红毛菜属(Bangia lyngbye)分布广泛，几乎遍布亚寒带及亚热带等地(Woolcott et al, 1998; Müller et al, 2003; 汪文俊等, 2008)，兼具海水和淡水种类。红毛菜(Bangia fuscopurpurea)为典型海水种，一般生长在风浪较大的高潮带岩石上；暗紫红毛菜(Bangia atropurpurea)为淡水种，也是目前发现的唯一一个淡水红毛菜科(Bangiaceae)藻类(Wang et al, 2018)。红毛菜具有较高的营养、药用和生态价值(黄文凤等, 1998; 马家海等, 2002; 王翔宇等, 2011)，已成为继海带、紫菜、龙须菜之后在福建莆田养殖的代表性经济海藻之一。

不同于潮间带其他海藻(如紫菜)，红毛菜属红藻在数亿年演化过程中完成了海水种到淡水种的进化(Butterfield, 2000)，证明红毛菜拥有一套特殊的盐度适应机制。前期研究发现，红毛菜在低盐胁迫初期，质膜-H⁺-ATPase基因的表达量呈快速上升趋势，提示该酶在红毛菜响应盐度变化过程中起着关键的调节作用(曹原, 2018; Wang et al, 2019)。质膜-H⁺-ATPase是植物细胞质膜上最重要的酶类，在植物抗逆过程中发挥积极作用。NaCl处理使耐盐小麦根质膜-H⁺-ATPase活性升高(Yang et al, 2003)。盐胁迫过程中，耐盐性芦苇愈伤组织质膜-H⁺-ATPase蛋白量与对照组相比明显增多(Zhao et al, 2004)。钒酸钠是质膜-H⁺-ATPase的专一抑制剂，在调控植物质膜-H⁺-ATPase活性方面应用较为广泛。王小治等(2010)研究发现，钒酸盐可显著抑制玉米根质膜-H⁺-ATPase活性。朱志明等(2017)研究表明，钒酸钠能显著抑制宁夏枸杞根系在盐胁迫下质膜-H⁺-ATPase的活性，从而改变细胞内外离子流向。

叶绿素荧光技术是研究植物光合作用和逆境生理的重要工具之一(Schreiber et al, 1995)。目前，叶绿素荧光技术在紫菜(姚春燕等, 2011; Wang et al, 2016; Li et al, 2018)、鼠尾藻(Sargassum thunbergii)(梁洲瑞等, 2011)、铜藻(Sargassum horuer) (张玉荣等, 2009)等藻类胁迫机制研究中已有较多应用。PSⅡ原初光能转化效率(F_v/F_m)反映植物在充足的暗适应后，所有PSⅡ反映中心均处于开放状态时的量子产量，是衡量植物光合完整性的指标之一(张守仁, 1999)。当植物遭遇外界胁迫时，F_v/F_m值存在不同程度的下降，表明PSⅡ反应中心受到了不同程度的损伤。液相氧电极技术可以准确测得海藻实时的表观光合速率(P_n)及呼吸耗氧速率(R_d)，目前，已广泛应用于藻类光合生理领域(姚海芹等, 2016; 张曼等, 2010; 马兴宇等, 2014)。

本研究采用叶绿素荧光技术和液相氧电极技术，研究了红毛菜光合系统和质膜-H⁺-ATPase对盐胁迫的响应，旨在为揭示红毛菜盐胁迫响应机制、培育红毛菜抗逆优质品种奠定基础。

暗紫红毛菜于2019年5月采自山西阳泉娘子关(37°6′N、113°5′E)，红毛菜于2018年3月采自山东东营港(118°6′N、38°1′E)。取回后立即冲洗、晾干，以去除表面附生杂藻及污泥，灭菌海水和淡水分别作为红毛菜与暗紫红毛菜的培养液，放入光照培养箱内暂养。暂养条件：温度为15℃，光照为40 μmol/(m²·s)，光周期为12 L : 12 D。培养液中添加2 mg/L NO₃^--N，1 mg/L PO₄^3--P。培养适应3 d后进行盐胁迫实验。

盐度对红毛菜和暗紫红毛菜F_v/F_m值的影响：设置5个盐度组(括号中为相应处理的符号表示，下同)：32(S₃₂)、24(S₂₄)、16(S₁₆)、8(S₈)和0(S₀)，每组3个平行。培养1 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d后，测定F_v/F_m (Eggert et al, 2007)。测定方法：取少量红毛菜于暗盒中，对藻体进行20 min暗适应，打开IMAGING-PAM (WALZ，德国)，设置测量光和光化光并选取待测位点，进行测定。

盐度对红毛菜和暗紫红毛菜表观光合速率、呼吸耗氧速率值的影响：盐度设置同上。培养6 h、1 d、3 d、5 d、7 d后，用液相氧电极(Hansatech Oxygraph，英国)测定样品的表观光合速率(P_n)和呼吸耗氧速率(R_d)。反应介质为灭菌海水和淡水，光源为500 W碘钨灯，通过控制灯的远近将光强控制在40 μmol/(m²·s)。每个条件下反应稳定5 min，每次测试时间控制在10 min内，取较为平滑曲线计算。由氧电极自带软件得出实验数据，每个梯度设3次平行。

设置4个钒酸钠浓度(括号中为相应处理的符号，下同)：0(V₀)、50(V₅₀)、200(V₂₀₀)和500 μmol/L(V₅₀₀)，每组实验设置3个生物学重复。培养1 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d后，测定红毛菜的F_v/F_m值。

盐度和钒酸钠对红毛菜和暗紫红毛菜F_v/F_m值的影响：钒酸钠及盐度设置同上，分别测定不同钒酸钠浓度处理液中，各盐度胁迫下2种红毛菜的F_v/F_m，操作同上。

盐度和钒酸钠对红毛菜和暗紫红毛菜表观光合、呼吸耗氧速率值的影响：钒酸钠浓度为500 μmol/L，盐度设置及操作同上。

采用Excel软件进行数据整理分析并绘制图形，采用SPSS 18.0软件分别进行t检验、单因子方差(One-way ANOVA)分析以及Duncan多重比较，P < 0.05作为差异显著水平。

从图 1A可以看出，红毛菜在低盐胁迫1h时后，各胁迫组F_v/F_m与对照组(S₃₂)相比显著下降(P < 0.05)。12 h时，各组间F_v/F_m无显著差异。一直到第7天，S₁₆和S₂₄组F_v/F_m与对照组相比无显著差异，S₀组F_v/F_m在12 h~7 d的胁迫期内呈直线下降趋势。在处理过程中，S₈组F_v/F_m出现较大波动，1~3 d线性下降，低于对照组(P < 0.05)，第4天时，恢复到与对照组相当，第4~5天又呈线性下降。

图 1(Fig. 1)

图 1 不同盐度处理后的红毛菜(A)和暗紫红毛菜(B)的Fv/Fm Fig.1 The Fv/Fm of B. fuscopurpurea (A) and B. atropurpurea (B) at different salinities

从图 1B可以看出，暗紫红毛菜在高盐胁迫1 h时，各胁迫组F_v/F_m与对照组(S₀)均呈显著差异(P < 0.05)，且与高盐胁迫程度正相关。6 h时，胁迫组F_v/F_m快速回升，12 h时，与对照组相当。1~3 d时，各胁迫组与对照组相比，F_v/F_m均显著下降。4~5 d时，S₃₂与S₂₄组出现较大波动，第5天时，S₃₂组显著低于对照组(P < 0.05)。第7天时，只有S₂₄组显著低于对照组(P < 0.05)，其余各组均与对照组无显著差异(P > 0.05)。

从图 2A可以看出，与对照组相比，低盐胁迫使红毛菜P_n显著降低(P < 0.05)。6 h时，各盐度组均显著低于对照组(P < 0.05)，且S₂₄组显著低于其他各组(P < 0.05)；第1天，S₃₂、S₂₄、S₁₆和S₈胁迫组P_n上升(P < 0.05)，第3天又显著下降(P < 0.05)；在6 h~3 d中，S₀组P_n呈线性下降(P < 0.05)，而后在第5天时上升，但仍低于对照组(P < 0.05)；5~7 d时，各盐度组间P_n较稳定。

图 1(Fig. 1)

图 2 盐度对红毛菜(A)和暗紫红毛菜(B)表观光合速率的影响 Fig.2 The net photosynthetic rate of B. fuscopurpurea (A) and B. atropurpurea (B) at different salinities

从图 2B可以看出，暗紫红毛菜中，对照组P_n一直维持在较稳定水平。6 h时，S₁₆、S₂₄和S₃₂胁迫组P_n显著低于对照组(P < 0.05)，且组间差异不显著(P > 0.05)，S₈组明显高于对照组(P < 0.05)；1 d时，S₁₆、S₂₄和S₃₂组P_n显著上升(P < 0.05)；3~5 d时又降低(P < 0.05)，后维持较稳定水平，显著低于对照组(P < 0.05)；第7天时，S₂₄组显著上升(P < 0.05)，且各盐度胁迫组P_n显著低于对照组(P < 0.05)。

从图 3A可以看出，红毛菜在胁迫6 h时，S₁₆、S₈和S₀组显著低于对照组(P < 0.05)；1 d时，各盐胁迫组R_d上升，仅S₈组显著低于对照组(P < 0.05)；5~7 d时，各胁迫组R_d显著低于对照组(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 3 盐度对红毛菜(A)和暗紫红毛菜(B)呼吸耗氧速率的影响 Fig.3 The respiratory oxygen consumption rate of B. fuscopurpurea (A) and B. atropurpurea (B) at different salinities

从图 3B可以看出，暗紫红毛菜在6 h~1 d时，S₈、S₂₄与S₃₂组R_d显著低于对照组(P < 0.05)，S₁₆组与对照组相当；3 d时，S₁₆组R_d降低，显著低于对照组(P < 0.05)；3 d时，其余3组R_d上升；到第7天时，除S₁₆组与对照组无显著差异外，其他胁迫组均显著高于对照组(P < 0.05)。

从图 4A可以看出，红毛菜藻体培养6 h，对照组(V₀)相比，仅V₂₀₀组F_v/F_m显著下降(P < 0.05)，3~7 d时，V₂₀₀与V₅₀₀组下降显著(P < 0.05)。前期，V₅₀组与对照组无显著差异，从第6天开始，V₅₀组的F_v/F_m显著高于对照组。暗紫红毛菜(图 4B)除第12小时外，各胁迫组与对照组相比，F_v/F_m均显著下降(P < 0.05)。早期(1~12 h)，各钒酸钠组之间无显著差异，但从第5天开始，F_v/F_m下降幅度与钒酸钠浓度成正比。

图 1(Fig. 1)

图 4 不同浓度钒酸钠处理后的红毛菜(A)和暗紫毛菜(B) Fv/Fm值 Fig.4 The Fv/Fm of B. fuscopurpurea (A) and B. atropurpurea (B) at different Na3VO4 concentrations

从图 5A~图 5D可以看出，红毛菜在低盐胁迫下，早期(1~12 h)钒酸钠组的F_v/F_m与对照组相比，差异不显著(P > 0.05)，有些钒酸钠浓度组比对照组高(P < 0.05)。随低盐胁迫程度的增加，高钒酸钠浓度组对F_v/F_m影响显著(P < 0.05)，在S₂₄、S₁₆和S₈组胁迫下(图 5A~图 5C)，实验后期(4~7 d)，V₂₀₀和V₅₀₀钒酸钠胁迫组F_v/F_m下降明显，均显著低于对照组(P < 0.05)；V₅₀组总体上与对照组差异不显著；S₀组中(图 5D)，随胁迫时间的延长(3~7 d)，V₅₀和V₂₀₀组F_v/F_m显著高于对照组(P < 0.05)，且与钒酸钠浓度正相关，而V₅₀₀组下降趋势明显(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 5 不同盐度和钒酸钠处理后红毛菜(A~D)和暗紫红毛菜(E~H)的Fv/Fm Fig.5 The Fv/Fm of B.fuscopurpurea (A~D) and B.atropurpurea ((E~H) at different Na3VO4 concentrations and salinities

从图 5E~图 5H可以看出，暗紫红毛菜在1 h时，除S₁₆组，其他高盐胁迫组、高浓度钒酸钠(V₂₀₀和/或V₅₀₀)组，F_v/F_m显著高于对照组。6~12 h时，高盐胁迫组F_v/F_m总体上明显上升，随后，F_v/F_m呈不同程度下降：S₁₆和S₈组中(图 5E~图 5F)，从第3天或第4天开始，各钒酸钠组F_v/F_m明显下降，显著低于对照组(P < 0.05)，且高浓度钒酸钠组的下降幅度显著增大(V₂₀₀≈V₅₀₀ < V₅₀)；S₂₄组中(图 5G)，2~3 d时，V₅₀₀组显著高于对照，5 d后，所有钒酸钠组F_v/F_m均显著低于对照组(P < 0.05)，但不同钒酸钠浓度组间不成线性关系；S₃₂中(图 5H)，从第1天开始，各钒酸钠组与对照组相比差异不显著；第4天，各钒酸钠组显著低于对照组，随后，仅V₅₀₀组显著低于对照组，V₅₀和V₂₀₀组与对照组间无显著差异(P < 0.05)。

从图 6A可以看出，红毛菜在500 μmol/L钒酸钠胁迫6 h时，S₂₄和S₁₆组显著低于对照组(S₃₂) (P < 0.05)，其他2组显著高于对照组(P < 0.05)；第1天时，S₂₄、S₁₆和S₈组P_n显著上升，高于对照组(P < 0.05)；3~7 d时，S₈组与对照组相当，甚至高于对照组；第7天时，仅S₀组显著低于对照组及其他胁迫组(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 6 盐度、钒酸钠对红毛菜(A)和暗紫红毛菜(B)表观光合速率的影响 Fig.6 The net photosynthetic rate of B. fuscopurpurea (A) and B. atropurpurea (B) at different salinities with Na3VO4

从图 6B可以看出，暗紫红毛菜在实验过程中，对照组P_n波动较大，呈先上升后下降的趋势。6 h时，S₈组与对照组相当，其他高盐胁迫组均显著低于对照组(P < 0.05)；1 d时，S₀、S₈、S₁₆和S₂₄组P_n显著上升(P < 0.05)，1~3 d时，各胁迫组P_n较稳定，显著低于对照组(P < 0.05)；第5天，各胁迫组显著高于对照组(P < 0.05)；7 d时，S₁₆和S₃₂组与对照组相当，均为负值。

在500 μmol/L钒酸钠中，红毛菜(图 7A)在6 h时，S₂₄组R_d高于对照组，其他低盐组与对照组相当或略低于对照组；1 d时，S₂₄和S₁₆组显著高于对照组(P < 0.05)；3 d时，S₀组R_d上升显著，高于对照组(P < 0.05)。5 d时，低盐(S₁₆、S₈和S₀组)胁迫组均显著下降，明显低于对照组(P < 0.05)。培养第7天时，除S₂₄组高于对照组外，其他各组间差异不显著。

图 1(Fig. 1)

图 7 盐度、钒酸钠对红毛菜(A)和暗紫红毛菜(B)呼吸耗氧速率的影响 Fig.7 The respiratory oxygen consumption rate of B. fuscopurpurea (A) and B. atropurpurea (B) at different salinities with Na3VO4

从图 7B可以看出，暗紫红毛菜在6h时，各胁迫组R_d值显著高于对照组(100%淡水) (P < 0.05)；1 d时，对照组R_d略有上升，除S₃₂组外，其余胁迫组R_d显著低于对照组(P < 0.05)；3 d时，S₂₄和S₃₂组R_d直线上升，显著高于对照组及其他2组(P < 0.05)；5~7 d时，对照组R_d值较稳定，除S₁₆组外，其他胁迫组均显著高于对照组(P < 0.05)，且第7天时，胁迫组间差异不显著。

叶绿素荧光参数可反应光合作用的强弱(Anderson et al, 1987)，可以作为生物遭遇外界胁迫时的环境传感器(Pfannschmidt, 2003; Bräutigam et al, 2010)。本研究发现，红毛菜在低盐、暗紫红毛菜在高盐胁迫下，F_v/F_m均快速下降(1 h)，下降幅度与胁迫程度正相关。随胁迫时间的延长，低盐胁迫(S₀和S₈组)对红毛菜的F_v/F_m具有明显抑制效应，其他胁迫组与对照组相当；在暗紫红毛菜中，各高盐胁迫组F_v/F_m从第1天开始显著低于对照组，但到后期(6~7 d)，全海水培养与对照组(S₀)相比没有差异，可见高度低盐胁迫对红毛菜光合作用影响较大，暗紫红毛菜对海水有较强适应能力。

当植物应对逆境胁迫时，最先作出反应的是质膜及其功能蛋白(Gong et al, 2002)。质膜-H⁺-ATPase在细胞离子稳态的建立和维持过程中起着巨大作用，其活性的变化是植物受伤害的原初位点。钒酸盐常被用作质膜-H⁺-ATPase的特异性抑制剂(Cantley et al, 1977、1978)，其作用位点位于ATPase的磷酸酶结构域(Serrano, 1989; De Michelis et al, 1986)。彭建新等(2000)研究发现，钒酸钠可以显著抑制杜氏盐藻(Dunaliella saline)细胞的光合放氧速率，使其生长速率明显降低(魏亮等, 2006)。同时，钒酸盐可显著降低甜土植物(Glycophytes)与盐生植物(Halophytes)的F_v/F_m (Percey et al, 2016)。质膜-H⁺-ATPase基因在红毛菜遭受胁迫时，表达量明显上升(曹原, 2018)。本研究中，S₀组的红毛菜与S₃₂处理组的暗紫红毛菜，在钒酸钠胁迫下，F_v/F_m值的变化与其他组明显不同(图 1)。从研究结果来看，50~200 μmol/L钒酸钠提高了红毛菜对低盐胁迫的耐受性，钒酸钠本身是一种钠盐，而Na⁺是藻类应对盐胁迫时的关键离子(Balnokin et al, 1997; Serrano et al, 1999)，在淡水中加入适量钒酸钠，提高了环境中的Na⁺浓度，从而缓解了低盐胁迫效应。同理，向淡水中添加钒酸钠增加了Na⁺浓度，导致暗紫红毛菜在对照组(S₀)中的F_v/F_m随钒酸钠浓度的增加直线下降。而在高盐胁迫下的暗紫红毛菜，启动了一系列高盐胁迫响应机制，此时，加入中等程度的钒酸钠，对其在高盐环境下的影响反而不显著。

基于盐胁迫下红毛菜F_v/F_m以及盐胁迫下海水红毛菜质膜-H⁺-ATPase基因的表达特征，进一步检测了采用质膜-H⁺-ATPase的特异性抑制剂钒酸钠处理后，红毛菜的光合作用与呼吸作用的变化情况。结果显示，红毛菜在低盐胁迫下，P_n与R_d总体低于对照组，可能是盐胁迫导致植物叶绿素降解，从而降低叶绿体对光能的吸收，影响光能在2个光系统间的合理分配，从而降低光合速率(Aro et al, 1993; 惠红霞等, 2004)。实验后期，红毛菜各胁迫组P_n与R_d较为恒定，组间差异不显著；暗紫红毛菜各胁迫组R_d在1~7 d中均有不同程度的上升(图 3)。可能原因是呼吸作用为植物生命活动提供能量，而植物通过调节自身生理状态来适应或抵抗盐胁迫等一系列过程需要消耗大量能量，因此，盐胁迫下暗紫红毛菜的呼吸强度增加。

在添加500 μmol/L钒酸钠后，2种红毛菜P_n与R_d在实验前期均出现不同幅度上升，随后，各组有不同程度下降，与F_v/F_m结果类似。红毛菜在中等程度盐胁迫下，早期P_n甚至高于对照组，可能是因为Na⁺缓解了红毛菜的低盐胁迫效应；随胁迫时间的延长，各胁迫组P_n显著下降，第7天时，仅S₀组显著低于其他各组。R_d则波动较大(图 7)，实验后期，各组总体处于同一水平。而暗紫红毛菜在500 μmol/L钒酸钠胁迫下，对照组P_n从第5天开始直线下降，胁迫组R_d在第3天时，上升幅度与低盐胁迫程度基本呈正相关，后期P_n与R_d均出现胁迫组高出对照组现象。说明红毛菜在正常环境中，钒酸钠抑制了质膜-H⁺-ATPase活性，从而降低了藻体光合呼吸速率。当红毛菜或暗紫红毛菜应对低盐或高盐胁迫时，出现少数胁迫组P_n或R_d升高现象，原因可能是逆境促使质膜-H⁺-ATPase基因表达上调，质膜-H⁺-ATPase活性上升，超出钒酸钠可调控范围，对此有待进一步研究证实。