鳗弧菌(Vibrio anguillarum)广泛存在于大洋、河口等环境，也是多种海洋生物的正常菌群之一，一些致病性菌株可感染多种鱼类，引起出血性败血症(Austin et al, 2007; 丁山等, 2018)。鳗弧菌致病包括粘附、侵袭、体内增殖、产生毒素等一系列过程，而这些过程又与细菌产生的各种致病因子有关(Frans et al, 2011)。已知的致病因子包括外膜蛋白、鞭毛、蛋白酶、脂多糖和溶血素等(Norqvist et al, 1990; Austin et al, 1995; Hirono et al, 1996; Milton et al, 1996)。鞭毛参与鳗弧菌的运动，当细菌失去运动能力或运动能力下降时，其感染宿主细胞的能力明显减弱(Ormonde et al, 2000)。很多胞外蛋白酶是病原菌的主要致病因子，它们可以水解组织细胞，增强其通透性，产生细胞毒性，最终造成组织损伤等(Naka et al, 2011)。鳗弧菌的金属蛋白酶基因prtV发生突变时，其对宿主红细胞的溶血活性下降、毒力减弱(Mo et al, 2010)。Stewart等(2001)研究表明，几乎所有的细菌都可以形成菌膜，为细菌提供物理和化学屏障，营造一种相对稳定的状态。菌膜使鳗弧菌能够对消毒剂、抗生素等不利环境具有一定的耐受力，使其保持持续感染和耐药性(Hall-Stoodley et al, 2004; Lindell et al, 2012)。一些基因参与调控鳗弧菌菌膜和毒力的形成，如luxR能够抑制胞外蛋白的产生、调控菌膜的形成，进而参与细菌毒力和耐药性的调控(Croxatto et al, 2002)。可见，鳗弧菌在运动、胞外蛋白酶产生、菌膜形成等表型方面的变化与细菌的致病性相关。

转座子mini-Tn10是一种微型转座子，已被广泛应用于多种细菌基因的功能研究，如用于鉴定炭疽杆菌(Anthrax bacillus)未知的调控因子及代谢途径研究(Wilson et al, 2007)，用于鉴定影响苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)细菌素产生的基因(Kamoun et al, 2009)。为找到影响鳗弧菌表型变化的基因，本研究使用转座子mini-Tn10 (pLOF/Kana)构建鳗弧菌M3突变菌株文库，筛选影响表型变化的菌株及相关基因，为进一步研究鳗弧菌的致病机理提供基础。

鳗弧菌M3(Amp^R)由本实验室保存，用胰大豆蛋白胨培养基(TSA和TSB)培养，培养条件为28℃，静置或150 r/min摇床培养。

大肠杆菌(Escherich coli) CC118 (pLOF/Kana, Kana^R, Amp^R)和大肠杆菌SM10(Kana^R)由集美大学鄢庆枇教授惠赠，用含卡那霉素(Kana) 100 μg/ml的LB液体培养基培养，培养条件为37℃、静置或150 r/min摇床培养。

斑马鱼(Barchydanio rerio var)，体长为3~4 cm，购于青岛市南山花鸟虫鱼市场。实验前暂养于15 L水族箱中1周，正常换水、喂食，养殖水温为22℃。

TCBS固体培养基(含Kana 600 μg/ml)用于筛选带有Kana抗性的鳗弧菌突变子。

突变文库的构建参照Herrero等(1990)方法并适当改进。供体菌E.coli SM10 (pLOF/ Kana)在LB [氨苄青霉素(Amp)，50 μg/ml；Kana，100 μg/ml]培养基中37℃震荡培养过夜，受体菌(鳗弧菌) M3在TSB培养基中28℃震荡培养过夜。分别离心，收集供体菌和受体菌，用新鲜培养基洗涤，并重悬菌体，供体菌与受体菌按1:4的比例混合均匀，用0.22 μm的微孔滤膜过滤混合菌液，取出滤膜置于TSA平板上，28℃培养4 h后，用1 ml TSB培养基洗脱滤膜上的细菌，取50 μl涂布TCBS+Kana平板，28℃培养24 h。从TCBS+Kana平板上挑取单菌落，–80℃保存于96孔板中。

对鳗弧菌转座子突变文库进行泳动、酪蛋白酶活性、明胶酶活性、菌膜形成能力等表型检测。具体方法：将鳗弧菌M3及其突变文库菌株在TSB过夜培养，调节菌液为OD_{540 nm}=0.5，取2 μl菌液分别点种于含0.35%琼脂、含1%酪蛋白、含1%明胶的TSA平板上，每组设3个重复。28℃静置培养24 h后，分别测量平板上细菌的泳动圈直径(Schaber et al, 2004)、酪蛋白酶产生直径(Wilhelm et al, 2007)、明胶酶产生直径(Zhou et al, 2013)。

应用结晶紫染色法检测突变菌株菌膜形成能力(Lazarevic et al, 2005)。取OD_{540 nm}为0.5的菌液150 μl加入96孔板中，以TSB作为空白对照。在28℃静置培养24 h，用磷酸盐缓冲液(PBS, 浓度0.2 mol/L, pH 7.0)洗涤5次后，用包音氏固定液(Bouin’s stationary liquid)固定，37℃下静置培养1 h，用PBS缓冲液清洗除去残留物，置于37℃恒温培养箱完全干燥后，加入结晶紫染色、蒸馏水清洗，加入乙醇溶解吸附结晶紫，然后，测定其在OD_{595 nm}的吸光度。

根据Lee等(2008)的方法确定转座子插入突变子的数量，具体步骤：鳗弧菌M3 rpoB基因为单拷贝基因，选取其作为内参基因，neoR基因为转座子特有，选取其为目的基因，根据引物rpoB-for/rev、neo-for/rev(表 1)扩增rpoB和neoR片段。连接rpoB片段和neoR片段，构建重组载体质粒，根据该质粒计算DNA拷贝数，并以该重组质粒为模板，rpoB- SYBR-for/rev、neoR-SYBR-for/rev为引物，制作标准曲线，得到扩增效率E值(E_rpoB和E_neoR)，再以突变子DNA为模板，进行相对定量PCR，得到ΔC_trpoB和ΔC_tneoR，由公式计算转座子插入个数。

表 1(Tab.1)

表 1 本实验所用引物 Tab.1 Primers used in this study 引物名称Primer name 引物序列Primer sequence (5′~3′) M3-1 TGGGACACTCGGGATAGTGG M3-1-1 TGGGACACTCGGGATAGTGNNNNNGGAA neoR-rev0a GGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCA neoR-rev1a ACGATGGACTCCAGTCCGGCCGCCATTACGCTCGTCATCAA neoR-rev-b1 ACCGTTATTCGTGATTGC rpoB-for GCGTAGGTCTTGTGCGTGTTG rpoB-rev GGATAAGCGAAGCGGCGATTG rpoB-SYBR -for CGTGTTGTTGATGGTGTGGTGACTGA rpoB-SYBR -rev GGATAAGCGAAGCGGCGATTGATACG neoR-for GGCAATCAGGTGCGACAATCTAT neoR-rev CCGACTCGTCCAACATCAATACAA neoR-SYBR-for ATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGG neoR-SYBR-rev GGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAAC

表 1 本实验所用引物 Tab.1 Primers used in this study

式中，ΔC_tneoR为扩增neoR基因时，突变子株DNA为模板的C_t与重组质粒为模板的C_t差值。ΔC_trpoB为扩增rpoB基因时，突变子株DNA为模板的C_t与重组质粒为模板的C_t差值。

根据Xie等(2011)的方法适当改进，确定转座子插入基因，具体步骤：根据转座子mini-Tn10中neoR基因序列进行特异性引物设计，具体引物序列见表 1。对筛选出的8株菌株进行基因步移(Genome walking)扩增。以8株突变子菌株基因组DNA为模板，使用外引物neo-Rrev-0a和M3-1-1进行第1轮PCR；取适量的第1轮PCR产物反应液稀释50倍后，使用内引物neoR-rev-1a和M3-1进行第2轮PCR；取适量的第2轮PCR产物反应液稀释50倍后，使用内引物neoR-rev-b1和M3-1进行第3轮PCR反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认目的条带后，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段、连接至载体，送上海派森诺生物技术有限公司测序，测序结果与已公布的M3基因组信息在NCBI上进行比对。

利用斑马鱼作为实验动物，检测突变子的毒力变化，根据杨茂成(1990)的方法，鳗弧菌野生型M3及8株突变菌株作为感染组，无菌生理盐水作为对照组，设置细菌浓度梯度为10⁸、10⁷、10⁶和10⁵ CFU/ml，TSA平板检测活菌数。每个梯度10尾鱼，每尾鱼注射10 μl菌液，进行肌肉注射攻毒，记录感染后斑马鱼的死亡情况，采用改进的寇氏法计算细菌对斑马鱼的半数致死量(Lethal dose 50%, LD₅₀)。

细菌的泳动圈直径、酪蛋白酶产生直径、明胶酶产生直径和成膜能力的吸光度采用平均值±标准差(Mean±SD)表示，并使用SPSS软件对这些数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。

利用mini Tn10转座子构建鳗弧菌M3的突变文库，得到1152株突变子。对突变子进行泳动、酪蛋白酶活性、明胶酶活性、菌膜形成能力的检测，发现与野生型M3相比，突变子株6G_1的泳动能力明显增强(P < 0.05)(图 1)，5A_11、7B_12、7E_12的酪蛋白酶活性显著减弱(P < 0.05)(图 2)，7H_1的明胶酶活性显著减弱(P < 0.05)(图 3)，5E_2、6A_2、6E_12的菌膜形成能力显著减弱(P < 0.05)(图 4)。

图 1(Fig. 1)

图 1 鳗弧菌M3转座子文库突变子泳动能力检测 Fig.1 Detection of swimming ability of V. anguillarum M3 transposon library 不同字母表示组间差异显著(P < 0.05)，下同 Data with different letters are significantly different among different groups (P < 0.05), the same as below

图 1(Fig. 1)

图 2 鳗弧菌M3转座子文库突变子酪蛋白酶活性检测 Fig.2 Detection of casein activity of V. anguillarum M3 transposon library

图 1(Fig. 1)

图 3 鳗弧菌M3转座子文库突变子明胶酶酶活性检测 Fig.3 Detection of luciferase activity of V. anguillarum M3 transposon library

图 1(Fig. 1)

图 4 鳗弧菌M3转座子文库突变子菌膜形成能力检测 Fig.4 Detection of membrane formation ability of V. anguillarum M3 transposon library

选取筛选的8株菌，利用实时PCR相对定量标准曲线法和ΔC_t法确定了转座子插入个数(表 2)。通过基因步移扩增法获得转座子插入位点，将得到的序列与M3全基因组序列进行比对，得到插入基因在M3基因组上的位置信息和编码蛋白信息(图 5，表 3)。leuD、rseB、thiQ、ilvH、grpB位于M3染色体Ⅰ上，1个磷酸二酯酶相关基因和potD位于染色体Ⅱ上。其中，磷酸二酯酶相关基因影响M3的运动能力，leuD、rseB、thiQ影响M3酪蛋白酶产生，potD影响M3明胶蛋白酶产生，leuO、ilvH和grpB影响M3的菌膜形成能力。

表 2(Tab.2)

表 2 目的基因neoR和内参基因rpoB的扩增效率及ΔCt值 菌株Strain 扩增效率ErpoB 扩增效率EneoR ΔCtrpoB ΔCtneoR 转座子插入个数Inserts number 5E_2 97% 93% 8.53 8.37 1 5A_11 14.60 15.63 1 6A_2 7.85 8.06 1 6E_12 9.23 8.10 2 6G_1 9.19 9.59 1 7B_12 10.41 10.51 1 7E_12 7.80 7.48 1 7H_1 9.22 8.94 1

表 2 目的基因neoR和内参基因rpoB的扩增效率及ΔCt值

图 1(Fig. 1)

图 5 转座子插入位点及基因 Fig.5 Transposon insertion sites and genes

表 3(Tab.3)

表 3 转座子插入位点信息 Tab.3 Information of transposon insertion site 菌株 Strain 表型 Phenotype 基因 Gene 基因产物 Gene product 预测功能 Predict function 5A_11 酪蛋白酶活性降低 leuD 异丙基苹果酸异构酶 影响细胞壁合成，钾离子吸收，c-di-AMP水平，细菌的存活能力 7B_12 rseB 一种直链蛋白 调控外膜完整性，调节Sigma E因子转录 7E_12 thiQ 硫胺素ABC转运ATP结合蛋白 蛋白TbpA、ThiP和TPP运输系统的一部分 7H_1 明胶酶活性降低 potD 蛋白PotD是与底物结合的细胞质组分 转运亚精胺和腐胺 5E_2 菌膜形成能力降低 leuO 2-异丙基苹果酸异构酶 调节群体感应，参与各种基因的表达，影响生物膜的形成 6A_2 ilvH 乙酰乳酸合酶 催化从丙酮酸到2-乙酰乳酸的合成 6E_12 基因名称不明确 核苷合成蛋白 促进GTP的合成，用于天门冬氨酸、天门冬酰胺、酪氨酸和组氨酸的合成 grpB 2-甲基异柠檬酸裂解酶 促进2-甲基异柠檬酸酯催化丙酮酸和琥珀酸酯的形成 6G_1 泳动性增强 基因名称不明确 磷酸二酯酶 水解细胞内第二信使(环磷酸腺苷cAMP或环磷酸鸟苷cGMP)

表 3 转座子插入位点信息 Tab.3 Information of transposon insertion site

肌肉注射攻毒实验结果见表 4。由表 4可知，突变子6G_1的LD₅₀为5.439×10⁴ CFU/尾，野生型M3是该突变子的2.04倍，突变子5A_11、7B_12和7E_12的LD₅₀分别为3.29×10⁵、3.734×10⁵、和3.734×10⁵ CFU/尾，分别为野生型M3的2.96、3.25和3.36倍。7H_1的LD₅₀为1.374×10⁵ CFU/尾，是野生型M3的1.25倍，5E_2、6A_2和6E_12的LD₅₀分别为3.716×10⁵、4.453×10⁵和2.052×10⁵ CFU/尾，分别为野生型M3的3.34、4.08和1.84倍。

表 4(Tab.4)

表 4 鳗弧菌M3野生型及其突变子株攻毒实验结果 Tab.4 Experimental results of virulence of V. anguillarum M3 wild type and its mutants 菌株Strain 半数致死量LD50(CFU/尾) M3 1.111×105 6G_1 5.439×104 5A_11 3.290×105 7B_12 3.611×105 7E_12 3.611×105 7H_1 1.374×105 5E_2 3.716×105 6A_2 4.453×105 6E_12 2.052×105

表 4 鳗弧菌M3野生型及其突变子株攻毒实验结果 Tab.4 Experimental results of virulence of V. anguillarum M3 wild type and its mutants

本研究利用mini-Tn10转座子构建了鳗弧菌M3的突变文库，筛选得到影响细菌泳动、酪蛋白酶活性、明胶酶活性、菌膜形成能力的突变子菌株，通过基因步移和序列比对，找到影响上述表型的相关基因。结果显示，1个磷酸二酯酶相关基因的突变引起泳动能力增强(P < 0.05)，毒力相对增强，leuD、rseB、thiQ的突变引起酪蛋白酶活性明显减弱(P < 0.05)，potD的突变引起明胶蛋白酶活性显著减弱(P < 0.05)，leuO、ilvH和grpB的突变引起菌膜形成能力明显减弱(P < 0.05)且这些菌株毒力相对减弱。研究表明，细菌毒力产生主要包括铁摄取系统、外膜蛋白、胞外蛋白酶、脂多糖和溶血素等(Weber et al, 2009; Naka et al, 2011)。O’Toole等(1996)研究发现，鳗弧菌鞭毛被破坏后，泳动能力减弱的菌株毒力较野生型减弱了几百倍，表明趋化运动是鞭毛对鳗弧菌毒力的一种必需功能。Hao等(2013)研究表明，鳗弧菌rpoN基因缺失突变株因为其各种表型缺陷和调控能力丧失，致使鳗弧菌在宿主体内存活能力下降，致病力减弱，证实了表型和毒力存在相关性。

磷酸二酯酶(PDES)具有水解细胞内第二信使(环磷酸腺苷cAMP或环磷酸鸟苷cGMP)的功能，降解细胞内cAMP或cGMP，从而终结这些第二信使所传导的生化作用(田慧等, 2003)。Fahmin等(2017)研究显示，PDES、二腺苷酸环化酶(DACS)和c-di-AMP合成酶构成环二腺苷单磷酸(c-di-AMP)，PDES和DACS协同调节c-di-AMP的稳态，PDES的缺失可导致革兰氏阳性细菌的细胞壁发生改变、钾离子吸收失调、c-di-AMP水平改变、细菌的存活率下降。c-di-AMP在不同的细菌体内具有不同的作用，可以影响生物膜的形成、毒力因子的表达、运动性和碳代谢(Corrigan et al, 2013)，但其调控细菌表型和毒力的机制尚不清楚(Pham et al, 2016; Corrigan et al, 2013)。本研究中，由于转座子插入，使鳗弧菌的1个PDES失活，有可能影响了细菌细胞壁离子代谢和生物膜形成，而导致细菌运动能力改变，具体的影响机制还需进一步探究。

leuD编码异丙基苹果酸异构酶，将α-异丙基苹果酸催化为β-异丙基苹果酸，为亮氨酸的合成提供前体(Kohlhaw et al, 2003)。qsdS编码异丙基苹果酸脱氢酶，具有N-酰基-L-高丝氨酸内酯(AHL)降解酶活性(Ma et al, 2018)。AHL参加细菌密度感应系统(QS)的调节，调控生物膜形成(Parsek et al, 2000)、蛋白酶活性(Waters et al, 2005)等。在染色体上，qsdS位于leuD和leuO之间，由此推测，leuD的插入失活间接影响了qsdS的功能，从而影响鳗弧菌QS的功能，使蛋白酶活性、生物膜形成能力受到影响。

rseB编码一种细胞质蛋白，与内层锚定蛋白RseA结合，调节膜内蛋白水解与蛋白酶活性(Kim et al, 2010)；thiQ编码硫胺素ABC转运ATP结合蛋白，参与细菌的能量代谢，该基因的缺失不仅使细菌整体的能量代谢下降，还使细菌的生长减慢，细菌生物膜合成所需的蛋白、胞外多糖等合成能力减弱(Huang et al, 2014)。potD编码一种胞浆蛋白，参与亚精胺和腐胺的转运(Shah et al, 2008)。因此，这些基因的缺失可能导致鳗弧菌多种蛋白或蛋白酶合成能力、转运能力下降，间接影响蛋白酶的活性。这些基因对蛋白酶活性的影响机制有待阐明。

ilvH编码乙酰乳酸合酶，催化2-乙酰乳酸的合成，参与三羧酸循环(Zhao et al, 2013)；grpB编码2-甲基异柠檬酸裂解酶，促进2-甲基异柠檬酸酯催化丙酮酸和琥珀酸酯的形成，参与碳源合成(Hubstenberger et al, 2015)，说明ilvH和grpB与ATP合成相关。因此，猜测这2个参与能量合成的基因间接影响鳗弧菌菌膜的形成，它们对菌膜形成的影响机制有待阐明。

总之，本研究通过转座子文库，鉴定出8个与鳗弧菌运动、胞外蛋白酶活性、菌膜形成有关的基因。由于转座子的插入突变可能会引发极性效应，使得插入位点的下游基因受到影响。因此，后期还需要通过基因敲除、基因回补实验来确证它们与表型变化的关系，在此基础上研究基因的功能及作用机制。