东风螺(Babylonia sp)隶属于软体动物的腹足纲、新腹足目、蛾螺科、东风螺属(王如才等, 1988)，俗称花螺、泥螺、南风螺等，分布于热带和亚热带海域，是我国沿海重要的经济软体动物。我国现有方斑东风螺(B. areolata)、泥东风螺(B. lutosa)和台湾东风螺(B. formosae) 3种(张汉华等, 2004; 陈利雄等, 2004)。泥东风螺分布于我国福建至广西沿海地区。随着人类活动对海洋的影响，海洋中野生泥风螺锐减，我国研究人员已开展了泥东风螺的人工选育(叶泉土等, 2015a; 林国清等, 2015)、人工养殖(叶泉土等, 2015b)、人工增殖放流(叶泉土等, 2015b)和群体遗传多样性AFLP分析(秦溱等, 2014)的相关研究。

简单重复序列(Simple sequence repeats, SSR)又称微卫星DNA、短串联重复序列，一般以1~6个碱基为核心序列，广泛存在真核生物的基因组中，具有数量丰富、多态性高、共显性等特点(Powell et al, 1996)。Morgante等(1993)将微卫星用于遗传和物理图谱的构建、品种鉴定、基因定位、遗传多样性、分类和进化及比较基因组等方面的研究。目前，SSR标记主要分为基因组SSR(Genomic SSR, gSSR)和表达序列标签SSR(Expressed sequence tag SSR, EST-SSR)两种。EST-SSR反映的是基因的编码部分，可为功能基因提供更可靠的功能性标记，所以它在物种起源与进化、资源多样性、遗传作图、功能基因的发现与定位和比较基因组学研究等方面都有重要的利用价值。EST-SSR多态性可能与基因功能直接相关，因此，比gSSR标记具有更高通用性(Eujayl et al, 2002)。新一代测序技术可以对全基因组范围内的转录本进行大规模的高通量测序，并能产生海量的转录组数据(Simon et al, 2009)，这为功能基因组SSR标记的开发提供了更丰富和极有价值的可利用资源(Graham et al, 2010)。我国研究工作者采用新一代测序技术已从曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)(管奥等, 2018)、长江刀鲚(Coilia ectenes)(于爱清等, 2018)、栉江珧(Atrina pectinata)(李东明等, 2017)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)(李东宇等, 2017)、扇贝(Chlamys farreri) (张广明等, 2018; 倪守胜等, 2018)、黄口荔枝螺(Thais luteostoma)(李威等, 2015)和泥蚶(Tegillarca granosa) (史松富等, 2013)等水生动物中成功开发并应用于物种群体遗传多样性分析的SSR标记。本课题组利用软件分析泥东风螺转录组数据中微卫星分布特点和规律，利用筛选SSR标记对野生群体和养殖群体的遗传多样性进行分析，可为泥东风螺微卫星标记的开发及应用研究奠定基础。

野生泥东风螺采自福建连江和长乐，共62只。养殖群体来源于福建长乐泥东风螺育种场，共206只。

泥东风螺转录组数据是由腹足和肝胰腺组织的mRNA建立混合池，经Illumina HiSeq^TM 2000高通量测序平台获得的转录组数据文库。

利用软件MISA(Kanehisa et al, 2008) (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对泥东风螺转录组中Unigene的cDNA序列数据进行SSR搜索，设置参数：单碱基最少重复10次以上，双碱基最少重复6次以上，3~6碱基最少重复5次以上；混合重复的2个重复之间的距离不能大于100 bp。随机挑选EST-SSR序列，参照引物设计原则(张新宇等, 2004)，利用软件Primer premier 5.0在重复序列两侧保守区设计微卫星扩增引物。

取泥东风螺腹足，采用天泽基因柱式动物DNA提取试剂盒提取泥东风螺总DNA。总DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。SSR分析采用20 μl PCR扩增反应体系，扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，退火(退火温度见表 3) 30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸5 min，在4℃条件下保存。扩增产物采用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，人工读带后记录带型。

用PopGene 1.3.1(Yeh et al, 1997)软件计算有效等位基因数(Effective numbers of allele, N_e)、观测杂合度(Observed heterozygosity, H_o)、(Expected heterozygosity, H_e)、群体间基因流(N_m)、固定系数(F_st)和群体近交系数(F_is)。位点多态性(Polymorphis information content, PCI)采用软件包计算，Cervus 3.03 (Kalinowsk et al, 2007)软件计算哈迪温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)。

利用MISA软件对Unigenes的cDNA序列数据中筛选1 kb以上的Unigenes进行SSR分析，共筛选到16324个SSR符合设置条件(表 1)，泥东风螺转录组中SSR种类丰富，共有181种重复类型；各种类型的出现频率差异较大，主要集中在单核苷酸重复、二核苷酸重复和三核苷酸重复，分别占SSR总数量的40.17%、29.75%和15.27%，四核苷酸重复和五核苷酸重复数量少，分别占0.76%和0.04%，未发现多于5个核苷酸重复。SSR在整个泥东风螺转录组中的出现频率和发生频率分别为13.62%和6.86%，平均每350.78 kb出现1个SSR。各种重复基元出现频率差异大(表 2)，如：AC/GT重复基元占二核苷酸重复的70.58%，AGG/CCT和ACC/GGT重复基元分别占三核苷酸重复的22.60%和20.50%。从整体分布分析中发现多核苷酸重复序列以重复6次出现频率占优势。长度为12~20 bp的SSR占63.95%，长度为21~25 bp的SSR占9.14%，总体的平均长度为18.4 bp。

表 1(Tab.1)

表 1 泥东风螺转录组中EST-SSRs重复次数分布 Tab.1 Repeat number of EST-SSRs in B. lutosa transcriptome 重复类型 Type of SSR 重复次数Repeat number 总计 Total 比例 Ratio (%) 5 6 7 8 9 10 11 ＞12 单核苷酸重复 Mononucleotide - - - - - - 2864 3658 6522 40.17 二核苷酸重复 Dinucleotide - 1937 1292 862 510 199 29 1 4830 29.75 三核苷酸重复 Trinucleotide 1603 715 155 6 0 0 0 0 2479 15.27 四核苷酸重复 Tetranucleotide 110 14 0 0 0 0 0 0 124 0.76 五核苷酸重复 Pentanucleotide 7 0 0 0 0 0 0 0 7 0.04 混合重复SSR - - - - - - - - 2272 14.00 总计Total 1720 2666 1447 868 510 199 2893 3659 16234 100.00 比例Ratio(%) 10.60 16.42 8.91 5.35 3.145 1.23 17.82 22.54 100.00 -

表 1 泥东风螺转录组中EST-SSRs重复次数分布 Tab.1 Repeat number of EST-SSRs in B. lutosa transcriptome

表 2(Tab.2)

表 2 二核苷酸和三核苷酸EST-SSRs不同重复基元分布比例 Tab.2 Percentage of different motifs dinucleotide and trinucleotide EST-SSRs 重复类型 Type of SSR 重复次数Repeat number 总计 Total 比例 Ratio (%) 5 6 7 8 9 10 11 12 AC/GT - 1345 898 648 353 147 18 0 3409 70.58 AG/CT - 378 275 152 108 43 11 1 968 20.02 AT/AT - 202 108 55 49 9 0 0 423 8.76 CG/CG - 12 11 7 0 0 0 0 30 0.63 AAC/GTT 248 95 16 0 0 0 0 0 359 14.49 AAG/CTT 140 56 11 1 0 0 0 0 208 8.40 AAT/ATT 61 27 8 0 0 0 0 0 96 3.88 ACC/GGT 310 158 39 1 0 0 0 0 508 20.50 ACG/CGT 51 34 6 1 0 0 0 0 92 3.72 ACT/AGT 20 7 1 0 0 0 0 28 1.13 AGC/CTG 234 119 35 1 0 0 0 0 389 15.70 AGG/CCT 376 155 29 0 0 0 0 0 560 22.60 ATC/ATG 126 59 8 0 0 0 0 0 193 7.79 CCG/CGG 37 5 3 1 0 0 0 0 46 1.86

表 2 二核苷酸和三核苷酸EST-SSRs不同重复基元分布比例 Tab.2 Percentage of different motifs dinucleotide and trinucleotide EST-SSRs

随机选取其中50条序列设计引物，通过对福建野生泥东风螺62只个体DNA样本进行PCR扩增和分型，获得23个多态性位点(表 3)。23个位点的等位基因数为2~7个不等，平均N_a为3.5，平均N_e为0.491，平均N_o为0.477，平均PIC为0.451。HWE平衡检验显示，4个位点显著偏离平衡(P < 0.05)(表 4)。

表 3(Tab.3)

表 3 泥东风螺EST-SSR引物信息 Tab.3 Information of EST-SSR primer in the B. lutosa 位点 Locus 正向引物序列 Forward primer (5′~3′) 反向引物序列 Reverse primer (5′~3′) 退火温度 Annealing temperature (℃) B01 GCCAGTATTTGCCCAACAGT TGGAGGTGGTGGGGAGTGT 52 B02 GTGATGGATTACGAGACTGAT CTACCTGTCCGTCCCTTC 55 B03 GATGACCTACTGACCTCCTA AACCTTGACACCCTTTGC 55 B04 ACCCTCGCCACTAACTACCT GGCGTGGTCGTCGTTT 58 B05 TCCGACTCGCAACCTTCT ACCCGAATGTAACAACTAACC 58 B06 CCTGTGAGGTGAAGGTTGAC AACTGTTACGATAGGCAGCAAT 58 B07 CGCAGACGGCATGTTATCCT TTCTCTCCTCCATCTATGCTGTG 58 B08 CTGAATGATACACCCTGACAA AGTAAGTAGCTCAGGGTAAGATT 58 B09 ACTGACGATGACAAGACAAT CACTGGACCCTTCGTTAGAT 58 B10 TAAGTGGATAAAGTAAAGGAGCA GTGGAGAACAAGTCCAAGTCAT 58 B11 TGCGGAATGCAGCCACTCT CTCACAACCTCCTGGTCTCGG 58 B12 AGTGCTAATATCTTCACCGTTG TGGAGCCACTGACAGGACTA 58 B13 TACAGATATAACTACATGGTGGAGA TATGTATGAAAGCAGCACCAAT 58 B14 AACATTTGGTCCAGATTGCG GAATTCACGGAGGAGCAGC 58 B15 GTTTTGCAGATCGATCACGT AATCAACCAGCACCAGAGAGT 58 B16 CAACCCAACATCAAGACCAT GCGTGGCGAGCTATGACAT 58 B17 TGTGCTCCGCCTCTATGTT GGGCGAACAGAACGAATG 58 B18 AAGACTCACCGTGTGACAGTAT ACACTGCCGCTGACTTGAC 58 B19 GCTTGCCGTTCGTTCTGT TGCCTGGAGGAGAGTGTTGT 58 B20 CTTGCTCTTTCTGTGCTATCGTT TCAGAGTAACAGAGAGACCTTTCAA 58 B21 GTGAAGAGGTATGTCGTTATGA ATGACGACGAGTAAATGTGCT 58 B22 GAGATGGAAAATGGAGTGACAGA CTGTACAAATAGGTCCAGGTGC 58 B23 GCAGCACCACGCAGACAAT GACGGACTCTGATTGGCTGAT 58

表 3 泥东风螺EST-SSR引物信息 Tab.3 Information of EST-SSR primer in the B. lutosa

表 4(Tab.4)

表 4 泥东风螺23个EST-SSR位点的野生群体和养殖群体遗传多样性分析 Tab.4 Genetic diversity of wild and breeding populations in B. lutosa at 23 EST-SSR loci 位点Locus 野生群体WP wild population 养殖群体BP breeding population Fst Nm* Na Ho He HWE PIC Fis Na Ho He HWE PIC Fis B-01 2 0.936 0.937 1.000 0.061 -0.033 2 0.979 0.979 1.000 0.020 -0.011 0.006 43.524 B-02 7 0.066 0.223 0.009 0.737 -0.214 7 0.302 0.293 0.022 0.676 0.011 0.014 17.941 B-03 3 0.259 0.356 0.117 0.563 -0.161 3 0.552 0.419 0.000 0.484 0.227 0.015 16.485 B-04 5 0.145 0.241 0.677 0.712 -0.136 5 0.271 0.269 0.000 0.678 0.001 0.048 4.9386 B-05 6 0.410 0.355 0.066 0.587 0.108 5 0.385 0.349 0.220 0.597 0.053 0.001 216.914 B-06 2 0.7107 0.727 1.000 0.234 -0.073 2 0.719 0.750 0.085 0.218 -0.129 0.001 543.787 B-07 5 0.532 0.548 0.700 0.422 -0.043 5 0.573 0.591 0.543 0.382 -0.048 0.001 261.297 B-08 4 0.468 0.476 0.904 0.466 -0.023 4 0.469 0.545 0.000 0.416 -0.171 0.008 30.280 B-09 3 0.472 0.560 0.203 0.341 0.203 3 0.563 0.538 0.631 0.360 0.051 0.014 17.462 B-10 3 0.630 0.640 0.761 0.320 -0.039 3 0.714 0.711 0.793 0.258 0.006 0.003 91.502 B-11 3 0.403 0.463 0.670 0.444 -0.120 3 0.552 0.597 0.001 0.354 -0.114 0.045 5.292 B-12 3 0.500 0.454 0.243 0.483 0.077 4 0.542 0.502 0.084 0.437 0.078 0.145 1.472 B-13 7 0.081 0.190 0.086 0.777 -0.145 7 0.130 0.183 0.007 0.787 -0.068 0.005 48.734 B-14 2 0.548 0.530 0.790 0.358 0.032 2 0.776 0.793 0.4801 0.186 -0.082 0.087 2.615 B-15 5 0.361 0.304 0.0170 0.630 0.101 4 0.589 0.278 0.000 0.633 0.429 0.005 49.298 B-16 5 0.119 0.256 0.011 0.690 -0.103 4 0.443 0.385 0.043 0.564 0.092 0.039 6.251 B-17 3 0.726 0.728 0.800 0.250 -0.017 3 0.823 0.818 0.253 0.172 0.026 0.005 50.996 B-18 2 0.516 0.585 0.230 0.327 -0.174 2 0.656 0.635 0.437 0.298 0.057 0.003 75.398 B-19 4 0.403 0.317 0.1730 0.617 0.119 4 0.418 0.323 0.109 0.613 0.136 0.001 161.782 B-20 3 0.519 0.542 0.7720 0.351 0.201 2 0.448 0.510 0.024 0.365 -0.130 0.006 38.700 B-21 3 0.661 0.605 0.0585 0.352 0.135 3 0.672 0.673 0.955 0.293 -0.005 0.002 103.480 B-22 3 0.613 0.374 0.000 0.541 0.377 3 0.625 0.619 0.322 0.332 0.013 0.102 2.188 B-23 3 0.903 0.877 0.217 0.116 0.204 3 0.766 0.751 0.556 0.230 0.058 0.655 0.132 平均Mean 3.5 0.477 0.491 0.4130 0.451 0.012 3.6 0.564 0.544 0.285 0.407 0.021 0.053 4.450

表 4 泥东风螺23个EST-SSR位点的野生群体和养殖群体遗传多样性分析 Tab.4 Genetic diversity of wild and breeding populations in B. lutosa at 23 EST-SSR loci

利用23个多态性位点分析泥东风螺野生群体和养殖群体遗传多样性(表 4)，结果显示，福建野生群体H_e值为0.190~0.937，H_o为0.065~0.936，PIC为0.061~ 0.777，其中，9个微卫星位点表现为高度多态性(PIC > 0.5)，11个位点表现为中度多态性(0.5 > PIC > 0.25)，3个位点表现为低度多态性(PIC < 0.25)。养殖群体N_e(0.183~0.979)和N_o(0.130~0.980)的平均值均高于野生群体，但PIC(0.020~0.787)的平均值低于野生群体。SPSS分析群体间N_e、N_o和F_is差异显著(P < 0.05)，PIC差异极显著((P < 0.01)。养殖群体高度多态性位点和低度多态性位点分别为7个和5个。在养殖群体样本中检测到B05、B08、B12、B15、B16和B20位点中出现等位基因缺失现象。野生群体和养殖群F_is分别为-0.214~0.377和-0.130~0.129，群体的F_is平均值都大于0，在野生群生群体和养殖群体中，位点F_is < 0的分别有13个和9个。HWE平衡检验显示，野生群体和养殖群体分别有4个和9个位点偏离平衡。

Popgene分析野生群体与养殖体间的位点基因流值(N_m)为0.132~543.787(表 4)，平均N_m为4.450，说明这2个群体间的遗传分化小。群体间位点遗传分化指数(F_st)为0.001~0.655(表 4)，平均F_st为0.053，属于遗传分化中等(0.05 < F_st < 0.15)。Popgene分析野生群体与养殖体间两群体这间的遗传距离为0.892 (Yeh et al, 1997)。

不同物种转录组数据库中微卫星分布的频率存在差异。本研究分析了泥东风螺转录组中SSR的分布频率和重复基元的特点。从泥东风螺SSR重复基元来看，二核苷酸重基元中AC/GT占70.58.%，这与其他水产动物中AC/GT重复最多一致(曾聪等, 2013)。三核苷酸重基元占总数15.27%，其中，CCG/CGG重复基元数量最少，这与一些真核生物中发现一定比例的CCG/CGG重复相似(Toth et al, 2000)。Schlottere等(1992)推测微卫星的长度因在复制过程中的滑动而反映了微卫星位点获得(或失去)重复基元的活跃程度。Schlotterer(2000)认为，SSR位点的变异频率与基元重复数存在一定正相关，即重复次数越多，SSR产生变异的可能性越大。Temnykh等(2001)进一步研究表明，SSR的长度是影响其多态性高低的重要因素，据此分析，泥东风螺转录组基因所含的微卫星长度绝大部分分布在12~25 bp之间，推测是受到强烈趋同选择的压力影响。

对福建野生群体和养殖群体的位点各项参数进行分析，结果显示，野生群体杂合子过剩(F_is < 0，表明存在杂合子过剩)现象比养殖群体多4个位点。养殖群体有6个位点检测到等位基因缺失，这可能与本研究选取样本数量较少及养殖群体选择的亲本来自不同地理群体有关。H_o和H_e是判定群体遗传多样性水平的重要指标，养殖群体中平均H_o和H_e显著高于野生群体，推测是因目前养殖群体选育采用的技术策略导致养殖群体的遗传多样性发生变化。

野生群体和养殖群体间F_st为0.053 (0.05 < F_st < 0.15)，说明遗传分化中等，但已接近遗传分化较弱(0 < F_st < 0.05)水平。基因流(N_m)是基因从一个种群到另一个种群的转移。在两群体间位点平均基因流(N_m)为4.450(N_m > 4)，表明不同地理群体亲本种群间的基因交流充分。

本研究中，泥东风螺养殖群体的遗传多样性显著低于野生群体，这与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)(王军等, 2018)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(王沈同等, 2018)、大黄鱼(Larimichthys crocea) (赵广泰等, 2010)、鳜(Siniperca chuatsi)(郑荷子等, 2013)水产动物养殖群体比野生群体遗传多性低的研究结果一致，其原因可能为目前养殖泥东风螺繁育亲本群体来源和个体数量问题。研究表明，本研究所开发的SSR具有较高的多态性，研究的群体具有较高的遗传多样性，具有进一步选育的价值。

SSR标记在水生生物之间通用性较好(张琼等, 2010; 刘必谦等, 2007)，SSR遗传作图将使物种之间连锁信息的转换更快，实现多个图谱整合，从而更有利于比较基因组学的研究。本研究开发的泥东风螺EST-SSR标记对泥东风螺的亲子谱系分析、群体遗传结构分析、图谱构建、增殖放流效果评估和分子辅助育种等研究方面具有重要的意义。