中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)是中国近海特有种，主要分布在黄海、渤海海区的山东、河北、辽宁、天津及江苏近海和朝鲜半岛西海岸(王清印, 2014)。其适应能力强、生长快、耐低温、品质好、营养价值高，是我国重要的海水养殖经济物种之一。20世纪80年代，中国明对虾养殖技术得到突破，中国明对虾的养殖产量迅速增加，1991年总产量达20万t，成为当时我国最重要的对虾养殖品种(李健等, 2015)。1993年开始暴发的白斑综合症病毒(White spot syndrome virus, WSSV)对中国明对虾产业造成了沉重的打击。随之而来的养殖环境恶化，种质资源衰退等问题，均严重影响了整个养殖业的发展。为了保护中国明对虾的种质资源，开展优良群体的选育工作，培育高产、抗逆的中国明对虾新品种已成为必然。

利用传统数量遗传学方法在对虾选择育种中进行遗传参数评估和遗传解析已经取得了很大的进展(栾生等, 2013; 何玉英等, 2011)。随着现代生物技术的发展，相继涌现出RFLP、AFLP、SSR和SNP等多种分子标记技术，这些分子标记技术为群体的遗传结构评估提供新的途径。SNP标记作为遗传学研究中最为流行的分子标记，与传统分子标记相比，具有在基因组中分布广泛、密度高、稳定遗传等优势，是目前水产动物高密度遗传图谱构建、群体遗传学研究和种质资源保护利用等领域的理想标记(徐安毕等, 2007; Li et al, 2003; 黄映萍, 2010; 刘安然等, 2019)。然而，水产物种的基因组研究背景相对滞后，基因组的杂合度和高复杂性也限制了高通量测序的应用。近年来，简化基因组测序的发展为水产物种提供了新的手段。2b-RAD (Wang et al, 2012)技术是近年来在非模式生物中进行SNP开发最为有效、经济的简化基因组测序方法之一。该技术由于具有酶切DNA片段大小一致、文库构建简单快速、标签密度易于调节、成本低廉、准确性高等优点得到广泛的应用。

本研究的实验对象中国明对虾“黄海2号”是采用群体、家系与多性状复合育种技术，经连续选育13代获得的新品种。该品种生长速度快、具有明显的抗病性(李旭鹏等, 2018)。根据多性状复合育种技术制定的配种方案，该群体获得了可观的遗传进展(Sui et al, 2018)。但累代人工选育是否会降低该选育群体的遗传多样性、影响中国明对虾的选育效果，尚缺少实际检测数据的支撑。目前，虽然已有学者通过RAPD分析(石拓等, 2001)、线粒体DNA序列分析(张辉等, 2010)、AFLP分析(安丽等, 2008)和SSR分析(张天时等, 2005)对中国明对虾养殖群体进行了遗传多样性研究，吴莹莹等(2013)利用非探针HRM开发的39个SNP，分析了中国明对虾群体的遗传多样性。但这些研究的标记数目较低，且尚缺少中国明对虾人工选育群体的分析报道。本研究利用2b-RAD简化基因组技术，对中国明对虾“黄海2号” G₉~G₁₁ 3个连续选育世代的亲本群体进行高通量SNP开发，并基于这些标记分析了遗传多样性参数、群体间遗传分化和遗传距离，从分子水平揭示不同世代的群体遗传结构，了解人工选育方案对其遗传结构和遗传多样性的影响，从而为选育工作提供可靠的理论基础，确保选育工作顺利进行。

实验所用中国明对虾“黄海2号”取自中国水产科学研究院黄海水产研究所水产遗传育种中心。2015~ 2017年(G₉~G₁₁)该育种群体按照多性状复合育种的配种方案进行家系构建、选育。选取在传代过程中用于构建核心家系的亲本，置于–80℃超低温冰柜内保存备用。该亲本群体包括2015年137尾、2016年244尾和2017年268尾，共计649尾。

采用TIANamp Marine Animals DNA Kit (天根生化科技有限公司，北京)提取中国明对虾肌肉组织基因组DNA，通过琼脂糖检测和NanoDrop 2000紫外分光光度计(Thermo Fisher Scientific)对抽提的DNA质量和浓度进行检测。DNA产物置于–20℃保存备用。

利用2b-RAD标签串联技术进行文库构建，文库的构建过程参考Wang等(2012)。选用的IIB型限制性内切酶为BsaXI，为了得到尽可能多的标记，所有样品均采用标准型5′-NNN-3′接头建库。文库质控合格后在Illumina Hiseq X Ten平台进行Paired-end测序(由青岛欧易生物科技有限公司完成)。原始数据下机后，按照以下条件进行过滤：剔除不含有BsaXI酶切识别位点的序列；剔除低质量序列(即大于10个碱基的质量分数小于20的序列)；剔除有10个以上连续相同碱基的序列。由此获得可用于后续标记筛查、分型的高质量序列。

由于中国明对虾尚未有发表的全基因组序列作为参考，本研究借用课题组前期构建的中国明对虾高密度遗传连锁图谱数据(标记密度为0.41 cM, 尚未发表)，利用该作图群体2个亲本构建的已有Reference (命名为Family- Reference，该参考标签库可靠性已在图谱构建中得到验证)进行后续的标记筛查、分型。该Reference是在核心群体中选取2个性状差异大的雌雄代表性个体进行测序标签(Tag)聚类，构建的RAD分型参考标签库。全基因组标记分型参照RAD-typing分型策略(Fu et al, 2013)。分型过程是将本研究所有测序个体(作图群体的2个亲本)的高质量reads，利用SOAP软件(Li et al, 2009) (参数设置为：–M4–v2–r0)比对到该Reference上，筛查标记位点及分型信息。对于共显性的SNP标记，利用最大似然法ML得到每个个体在每个位点的基因型。为了保证SNP位点分型的准确性和严谨性，进行以下条件的过滤：在个体内标签深度500以上的不进行分型。只留取标签内最多有3个SNP的标签位点；标记在80%的个体中可以分型；最小等位基因频率MAF≥0.01。

利用Genepop软件(Version 1.0.5) (Rousset et al, 2008)对SNP位点的分型结果进行处理，计算其有效等位基因数(N_e)、期望杂合度(H_e)、观测杂合度(H_o)、多态信息含量(PIC)、最小等位基因频率(MAF)和等位基因频率等遗传参数，并计算世代间的遗传分化系数(F_st)、近交系数(F_is)、群体间的遗传距离(DR)和基因流(N_m)。利用vcftools软件(Version 0.1.14) (Danecek et al, 2011)计算核苷酸多样性(P_i)和转换/颠换(T_s/T_v)的比值。使用Admixture软件(Version 1.3.0) (Alexander et al, 2009)分析中国明对虾的群体结构。

提取的基因组DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，图 1为部分基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果，提取的基因组DNA无明显拖带现象，完整性较好。用NanoDrop 2000紫外分光光度计检测显示，OD_{260 nm}/OD_{280 nm}在1.8~2.0之间，表明提取的基因组DNA质量较高，可用于后续的建库和测序。

图 1(Fig. 1)

图 1 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果 Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA

DNA质检合格后，为了保证每个文库的质量，对构建的每个文库进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，可直观的显示文库构建是否成功。图 2为聚丙烯酰胺凝胶电泳检测文库质量。

图 1(Fig. 1)

图 2 目的片段PCR产物结果 Fig.2 PCR product of target fragment

本研究基于2b-RAD测序技术构建中国明对虾649个样品的标签测序文库，测序获得1217161378条原始Reads，平均每个样本测序Reads数为28938658。质量控制后，平均每个样本中获得含BsaXI酶切位点的高质量Reads占测序原始Reads的74.86%。引用的高质量参考(Reference)共包含286345条共显性标签序列。在对相同的Reads聚类得到特异性标签后，平均每个样本获得特异性标签数目为343262，样本的平均测序深度为43.08×。3个选育世代获得66985个高质量的SNP位点，用于后续群体遗传分析。

统计SNP分型结果中各位点的突变类型特点。如图 2所示，C/T转换类型最多，占所有碱基突变类型的39%，A/G转换类型占14%。G/C颠换类型最少，占所有碱基突变类型的6%，A/C与A/T颠换类型均占14%，G/T颠换类型占8%。转换与颠换(T_s/T_v)之比为1.402。

由于本次分型只统计了二等位基因型，因此，每个SNP位点观测等位基因数目(N_a)均为2。位点的平均分型率为92.47%。结果显示(表 1)，G₉~G₁₁世代有效等位基因(N_e)平均分别为1.2069、1.2324和1.2475；平均期望杂合度(H_e)分别为0.1434、0.1584和0.1671；测得平均观测杂合度(H_o)分别为0.1388、0.1515和0.1609；核苷酸多样性(P_i)分别为0.1439、0.1587和0.1674。G₉~G₁₁选育世代多态信息含量(PIC)的均值分别为0.1241、0.1360和0.1430；最小等位基因频率(MAF)分别为0.1074、0.1038和0.1146。近交系数分别为0.1141、0.0701和0.0532。

表 1(Tab.1)

表 1 不同世代SNP位点的遗传多态性参数分析* Tab.1 Analysis of genetic polymorphism parameters of SNP loci in different generations 世代 Population 期望杂合度 He 观测杂合度 Ho 多态信息量 PIC 有效等位基因数 Ne 核苷酸多样性 Pi 最小等位基因频率 MAF 近交系数 Fis G9 0~0.6443 (0.1434) 0~1 (0.1388) 0~0.5708 (0.1241) 1~2.8111 (1.2069) 0~0.6470 (0.1439) 0.0109~1 (0.1074) 0.1141 G10 0~0.6454 (0.1584) 0~1 (0.1515) 0~0.571 (0.1360) 1~2.8199 (1.2324) 0~0.6468 (0.1587) 0.0100~1 (0.1038) 0.0701 G11 0~0.6578 (0.1671) 0~1 (0.1609) 0~0.5841 (0.1430) 1~2.9223 (1.2475) 0~0.6591 (0.1674) 0.0100~1 (0.1146) 0.0532 *：括号中的数据为平均值 *: Data in brackets are means

表 1 不同世代SNP位点的遗传多态性参数分析* Tab.1 Analysis of genetic polymorphism parameters of SNP loci in different generations

G₉~G₁₁所有位点的平均等位基因频率分别为86.92%、86.31%和85.87%。3个世代选育群体野生型等位基因频率整体呈现一定的下滑趋势，但差异并不显著。从每个位点统计3代等位基因的变化规律，其中，逐代下降的SNP数量为20348，占30.38%；逐代上升的SNP数量为8558，占12.78% (表 2)，逐代下降的位点数是逐代上升位点的2.4倍。从逐代下降的位点中，筛选出50个变化程度高的位点，变化程度在24.43%~29.76%之间，平均值为27.56%，从逐代上升的位点中，筛选了50个变化程度高的位点，变化程度在27.16%~30.45%之间，平均值为28.79%，二者之间也无显著性差异(P=0.552)，图 3和图 4表示选取的50个具有代表性的等位基因频率变化情况。

表 2(Tab.2)

表 2 G9~G11世代SNP位点的基因频率变化规律 Tab.2 Gene frequency variation of SNP loci in G9~G11 generations 项目 Item 变化趋势Variation tendency 逐代下降 Decline 逐代上升 Rise SNP数量 Number of SNP 20348 8558 所占比例 Ratio 30.38% 12.78%

表 2 G9~G11世代SNP位点的基因频率变化规律 Tab.2 Gene frequency variation of SNP loci in G9~G11 generations

图 1(Fig. 1)

图 3 SNP位点碱基突变类型及其比例 Fig.3 Base mutation type and frequency of SNP

图 1(Fig. 1)

图 4 G9~G11 50个逐代下降SNP位点的基因频率变化 Fig.4 Allele frequency changes in 50 gradual descending SNP loci

群体间总的遗传分化系数为0.0061。随着选育世代的增加，遗传分化系数在相邻世代之间相继减小，G₉与G₁₀间F_st值为0.0029，G₁₀与G₁₁间F_st值为0.0026，两两比较所得F_st值均小于0.05，3个选育世代群体间遗传分化较弱。从图 6可看出，3个亚群的波形一致性很高，这再次说明3个选育世代遗传分化很弱，遗传结构基本稳定。选育世代间的遗传距离(DR)范围为0.0026~0.0040，G₉与G₁₀间的遗传距离为0.0029，G₁₀与G₁₁间的遗传距离为0.0026，相邻世代的遗传距离也逐步减小。G₉与G₁₀间的基因流(N_m)为86.83，G₁₀与G₁₁间的基因流(N_m)为94.63。

图 1(Fig. 1)

图 6 中国明对虾样品聚类结果 Fig.6 Sample clustering results of F. chinensis

表 3(Tab.3)

表 3 中国明对虾G9~G11世代遗传分化系数(Fst)和遗传距离(DR) Tab.3 Genetic differentiation coefficient (Fst) and genetic distance (DR) in G9~G11 F. chinensis 群体Population G9 G10 G11 G9 – 0.0029 0.0040 G10 0.0029 – 0.0026 G11 0.0040 0.0026 – 注：下三角为群体间遗传分化系数(Fst)，上三角为群体间遗传距离群体(DR) Note: The lower triangle is the genetic differentiation coefficient (Fst) between groups, and the upper triangle is the genetic distance group between groups (DR)

表 3 中国明对虾G9~G11世代遗传分化系数(Fst)和遗传距离(DR) Tab.3 Genetic differentiation coefficient (Fst) and genetic distance (DR) in G9~G11 F. chinensis

由于中国明对虾没有已发表的参考基因组序列，依据RAD-typing的分型策略(Fu et al, 2013)，需要从测序数据中提取含有酶切识别位点的Reads，使用ustacks(version 1.34)软件进行聚类，从头构建一个供分型使用的参考标签库(Reference)。本研究在选择参考标签库的过程中，比较了使用2种参考序列(Reference)对开发SNP标记的影响，即分别利用中国明对虾高密度连锁图谱作图群体2个亲本构建的family-Reference以及从选育群体中随机选取4个测序良好的个体构建的progeny-Reference，使用相同的分型标准对3代选育群体进行分型。对于2种Reference分型得到的标记进行比对，在允许2个错配的条件下，共比对到60176个标记，即标记共有率为92.45%，2种Reference的基因组覆盖度和代表性均良好。分型后，分别得到66304和66985个SNP，2次分型得到的标记数均无显著差异。考虑到遗传图谱的前期工作基础，最终确定了family-Reference作为参考序列(待发表数据)。经过2b-RAD测序后，每个样本得到的原始Reads从29119715~89664272不等。质量过滤后，平均每个样本中获得含有BsaXI酶切位点的高质量Reads占测序原始Reads的74.86%，平均每个个体的测序深度为43.08×。说明了本次构建的文库质量较高，测序深度达到了高准确度下的分型标准(Jiao et al, 2014)。

本研究中选取的每个世代的测序样本数都不一致(G₉选取137尾、G₁₀选取244尾、G₁₁选取268尾)，是由于当年需要构建的家系数目不同。理论上，不同的样本数会造成统计上严谨度的不同，另外，个体数量少的G₉世代，也有137个样本提供分型，因此认为，虽然样品数量不同但并不会对实验结果造成影响。不同世代样本数不同，在遗传多样性分析中也有报道，如Zhang等(2018)曾经利用类似的方法对3个世代连续选择的栉孔扇贝(Chlamys farreri)进行分析，从G₁世代抽取76只，G₂世代抽取107只，G₃世代356只，2b-RAD分型得到的18450个标记进行群体遗传学分析，也发现样本量不同对结果几乎无影响。

SNP碱基替换类型分为转换(T_s)与颠换(T_v)两类，转换发生在A与G或C与T之间，颠换有4种，发生在A与C、A与T、G与C和G与T之间。理论上发生转换的概率与发生颠换概率(T_s/T_v)比值为0.5，但实际上T_s/T_v值往往大于0.5，这种差异性被称为“转换性偏差” (Gojobori et al, 1982; Li et al, 1984; Collins et al, 1994)。本研究验证的SNP多态性类型存在明显的转换型偏差现象，T_s/T_v=1.402 > 0.5。不同物种间转换/颠换比值存在很大的差距。马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞转录组中，转换与颠换的比值为0.5，与理论比率相符(王忠良等, 2018)。凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)转录组中，转换和颠换的比率为2.0(于洋, 2014)，而鲍中碱基的转换大大多于碱基的颠换，转换与颠换比为2.33 (王鹭骁等, 2006)。产生这种差异的原因可能与不同物种在进化中承受的选择压力有关(Zhao et al, 2002)。

人工定向选育是一个复杂的过程，累代的人工选择压力及选择环境势必会造成群体遗传水平的波动，而遗传多样性是生物多样性的基础，对物种的生存、繁衍和进化至关重要(张荣良等, 2016)。人工选择育种的目的是在保持选育群体具有一定遗传多样性的基础上，筛选获得具有目标性状的选育新品种或新品系(张荣良等, 2016)。因此，在水产良种培育过程中维持群体的遗传多样性，是种质资源利用的前提条件。本研究中的3个选育世代SNP标记从整体水平上，野生型的平均等位基因频率呈现一定的下降趋势，但并不显著，分别为86.92%、86.31%和85.87%。在人工选育的背景下，本研究显示群体遗传多样性没有明显变化，推测原因为人工选择只定向改变少数位点的基因频率。本研究进一步从每个SNP位点角度统计等位基因变化规律，并从其中选取50个变化程度大的连续下降和连续上升的位点(图 4和图 5)，二者等位基因频率变化程度分别为27.56%和28.79%，无显著性差异(P=0.552)。这些位点的变化是否与性状存在遗传上的相关性还需进一步验证。

图 1(Fig. 1)

图 5 G9~G11 50个逐代上升SNP位点的基因频率变化 Fig.5 Allele frequency changes in 50 gradual rising SNP loci

多态信息含量(PIC)和杂合度是2个较好的衡量基因多态性的指标。当PIC < 0.25时，为低度多态位点；0.25 < PIC < 0.5时，为中度多态性位点；PIC > 0.5时，表示该位点为高度多态性位点(Botstein et al, 1980)。从本研究统计结果来看，3个连续世代的PIC值逐渐升高，PIC分别为0.1241、0.1360和0.1430 (表 1)，与吴莹莹等(2013)利用非探针HRM法对中国明对虾39个EST-SNP位点进行了遗传多态性分析，PIC为0.0476~0.375，平均值为0.272的结果相似。但均比Botstein等(1980)提出的衡量群体基因变异程度低等的标准值低很多。3代选育群体的平均杂合度(H_o)逐渐上升，分别为0.1388、0.1515和0.1609 (表 1)，比利用微卫星标记进行研究所报道的数值低(刘萍等, 2004; 张天时等, 2005)，产生这样的结果应该是所用分子标记的不同造成的。由于SNP是二等位基因分子标记，多态信息含量比SSR低，但大量位点的应用能够弥补多样性的不足。随着选育世代的进行，3个人工选育群体的多态信息含量和杂合度逐渐增大，该结果与赵广泰等(2010)利用微卫星分析大黄鱼(Larimichthys crocea)连续4代选育群体遗传多样性与遗传结构时，发现的F₁~F₄代13个微卫星位点的PIC从0.638下降到0.524，H_o从0.779下降到0.532的结果不同，也与马冬梅等(2018)分析华南鲤(Cyprinus carpio rubrofuscus)4个连续选育世代(F₁、F₂、F₃和F₄)的遗传多样性和遗传结构，PIC从0.6577下降到0.5834，H_o从0.7943下降到0.7135的结果有差别。

本研究发现，3个世代亲本的遗传参数有上升的趋势(但不显著)。分析原因可能是与本研究所选取实验样品有关。本研究所用的样品并不是在选育群体中随机抽选的个体，而是用于构建G₉~G₁₁代核心家系的亲本作为样品，即这些个体是依据育种方案挑选出的性状优良个体，代表的是下一代群体的遗传多样性。选育世代亲本遗传多样性高低，是下一代遗传多样性维持的重要基础，而本研究亲本的遗传多样性没有下降，进一步说明我们的育种方案是科学的，在保证遗传进展的同时，遗传多样性不会降低。

种群的遗传分化指数(F_st)是衡量群体间遗传分化程度的重要参数，根据Wright (1978)对遗传分化指数的界定，F_st值介于0~0.05之间，表示群体遗传分化较弱。在本研究中，群体总遗传分化指数为0.0061以及世代间F_st值均小于0.05 (表 2)，说明3年选育世代遗传分化程度较弱，群体间的遗传结构差异不显著。随着选育世代的增加，相邻世代间遗传距离呈减小趋势，说明随着选育时间的推进，选育群体的遗传背景趋于一致，遗传结构趋向稳定，也体现了人工定向选择的效应。基因流强弱对种群遗传分化也具有重要影响，基因流N_m < 1，表明由于遗传漂变发生了分化；N_m > 1，表明遗传分化较小；N_m > 4，表明群体间的基因交流更充分，遗传分化更小。3个选育世代亲本的基因流值为62.91~94.63，3个选育世代间基因交流非常充分，群体间的遗传分化很小。由于中国明对虾是一年生物种，遗传变异程度低，对固定性状的人工选择并没有在整个基因组上产生明显的影响，因此遗传分化程度低。

本研究采用2b-RAD技术对连续选育的中国明对虾“黄海2号”G₉~G₁₁ 3个世代共计649个亲本进行了简化基因组测序，共获得66985个SNP用于群体遗传多样性和遗传结构变化的评估，研究表明，随着人工定向选育工作的推进，对中国明对虾选育群体遗传多样性和遗传结构产生了一定的影响，但中国明对虾选育群体遗传分化相当小，遗传结构趋向稳定，亲本的遗传多样性并无降低的趋势。研究结果为下一步制定中国明对虾选育计划提供基础数据和参考。