人类对重金属的开发利用历史悠久，随着现代工业的发展，大量的重金属被排入水体环境中，由于重金属不能被生物降解，因此，已经成为一类典型的传统环境污染物，主要包括铅(Pb)、镉(Cd)、铬(Cr)、汞(Hg)、类金属砷(As)等毒性较强的重金属，也包括铜(Cu)、锌(Zn)、镍(Ni)等有一定毒性的一般重金属(Bhuyan et al, 2017; Järup, 2003)。重金属通过生物富集在海洋生物体内累积并最终通过食物链途径转移到人体体内，危害人类健康(Apeti et al, 2005; 孙元芹等, 2013)。Cu是一种存在于各种岩石和矿物中的微量金属元素，由于其使用广泛，不能被生物降解，易在生物体内积累且对水生生物具有致毒效应毒性而受到广泛关注(Sloman et al, 2005)。水体中溶解态Cu²⁺对海洋鱼类(Johnson et al, 2007; Monteiro et al, 2009)、微藻(Cid et al, 1995)、甲壳类(Hansen et al, 1992; Young et al, 1979)、无脊椎动物(Iwinski et al, 2016)、贝类(Chang et al, 1996)等会产生氧化应激、DNA损伤、细胞凋亡、蛋白质变性等各类毒性效应。

相比较其他海洋生物，海洋贝类由于其滤食性特点，更容易从周围环境中富集Cu²⁺等重金属，常被用作重金属污染的指示生物，因此，研究重金属对海洋贝类的毒性效应有重要的现实意义(Nsofor et al, 2014)。厚壳贻贝(Mytilus coruscus)主要分布于中国的渤海、黄东海等地，日本、朝鲜部分区域也有分布，属于滤食性附着生活的双壳贝类。国内外学者利用分子生物标志物研究了Cu²⁺对厚壳贻贝的毒性效应，Xu等(2016)、Li等(2012)、Wu等(2017)、王昊盛等(2017)、刘慧慧等(2014)从不同角度研究了厚壳贻贝不同组织酶活性及相关基因表达对Cu²⁺暴露胁迫的响应。张翼飞(2017)研究了Cu²⁺和苯并芘(BaP)对厚壳贻贝的联合毒性效应。但各类生物标志物对Cu²⁺的敏感程度不同，诱导程度、变化趋势也存在差异，单独依据个别生物标志物对Cu²⁺暴露的响应不能有效的评估Cu²⁺的毒性效应，需要一种能够评估生物标志物整体变化的方法。综合生物标志物响应(Integrated biomarker response, IBR)指数能够综合所有的生物标志物对污染物的响应，转换成一个“压力指数”值，已经应用于评估各类污染物的生物毒性效应研究中(Kim et al, 2016; Xia et al, 2014; Zheng et al, 2013)。

本研究通过Cu²⁺对厚壳贻贝的暴露实验，比较分析了厚壳贻贝的鳃、内脏团组织超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、脂质过氧化水平(Lipid peroxidation, LPO)、金属硫蛋白(Metallothioneins, MT)含量等生物标志物在不同Cu²⁺暴露下的变化及相关关系，应用IBR指数评价组织对Cu²⁺暴露的响应差异，探讨Cu²⁺对厚壳贻贝的致毒机理及其生理响应，为基于双壳贝类的重金属污染监测预警提供更多的技术支持。

厚壳贻贝取自浙江省嵊泗县枸杞岛养殖区，平均体重为(6.06±0.34) g，参考养殖区水环境条件并使用海水晶(溶解于纯净水中，Cu²⁺浓度为1.3×10^–3 mg/L)、纯净水配制实验用海水(盐度为32.5，pH为8.10)，水质指标符合《渔业水质标准》(国家环境保护局，1989)的要求。实验容器为10 L的玻璃容器。Cu²⁺实验母液为100 mg/ml的Cu²⁺标准溶液(中国标准物质网)，实验时稀释到所需浓度。厚壳贻贝在实验开始前暂养3 d，每天投喂角毛藻(Chaetoceros gracilis)，每24 h 100%换水1次，水温为(19.0±0.3)℃。

采用半静态实验方法，先进行预实验，确定厚壳贻贝全部死亡的最低浓度(LC₀)和96 h全部存活的最高浓度(LC₁₀₀)，在预实验的基础上，设置6组实验浓度(8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 mg/L，配制海水中的Cu²⁺浓度极低，忽略不计)，同时，设置1组海水对照组，每组3个重复，分别放置30个厚壳贻贝。实验期间，光照比为12:12，水温为(19.0±0.3)℃，容器加入5 L海水，每24 h 100%换水1次，实验期间不投喂饵料，使用微型充气泵充氧，溶解氧(DO)的范围为7.0~7.5 mg/L。及时将死亡的厚壳贻贝捞出，死亡标准是用玻璃棒重复触碰，若厚壳贻贝没有反应确认为死亡。分别于第24、48、72、96小时记录厚壳贻贝的死亡情况。

利用SPSS16.0软件进行数据处理，采用概率单位算法计算96 h LC₅₀，根据公式：SC=96 h LC₅₀×0.1，计算Cu²⁺的安全浓度。

根据96 h急性毒性实验结果(96 h LC₅₀=1.55 mg/L)，设置0.04、0.08、0.16 mg/L共3组实验浓度(1/10急性毒性实验浓度)，实验进行7 d时，实验条件与96 h急性毒性实验相同，实验前与第0、1、3、7天分别采集8个样品，取鳃、内脏团组织，保存在液氮中。

使用超纯水(Millipore，美国)配制与厚壳贻贝生理盐度相同的冰水，取约0.5 g鳃、内脏团样品置于4.5 ml生理盐水中，在15000 r/min条件下，使用自动匀浆机(Ika T10b，德国)匀浆，匀浆样品在4℃、1431 r/min条件下，离心20 min，取上清液(Lowe et al, 1995)，使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定SOD、CAT酶活性及MDA含量(代表LPO水平)。

将鳃、内脏团样品按照1:4的比例(体重/体积比)加入Tris-HCl缓冲液(pH为8.3)，冰浴条件下匀浆，然后，将匀浆液在0℃、10000 r/min下离心30 min，取上清液，采用镉–血红蛋白饱和法测定MT含量(Onosaka et al, 1982)。利用原子吸收仪(SOLAARM6, Thermo Fisher Scientific, 美国)分析Cd²⁺浓度，按照1个MT分子结合6个Cd²⁺和MT分子量为7000 Da的原则(Narula et al, 1995)计算MT的含量(μg/g)。

应用IBR值的计算方法并参照Kim等(2016)的方法。首先，计算生物标志物在各阶段的平均值(x_i)、总平均值(x)、标准差(s)，然后，按照下列公式对各阶段的x_i进行均一化处理：

式中，${{{x}'}_{i}}$为${{x}_{i}}$均一化后的值。

各阶段生物标志物的得分B_i值计算公式：

式中，|x_min|为各阶段生物标志物均一化处理后的数据最小值的绝对值，B_i值的大小在星状图中以辐射线的长度代表，星状图面积(即图中由相邻生物标志物的辐射线围成的三角形面积A_i之和)按照下列公式计算：

式中，n为生物标志物数量；α为相邻的2条辐射线夹角，α=2π/n；B_n+1=B₁。当n=4时，α=π/2，A_i计算公式可以简化为：

所有数据均以平均值±标准差(Means±SD)表示，应用SPSS 16.0软件对数据进行分析，采用单因素方差(One-way ANOVA)对数据进行分析，差异显著时进行Duncan’s test多重比较，显著性水平设为0.05。

Cu²⁺浓度与厚壳贻贝的死亡率之间表现为正相关的剂量效应关系，剂量效应关系公式为：

相关系数R²=0.958，96 h LC₅₀浓度为1.55 mg/L，安全浓度为0.16 mg/L。

各实验组中，厚壳贻贝鳃组织、内脏团的SOD活性均表现为先上升后下降的趋势(图 1)。各实验组厚壳贻贝鳃组织的SOD活性在第1天即达到最高值，其中，0.16、0.08 mg/L组鳃组织的SOD活性均显著高于对照组(P < 0.05)，分别为对照组的2.93、2.20倍，0.04 mg/L组中鳃组织的SOD活性与对照组之间无显著差异(P > 0.05)；第3天时，仅有0.16 mg/L组鳃组织的SOD活性显著高于对照组(P < 0.05)；第7天时，3组实验组中鳃组织的SOD活性与对照组间均无显著差异(P > 0.05)(图 1a)。0.16 mg/L实验组厚壳贻贝内脏团的SOD活性在3个取样阶段均显著高于对照组(P < 0.05)，第3天达到峰值，分别为对照组的2.45、3.32、2.80倍；0.08 mg/L组内脏团的SOD活性在第3、7天显著高于对照组，分别为对照组的2.48和2.11倍；0.04 mg/L组鳃组织的SOD活性与对照组间无显著差异(P > 0.05)(图 1b)。

图 1(Fig. 1)

图 1 Cu2+对鳃(a)、内脏团(b)SOD活性的影响 Fig.1 Effects of Cu2+ on SOD activities of gill (a) and visceral mass (b) *为与对照组相比差异显著(P < 0.05)，下同 Single asterisk (*) indicates significant difference between treatment groups and control group (P < 0.05), the same as below

各实验组中，厚壳贻贝鳃组织、内脏团的CAT活性变化呈先上升后下降的趋势(图 2)。各实验组厚壳贻贝鳃组织的CAT活性在第1天即达到最高值，但仅有0.16 mg/L实验组鳃组织的CAT活性显著高于对照组(P < 0.05)，为对照组的3.02倍，其余实验组与对照组间均无显著差异(P > 0.05)(图 2a)。各实验组厚壳贻贝内脏团的CAT活性也在第1天即达到最高值，其中，0.16、0.08 mg/L实验组内脏团的CAT活性均显著高于对照组(P < 0.05)，分别为对照组的3.50、2.65倍；0.04 mg/L实验组内脏团的SOD活性与对照组间无显著差异(P > 0.05)。第3天仅有0.16 mg/L实验组内脏团组织的CAT活性显著高于对照组(P < 0.05)，第7天各实验组内脏团的CAT活性与对照组之间均无显著差异(P > 0.05)(图 2b)。

图 1(Fig. 1)

图 2 Cu2+对鳃(a)、内脏团(b)CAT活性的影响 Fig.2 Effects of Cu2+ on CAT activities of gill (a) and visceral mass (b)

各实验组厚壳贻贝鳃组织、内脏团的MDA含量均呈逐渐上升的趋势(图 3)。第3天开始，0.16、0.08 mg/L实验组鳃组织的MDA含量均显著高于对照组(P < 0.05)，0.04 mg/L实验组鳃组织的MDA含量与对照组间无显著差异(P > 0.05)(图 3a)。第1天开始，0.16、0.08 mg/L实验组内脏团的MDA含量均显著高于对照组(P < 0.05)，0.04 mg/L实验组内脏团组织的MDA含量与对照组间无显著差异(P > 0.05)；第3、7天时，3个实验组内脏团组织的MDA含量均显著高于对照组(P < 0.05)(图 3b)。

图 1(Fig. 1)

图 3 Cu2+对鳃(a)、内脏团(b)MDA含量的影响 Fig.3 Effects of Cu2+ on MDA content of gill (a) and visceral mass (b)

各实验组厚壳贻贝鳃组织的MT含量变化呈先上升后下降的趋势(图 4a)。厚壳贻贝鳃组织的MT含量在第1天即达到最高值，其中，0.16、0.08 mg/L实验组鳃组织的MT含量均显著高于对照组(P < 0.05)；分别为对照组的5.25、3.12倍，0.04 mg/L实验组内鳃组织的MT含量与对照组间无显著差异(P > 0.05)；第3、7天仅有0.16 mg/L实验组中鳃组织的MT含量均显著高于对照组(P < 0.05)，其余2个实验组与对照组间无显著差异(P > 0.05)(图 4a)。各实验组厚壳贻贝内脏团的MT含量变化呈逐渐上升的趋势(图 4b)。第1天开始，仅有0.16 mg/L实验组内脏团的MT含量显著高于对照组(P < 0.05)，为对照组的2.76倍，其余2个实验组内脏团的MT含量与对照组间无显著差异(P > 0.05)；第3天时，0.16、0.08 mg/L实验组内脏团组织的MT含量均显著高于对照组(P < 0.05)，分别为对照组的4.21、2.86倍，0.04 mg/L实验组内脏团组织的MT含量与对照组间无显著差异(P > 0.05)；第7天时，3个实验组中内脏团组织的MT含量均显著高于对照组(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 4 Cu2+对鳃(a)、内脏团(b)MT含量的影响 Fig.4 Effects of Cu2+ on MT content of gill (a) and visceral mass (b)

各实验组厚壳贻贝鳃组织、内脏团组织IBR值随暴露时间的变化见图 5。从图 5可以看出，1~7 d各实验组厚壳贻贝鳃组织、内脏团组织IBR值均呈先上升后下降的趋势。其中，0.16、0.08 mg/L实验组中鳃组织均在第3天达到峰值，0.04 mg/L实验组中鳃组织在第1天达到峰值，IBR峰值分别为2.23、1.24、0.41(图 5a)。0.16、0.08、0.04 mg/L实验组内脏团组织均在第3天达到峰值，IBR峰值分别为12.24、5.98、3.22(图 5b)。相同浓度下，内脏团组织IBR值高于鳃组织，各实验组厚壳贻贝鳃组织、内脏团组织IBR值均随实验浓度的下降而下降。

图 1(Fig. 1)

图 5 IBR值随时间的变化 Fig.5 IBR values changes over time

污染物在生物体内的富集可以触发氧化还原反应产生自由基，特别是细胞内ROS，如超氧阴离子、过氧化氢、羟基自由基及其衍生物(Oost et al, 2003)。一般情况下，ROS的产生和消除处于动态平衡，然而，高活性中间体可攻击细胞内外的靶标，当ROS累积到一定程度时，超过抗氧化防御系统的能力时，就会引起脂质过氧化(LPO)(Alzbeta et al, 2012)。SOD能将$\text{O}_{2}^{-}$转化成H₂O₂，CAT能进一步将H₂O₂转化成水，是抗氧化系统的重要组成部分(Solé et al, 1995、2000)，LPO可用丙二醛(MDA)含量代表(Masseroli et al, 1990)，MT (Thirumoorthy et al, 2007)在重金属胁迫过程中的变化是重金属污染的典型指标，上述指标均可以作为典型的生物标志物反映污染物对生物体组织的影响。

在本研究中，各实验组中鳃组织、内脏团组织MDA含量在第1天即开始上升(图 3)。表明Cu²⁺暴露产生的ROS已对鳃组织、内脏团组织造成了一定的氧化损伤。第1天时，各实验组鳃组织、内脏团组织SOD活性也开始上升，且高浓度暴露组均显著高于对照组(P < 0.05)，此时，ROS的大量累积诱导SOD活性发生代偿性上升以清除ROS，随后各实验组鳃组织SOD活性开始下降，内脏团组织SOD活性在第3天开始下降，表明ROS的大量累积超过了SOD清除自由基的能力，对鳃组织、内脏团组织造成了一定的损伤，抑制了SOD的活性。CAT与SOD功能相关，在抗氧化过程中仅次于SOD被诱导(Velisek et al, 2011)，各实验组中，鳃组织、内脏团组织CAT活性表现出与SOD活性类似的剂量–效应关系，均呈先上升后下降的变化趋势，SOD转化功能的下降也导致了CAT的诱导量下降。另外研究也表明，CAT也可以被$\text{O}_{2}^{-}$等灭活(Modesto et al, 2010)，这可能也是CAT活性下降的原因。

Zn、Cu、Cd、Hg等重金属能诱导MT的合成，并与重金属相结合，诱导程度与重金属浓度、种类具有一定的相关性，是生物体解毒代谢重金属的重要途径之一，MT含量的变化可以预测机体组织受重金属胁迫的压力，已经在众多研究中证实(Ridlington et al, 1979; Thirumoorthy et al, 2007)。Cu²⁺是生物体新陈代谢必需的元素之一，但过量的Cu²⁺对生物体组织会造成损伤。在本研究中，各实验组中鳃组织、内脏团组织MT含量第1天即开始上升，且高浓度暴露组均显著高于对照组(P < 0.05)(图 4)。此时，机体组织通过MT的合成并与Cu²⁺结合，减少Cu²⁺与机体细胞中具有高亲和力的巯基(-SH)基团非特异性结合，最终利用溶酶体将结合物从细胞质中排出，降低Cu²⁺的毒性(Isani et al, 2000)。同时，各实验组鳃组织、内脏团组织MT含量变化趋势存在差异，鳃组织MT含量在第1天峰值后开始逐渐下降，而内脏团组织MT含量呈逐渐上升趋势，这与不同组织对重金属的富集能力及组织之间的蛋白质代谢变化差异有关，相比较鳃组织，内脏团组织中的蛋白质水平更高(Legras et al, 2000)，同时，由于生物体自身的屏障属性，不同组织间的重金属分布状况存在差异，内脏团组织对重金属的富集能力高于鳃组织，MT的含量与重金属含量有一定的正相关关系(Domouhtsidou et al, 2004)，上述2个因素共同决定了内脏团组织中MT的含量高于鳃组织。

使用生物标志物评估毒性物质的毒性效应及作用途径是一个常用手段，通常情况下，多种生物标志物会同时出现，以解释不同的毒性效应，但过多的生物标志物混合就使整体的毒性效应及其变化趋势难以解释。本研究中，各浓度实验组生物标志物相比较对照组均表现出一定的变化，从不同角度反映出Cu²⁺对厚壳贻贝内脏团组织、鳃组织的影响。为了更准确地比较Cu²⁺对厚壳贻贝的整体胁迫压力，使IBR指数可以通过量化的数值直观比较Cu²⁺对厚壳贻贝不同组织的暴露毒性。在本研究中，厚壳贻贝的鳃组织、内脏团组织表现出不同的剂量–毒性效应结果(图 5)，对相同组织，高浓度实验组的IBR值高于低浓度实验组，而对相同实验浓度，内脏团组织的IBR值高于鳃组织。这个结果不仅验证了内脏团组织的主要解毒代谢功能，更量化了其与鳃组织的差异，表明IBR可以作为一种定量评价污染物毒性效应的有效工具。