硬骨鱼类作为较低等的脊椎动物，其免疫系统分为非特异性免疫(Innate)和特异性免疫(Adaptive)两种(Sasimanas et al, 2015)。鱼类受外界抗原刺激后会进入应激状态，非特异免疫系统被激活以抵御病原菌感染。免疫应答过程中，产生大量的活性氧自由基(ROS)，刺激机体增加抗氧化酶的分泌，如过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等来清除过量的ROS。而免疫相关组织受损后导致ROS清除能力下降，过剩的ROS会对机体造成生物损伤及免疫力下降，继而表现出发病症状，如发炎、肿瘤等(Sifa et al, 2002)。因此，可以通过检测病原菌胁迫后鱼体内血液和相关组织的生化指标来评价鱼体的健康状态。

罗非鱼是联合国粮农组织(FAO)向全世界推广养殖的优良品种(Zhu et al, 2017)，也是中国水产养殖的重要品种(Zhu et al, 2015)。近几年，受罗非鱼养殖规模的盲目扩大和养殖环境恶化等因素的影响，中国南方地区90%的罗非鱼养殖场均不同程度暴发过无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)病，感染死亡率最高可达90%(Ye et al, 2011; Chen et al, 2012)，给养殖从业者造成了巨大的经济损失，目前，尚未找到有效根治的措施。为从种源上提高罗非鱼抵抗无乳链球菌侵染的能力，开展抗无乳链球菌病品种选育已刻不容缓，而筛选出罗非鱼抗病性能评价指标是开展抗病育种的关键。目前，对罗非鱼感染细菌性疾病后机体内血清生化指标的研究已有相关报道，如Chen等(2012)等研究了罗非鱼在海豚链球菌菌(Streptoccus iniae)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)胁迫下血清生化指标的变化，Benli等(2004)研究了尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)感染迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)后的免疫相关酶的活性变化，韦现色等(2014)检测了吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)感染无乳链球菌后尿素氮、肌酐含量以及肝胰腺溶菌酶、谷丙转氨酶和黄嘌呤氧化酶的活性变化。以上研究仅针对病原菌胁迫感染后对罗非鱼机体内免疫相关酶活性的影响，并没有开展抗病性能评价免疫酶指标筛选的报道。

本研究对抗病力较强的奥尼罗非鱼(Oreochromis aureus × O. niloticus)、较易发病的吉富罗非鱼“百桂”品系及经5个世代选育后的吉富罗非鱼抗病品系进行人工感染无乳链球菌，比较3个品系感染后的存活率、肝胰腺组织和血清中的免疫相关酶的活性变化，旨在筛选出罗非鱼抗无乳链球菌感染能力的评价指标，为罗非鱼抗病新品种选育提供参考依据。

实验材料为吉富罗非鱼抗病选育系F₅代(以下简称抗病品系)、奥尼罗非鱼(以下简称奥尼品系)和吉富罗非鱼“百桂”品系(以下简称“百桂”品系)，均来源于国家级广西南宁罗非鱼良种场。选取健康有活力、规格统一[平均重为(56.48±0.70) g]的3个罗非鱼品系各125尾，常规暂养8~10 d，水温为30℃~31℃。实验前，先用鸡血平板对3个罗非鱼品系(每个品系3尾鱼)进行接种分离，检测是否携带链球菌病原。

实验所用的菌株(无乳链球菌HN016)由本院鱼病防治研究室馈赠。菌株的复苏与培养参考朱佳杰等(2012)的方法，培养的菌液经革兰氏染色无杂菌后用PBS溶液将菌液稀释至半数致死浓度1×10⁷ CFU/ml。

人工腹腔注射方式感染无乳链球菌，每个品系注射90尾鱼(30尾鱼为1个重复，养殖容器为1 m³水桶)，每尾鱼注射0.2 ml菌液。每个品系均设对照组(30尾)，注射等量PBS溶液。感染后每隔3 h观察1次实验鱼的情况，实时记录死鱼数量，保持水质新鲜。

无乳链球菌感染后，每个实验组分别于0 h(感染实验前)、感染后24 h取3尾鱼进行尾静脉采血，分离血清，保存于–20℃；同时，采集0 h、感染后5 h和24 h的肝胰腺组织，保存于-80℃。分别测定血清和肝胰腺组织中SOD、CAT、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、总抗氧化能力(T-AOC)的活性。酶活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

使用SPSS 18.0统计软件进行统计学处理，计算所得数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示。各组间差异使用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行多重比较。

3个罗非鱼品系感染后都出现了典型的无乳链球菌病症状，其表现为鱼体失去平衡上下翻滚、打圈圈、鳃充血、眼球浑浊红肿等，解剖后发现，肝胰腺、肾、脾明显肿大出血、肠排空等症状。采用黎炯等(2010)的无乳链球菌PCR鉴定方法确诊感染了无乳链球菌病。3个品系感染无乳链球菌后的累积死亡率如图 1所示，感染后24 h开始出现死鱼，24~72 h为死亡高峰期，72 h后死亡鱼数量逐渐趋向平稳。抗病品系、“百桂”品系和奥尼品系的平均累积死亡率分别为60.5%、78.6%和55.4% (图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 3个罗非鱼品系感染无乳链菌后的平均累积死亡率 Fig.1 The mortality statistics of three tilapia strains after Streptococcus agalactiae infection 同一时间点不同小写字母表示差异显著(P < 0.05) Different lowercase letters indicate significant difference at the same time point (P < 0.05)

由图 2A可见，感染前(0 h)，3个罗非鱼品系肝胰腺组织中ACP活力的大小依次为“百桂”品系>奥尼品系>抗病品系，三者之间差异显著(P < 0.05)。感染后5 h，抗病品系和奥尼品系的ACP活力显著上升，而“百桂”品系的ACP活力显著下降(P < 0.05)。感染后24 h，抗病品系和奥尼品系的ACP活力显著下降，其中奥尼品系的ACP活力显著低于其他品系(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 2 3个罗非鱼品系感染无乳链球菌后肝胰腺组织免疫相关酶活力的变化 Fig.2 Comparison of the liver immune-related enzyme activity in three tilapia strains after Streptococcus agalactiae infection 不同大写字母表示同一品系在不同时间点有显著差异(P < 0.05)；不同小写字母表示同一时间点的不同品系有显著差异(P < 0.05)。下同 Different capital letters indicate significant differences of the same strain at different time points (P < 0.05); Different lowercase letters indicate significant differences in different strains at the same time point (P < 0.05). The same as below

由图 2B可见，感染前(0 h)，奥尼品系肝胰腺中AKP活力显著低于其他2个品系(P < 0.05)。感染后5 h，抗病品系和奥尼品系的AKP活力显著上升(P < 0.05)，而“百桂”品系与感染前相比差异不显著(P>0.05)。感染后24 h，和奥尼“百桂”品系肝胰腺组织的AKP活力均显著下降。

由图 2C可见，感染前(0 h) 3个品系肝胰腺中的CAT活力以奥尼品系的活力最高，各组间比较差异显著(P < 0.05)。感染后5 h，3个品系的CAT活力均显著下降，各组间差异显著(P < 0.05)。感染后24 h，CAT的活力逐渐上升，但仍低于感染前的水平，其中，以奥尼品系的活力最高。

由图 2D可见，感染前(0 h)，抗病品系和奥尼品系肝胰腺中SOD活力显著低于“百桂”品系(P < 0.05)。感染后5 h，抗病品系和奥尼品系的SOD活力显著上升，而“百桂”品系则显著下降(P < 0.05)，抗病品系和奥尼品系的SOD活力均高于“百桂”品系。感染后24 h，3个品系的SOD活力均低于感染前的水平，其中，抗病品系的活力最高。

由图 2E可见，感染前(0 h)，3个品系肝胰腺组织中T-AOC活力大小依次为抗病品系>“百桂”品系>奥尼品系，三者间差异显著(P < 0.05)。感染后5 h，奥尼品系中T-AOC活力显著上升，“百桂”品系中T-AOC活力显著下降(P < 0.05)。感染后24 h，抗病和奥尼品系的T-AOC活力均显著下降(P < 0.05)，其中，抗病品系的活力最高。由图 2F可见，感染前(0 h)，3个品系肝胰腺中LZM的活力大小依次为奥尼品系>抗病品系>“百桂”品系。感染后5 h，抗病选育品系的活力显著上升(P < 0.05)，奥尼品系的活力则显著下降(P < 0.005)，感染后24 h，抗病品系和奥尼品系均显著下降，其LZM活力均低于感染前的水平，而“百桂”品系在感染前后均无显著变化(P>0.05)。

3个罗非鱼品系感染无乳链球菌后血清中免疫相关酶活性的变化见图 3。在无乳链球菌感染24 h后，抗病和奥尼品系的ACP和T-AOC活性均显著上升(P < 0.05)，而“百桂”品系变化不显著(P>0.05)；AKP、CAT和LZM在3个品系感染24 h后均显著上调(P < 0.05)，其中，AKP和CAT以奥尼品系的活性最高，LZM则以抗病品系活性最高；SOD在感染24 h后活性呈下降趋势，抗病选育品系和奥尼罗非鱼下降最明显，这2个品系与“百桂”品系相比差异显著(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 3 3个罗非鱼品系感染无乳链球菌前后血液中免疫相关酶活力的变化 Fig.3 Comparison of the blood immune-related enzyme activity in three tilapia strains after Streptococcus agalactiae infection

对3个品系感染无乳链球菌前后肝胰腺组织和血清中6个免疫相关酶活性进行关联分析发现，在感染后24 h，AKP和CAT在奥尼品系的表达量显著高于抗病品系和奥尼品系(P < 0.05)，结合奥尼品系感染无乳链球菌后的存活率最高得出，可以通过检测不同罗非鱼个体或群体感染无乳链球菌后24 h AKP和CAT的表达量高低来判断个体或群体抗病力的强弱。

鱼类属于较低等的生物，在受到外界环境胁迫应激时，非特异性免疫系统作为鱼类抵抗病原的第一道屏障率先发挥作用，免疫过程会诱发鱼体免疫器官释放大量的活性氧自由基(ROS)到血液中，经血液循环后到达各个组织，过量的ROS会对机体各个组织器官的机能造成损伤(Ardó et al, 2010)，从而表现出症状。无乳链球菌属于革兰氏阳性菌，是目前中国罗非鱼养殖的首要致病菌(黎源等, 2017)，感染后的罗非鱼体内典型的病变就是肝胰腺组织肿大坏死，而肝胰腺是罗非鱼机体物质代谢的中枢器官和解毒器官(Chen et al, 2011; 强俊等, 2012)。血液的生理生化是评估鱼体的健康状态的一个重要参数，可作为实时反映鱼类的生理状态变化和机体抵御抗原的有力指标(Chen et al, 2013; Clauss et al, 2008)。因此，研究罗非鱼感染无乳链球菌后肝胰腺组织及血液中免疫相关酶活性的变化，对研制防治药物及筛选抗病评价指标均具有重要意义。

ACP和AKP广泛分布于动物体内，是2种参与磷酸基团转移和代谢的调控酶。ACP是巨噬细胞溶菌酶的特征性酶，直接参与吞噬作用，能协助杀死及吞噬病原体，还能形成水解酶体系消除异物，主要存在于鱼类的肝胰腺、脾脏和血液中(Grinde et al, 1998)。AKP是机体解毒系统中的重要组成之一，在碱性环境下能水解磷酸单酯起到解毒的作用，发挥免疫防御功能(刘石林等, 2016)。高温胁迫刺参(Apostichopus japonicus)(刘石林等, 2016)和亚硝酸盐胁迫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)(叶俊等, 2016)均显著影响到ACP和AKP酶活力的变化。冯宁宁等(2014)研究发现，ACP和AKP可作为评价脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)抗WSSV能力的指标。本研究发现，在感染前抗病品系和奥尼品系肝胰腺组织的ACP和AKP酶活力均低于“百桂”品系，而感染后抗病和奥尼品系均呈先上升后下降的趋势，这可能是感染后体内病原菌的增殖使得肝胰腺组织通过去磷酸化应激反应来适应病原菌的侵染有关，而“百桂”品系由于抵抗感染能力较弱，则处于下降趋势。此外，3个品系感染后24 h的血清中AKP活力均呈现上升趋势，这是由于肝胰腺及其他免疫器官组织因病原菌入侵释放了大量的活性氧自由基(ROS)，这些ROS通过新陈代谢进入血液循环系统中，从而导致血清中的AKP酶活力在处于上升状态，其中，奥尼罗非鱼感染后，肝胰腺和血清中的AKP酶活性均显著高于其他2个品系。由此暗示，通过检测无乳链球菌感染后AKP酶活性高低，可作为评估罗非鱼抗感染能力强弱的一个指标。

SOD是机体抗氧化的关键酶之一(罗胜玉等, 2017)，在清除机体活性氧自由基、辅助吞噬细胞增强杀菌功能及提高机体的免疫功能等方面起着重要作用，可作为反映机体自由基代谢和氧化损伤的重要依据，为判断鱼体的健康水平及免疫能力提供参考(徐增辉等, 2008; Zenteno-Savin et al, 2006)。唐保军等(2017)研究发现，高盐度胁迫黄边糙鸟蛤(Trachycardium flavum)后，SOD活性呈先升高后下降的趋势。本研究发现，感染后5 h，抗病品系和奥尼品系肝胰腺的SOD活力显著上升，这说明由于病原菌的侵入引起的免疫应答和炎症反应很可能引起鱼体内ROS积聚，从而引发肝胰腺组织合成SOD酶的能力增强，减轻ROS对机体损伤。而感染后24 h，肝胰腺组织和血清中SOD活力均明显下降，说明病原菌已引发相关组织损伤，导致机体新陈代谢和能量代谢合成各种酶的能力下降。

CAT作为机体重要的抗氧化功能酶，能够催化过氧化氢分解，补偿机体清除自由基的能力。T-AOC能反映机体抗自由基的能力(Elvitigala et al, 2013)。赵静等(2015)研究发现，齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)后，血清中的CAT和T-AOC呈现短暂上升后再下降的趋势。本研究发现，3个罗非鱼品系感染后，血清中CAT和T-AOC活性明显升高，表明病原菌胁迫鱼后激活了机体的抗氧化系统，通过提高相关酶的活性来清除机体产生的ROS，其中，奥尼品系的活性显著高于其他2个品系。而感染后在肝胰腺组织和血清中CAT的活性以奥尼品系最高，“百桂”品系最低。综合比较CAT在3个品系的肝胰腺和血清中的变化，再结合它们的感染存活率，可将CAT作为评价罗非鱼抗无乳链球菌感染能力强弱的一个生化指标。

LZM作为鱼类的非特异性免疫物质之一，主要在肝胰腺内合成通过裂解外源性病原菌的细胞壁、糖苷键或酰基葡萄糖键来达到清除病原菌的目的，尤其对革兰氏阳性菌有良好的杀菌作用，本研究所用无乳链球菌属于革兰氏阳性菌(Fujimoto et al, 2001)。本研究发现，抗病品系的肝胰腺组织在感染无乳链球菌后5~24 h，肝胰腺体组织的LZM活力呈先升高后降低的趋势，这与溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) (谢建军等, 2011)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染中国明对虾(Penaeus monodon)(Yin et al, 2014)的结果相近，说明无乳链球菌进入罗非鱼体内后，机体提高了肝胰腺LZM的合成量并释放到血清中。而LZM活力的提高，可增强LZM清除无乳链球菌的能力，提高机体的免疫抵抗力。而“百桂”品系的LZM活力在感染前后变化不明显，这可能是该品系对无乳链球菌刺激在LZM的分泌上反应不敏感，导致LZM活力的变化不大。

本研究分析了3个罗非鱼品系感染无乳链球菌后肝胰腺组织和血清中SOD、CAT、ACP、AKP、LZM和T-AOC酶活性的变化，结合3个品系感染后的存活率进行关联分析，筛选出AKP和CAT可作为评价罗非鱼抗无乳链球菌病能力的生化指标。研究结果可为罗非鱼抗无乳链球菌新品种选育提供参考依据。