热休克蛋白热休克蛋白(Heat shock proteins, Hsps)是目前研究最为广泛的应激蛋白之一，可在各种环境胁迫下诱导大量表达；在正常环境条件下，细胞内也存在丰富的Hsps；根据分子量大小，Hsps可以分为Hsp110s、Hsp90s、Hsp70s、Hsp60s和小分子量Hsps等多个家族(Lindquist et al, 1988)。其中，Hsp90是一类进化上高度保守的重要细胞内伴侣蛋白，在正常情况约占细胞溶质蛋白总量的1%~2%(Lai et al, 1984)，具有辅助蛋白质正确折叠、胞内物质运输、细胞增殖调控等重要功能(McClellan et al, 2007)。此外，Hsp90在配子发生中也具有重要功能。例如，非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞的Hsp90可通过磷酸化稳定c-Mos蛋白，并依赖丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)途径影响成熟促进因子(Maturation-promoting Factor, MPF)的合成(朱建安, 2007)。在刀额新对虾(Metapenaeus ensis)卵母细胞中，Hsp90与雌激素受体(Estrogen receptor, ER)共同作用，激活或增强卵黄蛋白原(Vitellogenin, Vg)等靶基因的转录(Wu et al, 2008)。

光裸星虫(Sipunculus nudus)又名裸体方格星虫，俗称沙虫，主要栖息于暖水性海滨潮间带，在我国华南沿海资源量较为丰富(李凤鲁等, 1990; Li et al, 2017)，其味道鲜美，含有大量谷氨酸、天冬氨酸等呈味氨基酸，具有很高的市场价值(罗少杰等, 2016)。近年来，光裸星虫逐渐成为广东湛江、广西北海等北部湾沿岸地区养殖新热点，但苗种短缺制约了产业发展。目前，关于光裸星虫繁殖生物学研究主要在形态学方面，尚未开展分子机制研究。如，王庆恒等(2017)报道了光裸星虫卵子发生的超微结构，建立了卵母细胞粒径、超微结构和发育阶段的对应关系；张家炜等(2018a)观察了光裸星虫胚胎和幼体发育的超微结构。光裸星虫体腔液中有大量生殖细胞游离发育，但直接解剖获取的卵母细胞不具备受精能力。解析卵母细胞成熟机制，有助于建立卵母细胞体外促熟技术，从而提高光裸星虫苗种产量，促进产业发展。作者所在课题组已构建了不同发育阶段卵子的转录组文库，分析表明，Hsp90在卵母细胞中表达量较高，可能在卵母细胞发育过程中起着重要作用(未发表)。

本研究通过RACE技术获得SnHsp90的cDNA全长，并对其序列结构、不同组织及不同卵子发育时期的表达模式进行分析，以探究SnHsp90在光裸星虫卵母细胞发育中的作用，为认识光裸星虫卵母细胞发育的分子机制积累基础资料。

实验所用光裸星虫于2018年6月采集自广东省湛江市草潭镇潮间带，取钻沙有力、体壁无伤的雌性虫体用于实验，体重为(12.92±1.68) g。

灭菌海水清洗虫体表面砂砾后，用2 ml注射器抽取少量体腔液，镜检分辨雌雄。取30尾雌虫，每尾抽取2 ml体腔液，分别置于5 ml离心管中冰浴静置5 min，卵母细胞沉降到管底，上层悬浮液中则含有各类血细胞、卵原细胞等。弃悬浮液，在沉淀中加入RNA Later吹打混匀，冰浴静置5 min，弃上清液，再次加入RNA Later吹打混匀。将获得的卵母细胞悬浮液全部置于50 ml烧杯中混合，逐次使用100、150和300目的细胞筛进行分级分离，结合王庆恒等(2017)工作，获得的各级卵母细胞的直径及发育时期分别为：Egg1 (< 48 μm，卵黄形成初期)、Egg2 (48~108 μm，卵黄旺盛合成前期)、Egg3 (108~150 μm，卵黄旺盛合成后期)和Egg4 (> 150 μm，成熟期)(图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 光裸星虫不同时期卵母细胞形态 Fig.1 Oocytes of S. nudus at different developmental stages A：卵黄形成初期(Egg1)；B：卵黄旺盛合成前期(Egg2)；C：卵黄旺盛合成后期(Egg3)；D：成熟期(Egg4)；E：肾管发育时期(Egg5)；F：外排卵母细胞(Egg6)。图 8同 A: Oocyte in beginning of yolk synthesis; B: Oocyte in early stage of vigorous yolk synthesis; C: Oocyte in late stage of vigorous yolk synthesis; D: Oocyte in mature stage; E: Oocytes in the nephridioduct; F: Excretive oocyte. The same as Fig. 8

解剖雌虫，如果肾管充盈，即用过滤海水清洗肾管表面，将肾管游离端轻轻放入2 ml离心管中，用解剖针刺破肾管收集卵母细胞，加入RNA Later吹打混匀。本研究共获得30尾雌虫肾管中的卵母细胞，混合后作为样品Egg5 (肾管发育时期)。另取30尾雌虫，阴干刺激后放入过滤海水中促使排卵，用100目筛绢网捞取水体中的外排卵母细胞，加入RNA Later吹打混匀作为样品Egg6 (外排卵母细胞)。

解剖取9尾雌虫取体壁(M)、肠道(I)、收吻肌(Rm)、肾管(Ne)组织以及体腔液细胞(Co)，液氮速冻，并转移至–80℃冰箱保存，用于RNA提取。

总RNA提取及第一链cDNA合成参照赖卓欣等(2019)的方法进行。根据本课题组前期光裸星虫转录组数据中Hsp90的部分序列，利用Primer premier 6.0软件设计引物(表 1)。

表 1(Tab.1)

表 1 SnHsp90基因克隆及荧光定量的引物序列 Tab.1 Primer sequence used in the cloning and real-time PCR of SnHsp90 gene 引物Primers 序列Sequence (5′~3′) 用途Usage 5′-outer CTCCTTCTGCTCCTCCTCATC 5′RACE 5′-inner GCTCTTCTGTTGCTGATAATGC 5′RACE 3′-outer ACTCTCCGCTCTGGCTACT 3′RACE 3′-inner GGAAGAGGAGGCTGGAGATG 3′RACE M13-F CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 菌落PCR Colony PCR M13-R AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 菌落PCR Colony PCR qPCR-S CTCTGATGACCTGCCACTGAA 荧光定量Fluorescent quantitation qPCR-A TGTGCTCCTGCTTCTCCTTC 荧光定量Fluorescent quantitation 60S-S GACGAGACCAAGGCTACCAT 荧光定量(内参) Fluorescent quantitation (internal reference) 60S-A TCAACAGAGACACGAGGAAGT 荧光定量(内参) Fluorescent quantitation (internal reference)

表 1 SnHsp90基因克隆及荧光定量的引物序列 Tab.1 Primer sequence used in the cloning and real-time PCR of SnHsp90 gene

采用巢式PCR扩增SnHsp90 3´UTR和5´UTR，PCR产物利用1%琼脂糖电泳检测，产物与载体pMD18-T连接，连接产物转化至DH5α感受态细胞，并在固体氨苄选择培养基上培养12 h。挑取阳性单克隆菌落进行PCR检测，合格后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

利用DNAman 8对测序结果进行拼接，获得SnHsp90全长。采用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)预测SnHsp90的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)以及蛋白质氨基酸序列。利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)进行理化性质及二级结构预测。ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc)进行蛋白亚细胞定位。NCBI Blast在线分析工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列同源性、一致性性分析。Phyer2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index)预测蛋白三级结构。smart进行保守结构域预测(http://smart.embl-heidelberg.de/)。MEME (http://meme-suite.org/index.html)进行motif挖掘。使用Mega X构建生物系统进化树。

分别以TBP(张家炜等, 2018b)和60s-L7(筛选过程未发表)基因作为内参基因，检测SnHsp90在成体不同组织及在不同发育时期卵母细胞的表达水平。反应体系：上下游引物各0.4 μl，SYBR^® Select Master Mix 5 μl，cDNA模板0.4 μl，灭菌水3.8 μl。反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火延伸1 min，共40个循环。采用2^–ΔΔCt法计算SnHsp90的相对表达量。通过IBM SPSS Statistics 22进行显著性分析(置信水平取95%)。

本研究利用RACE技术克隆获得光裸星虫SnHsp90基因cDNA序列，全长3110 bp，其中，5′ UTR为72 bp；3′ UTR为582 bp，开放式阅读框(ORF)长度为2456 bp，编码818个氨基酸。SnHsp90同时具有B型Hsp90(Hsp90B)的3个特征序列(FLREL、IGQFGVGFYS、LPLNVSRE)以及保守模块“GxxGxG” (图 2)。

图 1(Fig. 1)

图 2 SnHsp90 cDNA序列全长及推导的氨基酸序列 Fig.2 The full length and deduced amino acid sequence of SnHsp90 cDNA 黄色背景为Hsp90B蛋白家族的特征序列；GxxGxG以红色字体突出；5′和3′ UTR用小写字母表示；编码区以及推导的氨基酸序列用大写字母表示；信号肽以灰色阴影突出；HATPase_c结构域以黑框框出；Hsp90结构域以蓝色字体突出 The yellow background is the characteristic sequence of the Hsp90B protein family; the GxxGxG motif is highlighted in red; 5' UTR and 3' UTR are indicated with small letters; open reading fragment and the deduced amino acid sequences are indicated with capital letters; the signal peptide is highlighted by a gray shadow; the HATPase_c domain is outlined in black box; the Hsp90 domain is highlighted in blue

利用ProtParam预测得到SnHsp90的理论分子量为93.839 kDa，等电点为4.75，负电荷残基178个，正电荷残基114个。结果显示，其脂溶指数(Aliphatic index)为77.98，总平均亲水性(Grand average of hydropathy, GRAVY)为–0.752，属于亲水性蛋白。使用SOPMA软件对SnHsp90二级结构进行预测，发现螺旋、转角和延伸链分别占整体的55.87%、4.28%和12.59%。细胞亚定位预测结果显示，SnHsp90定位于内质网上。结构域分析显示，不同物种的Hsp90都含有信号肽、组氨酸激酶结构域(HATPase-c Domain)和热休克蛋白结构域(Hsp90 Domain)(图 3)，可见Hsp90蛋白在结构域上具有高度保守性。

图 1(Fig. 1)

图 3 不同物种Hsp90蛋白的结构域 Fig.3 The domains of of Hsp90 proteins of different species 红色部分为信号肽；绿色三角HATPase_c结构域；黑色矩形为Hsp90结构域；各物种hsp90基因序列登录号：虾夷扇贝OWF41993.1;猫头鹰帽贝XP_009065664.1;鸭嘴海豆芽XP_023932276.1;太平洋牡蛎BAF63637.1;小头虫ELU00023.1;福寿螺XP_025107756.1 Red section is signal peptide; green triangle is HATPase_c domain; black rectangle is Hsp90 domain; The hsp90 GenBank accession numbers of each species are following: Mizuhopecten yessoensis, OWF41993.1; Lottia gigantean, XP_009065664.1; Lingula anatine, XP_023932276.1; Crassostrea gigas, BAF63637.1; Capitella teleta, ELU00023.1; Pomacea canaliculated, XP_025107756.1

对来源于鸭嘴海豆芽(Lingula anatine, XP_ 023932276.1)、小头虫(Capitella teleta, ELU00023.1)、福寿螺(Pomacea canaliculated, XP_025107756.1)、太平洋牡蛎(Crassostrea gigas, BAF63637.1)、水蛭(Helobdella robusta, XP_009019107.1)、猫头鹰帽贝(Lottia gigantean, XP_009065664.1)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis, OWF41993.1)、白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri, XP_019627224.1)、棘冠海星(Acanthaster planci, XP_022100344.1)、斑马拟丽鱼(Maylandia zebra, XP_004567801.1)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus, XP_003443932.1)、杂色鳉(Cyprinodon variegatus, XP_015232211.1)、隆头蛛(Stegodyphus mimosarum, KFM57735.1)、银大马哈鱼(Oncorhynchus kisutch, XP_020311813.1)、大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris, XP_020790709.1)的Hsp90蛋白与光裸星虫Hsp90序列进行motif分析，结果表明，各物种Hsp90蛋白序列保守性较高(图 4)。其中，光裸星虫Hsp90与鸭嘴海豆芽的相似性最高，为77.72%；与大弹涂鱼的相似性最低，为69.18%。对不同物种的Hsp90蛋白序列进行Motif分析，发现这些物种均具有Motif (1~10)，且相对位置一致，进一步表明Hsp90蛋白在序列上的保守性。

图 1(Fig. 1)

图 4 Hsp90氨基酸序列Motif分析 Fig.4 Motif analysis of amino acid sequence of Hsp90

对来自小头虫、鸭嘴海豆芽、水蛭的Hsp90和SnHsp90进行三级结构预测，结果发现，光裸星虫与鸭嘴海豆芽、小头虫、水蛭Hsp90在三级结果上相似性很高(图 5)，说明Hsp90蛋白的三级结构非常保守。

图 1(Fig. 1)

图 5 光裸星虫(A)、鸭嘴海豆芽(B)、小头虫(C)和水蛭(D)Hsp90蛋白分子结构 Fig.5 The spatial structure of Hsp90 protein molecules of S. nudus (A), L. anatina (B), C. teleta(C) and H. robusta (D)

利用最大似然法(Maximum likelihood)，选择光裸星虫、太平洋牡蛎、福寿螺、猫头鹰帽贝、虾夷扇贝、鸭嘴海豆芽、小头虫、水蛭、白氏文昌鱼、杂色鳉、尼罗罗非鱼、斑马拟丽鱼、大弹涂鱼以及银大马哈鱼的Hsp90蛋白序列构建系统进化发育树。结果显示，Hsp90系统发育树可分为无脊椎动物和脊椎动物两大支，在无脊椎动物中，光裸星虫Hsp90与水蛭、小头虫等环节动物聚为一支，再与鸭嘴海豆芽、太平洋牡蛎、虾夷扇贝等软体动物聚为一支(图 6)。系统发育树聚类结果与传统分类学结果一致。

图 1(Fig. 1)

图 6 Hsp90蛋白质聚类分析 Fig.6 Protein cluster analysis of Hsp90

利用qRT-PCR对SnHsp90进行不同组织的表达模式分析，结果显示，SnHsp90在光裸星虫的各个组织中均有表达，且收吻肌中表达量最高，差异显著(P < 0.05) (图 7)。

图 1(Fig. 1)

图 7 光裸星虫SnHsp90在不同组织中的相对表达量 Fig.7 Relative expression of SnHsp90 in different tissues M：体壁；I：肠；Rm：收吻肌；Ne：肾管；Co：体腔液细胞。不同字母代表差异性显著(P < 0.05), 下同 M: Body wall; I: Intestine; Rm: Rhynchonellida muscle; Ne: Nephridioduct; Co: Coelomic cell. Different letters mean significant difference (P < 0.05). The same as below

如图 8所示，SnHsp90在不同发育时期卵母细胞中均有表达。其中，在Egg6的表达量显著高于其他时期(P < 0.05)，Egg2表达量显著高于Egg1和Egg3~5 (P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 8 SnHsp90在不同时期卵母细胞中的相对表达量 Fig.8 Relative expression of SnHsp90 in oocytes at different periods

生殖细胞发生是水产动物繁殖生物学研究的重要内容。近年来，通过构建不同发育时期性腺的转录组文库，已发掘了大量与水产动物繁殖相关的关键基因。例如，袁静(2013)比较分析了5~180日龄尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)性腺转录组，发现雌雄性腺特异表达的基因分别为69个和259个。林睿涓(2017)利用七彩神仙鱼(Symphysodon haraldi)性腺转录组文库，筛选出12个与性别决定、性腺发育和性激素调控相关的重要功能基因。本课题组前期构建了光裸星虫卵母细胞的转录组文库，分析发现Hsp90在各时期卵母细胞均具有较高的表达水平(未发表)，暗示着其在卵母细胞或胚胎发育中承担着重要作用。本研究通过分析SnHsp90的序列特征及表达模式，探索其在卵母细胞发育中可能具有的功能。

Hsp90家族可分为Hsp90A、Hsp90B、TNF受体相关因子(TNF receptor associated factors, TRAP)、Hsp90C、高温蛋白G (High-temperature protein G, HTPG) 5个亚家族，其中，Hsp90B定位于真核生物内质网中，含有信号肽结构，序列上同时存在“FLREL”、“IGQFGVGFYS”及“LPLNVSRE” 3个标签序列(Chen et al, 2006)。本研究利用RACE方法克隆获得SnHsp90 cDNA全长序列，显示SnHsp90具有信号肽结构，且存在Hsp90B亚家族的上述3个特征序列标签，可见本研究克隆所得的SnHsp90属于Hsp90B亚家族。一般来说，Hsp90B亚家族的C末端具有内质网定位序列“KDEL”。然而，有研究指出，该序列在Hsp90B中并不保守，其K位点和D位点会发生一定的变化(Gupta, 1995; Chen et al, 2006)。这与本研究发现的SnHsp90氨基酸序列C末端序列为“HTEL”的结果一致。

对软体动物、棘皮动物、脊椎动物等16个物种进行motif搜索，发现不同物种间搜索出来的motif类型、数目以及排列顺序上均一致；光裸星虫、鸭嘴海豆芽、小头虫和水蛭同源Hsp90在三维结构上高度相似。以上结果均说明了Hsp90在二级和三级序列上均具有较高的保守性。

Hsp90B也称为葡萄糖调节的蛋白(Glucose regulated protein 94 kDa, Grp94) (Gupta, 1995; Chen et al, 2006)，作为分子伴侣时，有助于蛋白质的正确折叠以及防止错误折叠蛋白的积累(Young et al, 2001; Mamipour et al, 2017; Krüger et al, 2019)；参与免疫球蛋白、Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)和某些整联蛋白(Integrin)的折叠、组装和转运等过程(Melnick et al, 1992; Yang et al, 2007)。本研究中，SnHsp90在收吻肌、体壁、肠等组织中均有表达，提示该基因广泛参与了各组织的生理活动。在收吻肌的参与下，光裸星虫的吻可快速伸缩进行摄食和钻穴。在频繁的强力伸缩过程中，收吻肌的细胞可能发生损伤，SnHsp90在收吻肌中的表达量显著高于其他组织，推测与细胞的损伤修复有关。

卵母细胞发育过程中，核糖体、内质网、高尔基体等细胞器大量增殖，积累大量酶、蛋白质、mRNA等物质。本研究显示，SnHsp90在光裸星虫各时期卵母细胞中均有较高表达，有利于快速合成蛋白的正确折叠，与卵母细胞旺盛的转录和翻译活动相一致。有研究显示，Hsp90可与Greatwall激酶结合，影响生殖细胞的细胞周期进程(Yamamoto et al, 2014)。在刀额新对虾中，Hsp90与雌激素受体结合，介导雌激素信号转导过程，开启靶基因如卵黄蛋白原的转录(Wu et al, 2008)。光裸星虫卵母细胞Egg2处于卵黄旺盛合成前期，卵黄快速积累(王庆恒等, 2017)，本研究显示，光裸星虫SnHsp90在该时期显著高表达(P < 0.05)，暗示SnHsp90的表达可能与卵黄合成之间存在相关性，与刀额新对虾的研究结果相似。

Hsp90在水生生物应激和抗逆过程中具有重要作用。例如，Hsp90B在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)耐盐群体的细胞中表达上调，可能在盐度耐受方面起作用(Sithtisarn et al, 2017)；三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)具有2个Hsp90基因，对胁迫条件可产生不同的响应，例如，热处理导致Hsp90-1的表达量显著上调，而Hsp90-2则显著下调(Zhang et al, 2009)；氨氮胁迫下，中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃、肝胰腺、肌肉和血细胞的Hsp90表达量均在短时间内明显上调，有利于防止分子氨对组织细胞的损伤(王芸等, 2013)。本研究中，Egg6是经肾管排放到水体中的卵母细胞，需要应对体内外渗透压、pH、离子浓度等环境因子的重大改变，SnHsp90在Egg6时期表达量最高，暗示SnHsp90的高表达可能与卵母细胞应对环境变化密切相关。