碳的溶解仍然发生。为了解释这一现象，我们发现400 μatm和2000 μatm CO2在第7天的pH值介于8.81~7.62之间(表 1和图 1)，并且与空白对照相比，细胞的生理状态和pH值有一定的变化。这些变化影响了藻细胞的光合作用，这意味着颗石藻细胞不完全适应改变后的pH条件。Bach等(2011)认为，钙化作用对pH值降低具有特异性反应。在CO2升高的情况下，颗石藻的钙化作用是一个严格控制的生物进程(Mackinder et al, 2010)，将受到pH水平下降的影响。
最近，大量的生理和分子研究证据表明，当使用HCO3-进行钙化作用(产生H+，并保持细胞pH稳态接近中性)时，H+必须通过膜离子通道被清除(Suffrian et al, 2011; Taylor et al, 2011)或者在颗石藻细胞中被总和(Fabry et al, 2008; Rokitta et al, 2012; Stojkovic et al, 2013)。为了维持合适的跨质膜电位差和H+射流，H+输运过程中需要能量(Raven, 2011)。当CO2升高导致水体pH值和/或[CO32-]水平降低时，单位钙化输入的能量可能更大，从而导致钙化率降低(Raven et al, 2011; Beaufort et al, 2011)。通过研究CO2增加对颗石藻钙化的不利影响，颗石藻的钙化作用与生物地球化学循环密切相关，虽然我们对钙化作用的降低给出了合理的解释，但这种解释只是事实的一小部分。目前，海洋酸化对钙化颗石藻影响的原因仍然需要进一步的探索。
本研究表明，不同颗石藻在应对海洋酸化威胁时表现出了特异的生理响应，随着CO2浓度的逐渐增加，不同颗石藻在维持稳定的原始状态都发生了不同程度的改变。因此，物种分布和丰度的潜在变化可以通过海洋食物网的多种营养水平传递。虽然海洋酸化对生态系统长期影响的研究还处于起步阶段，但这些结果可能指示出在海洋酸化条件下生物多样性、营养相互作用关系、生物地球化学循环和其他生态系统进程的变化。
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