草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是“四大家鱼”之一，在我国淡水渔业经济中占据着举足轻重的地位。近年来，由于生境破坏、水利设施的修建、过捕等因素，其天然资源急剧下降(沈玉帮等, 2011)。为达到渔民增收、资源恢复等目标，国家实施了大规模增殖放流的政策，草鱼属农业部《关于“十三五”水生生物增殖放流工作指导意见》中的主要品种。值得注意的是，一些传统标记方法受到很多限制，如切鳍法只适用于短期标志；挂牌法主要适用于大型鱼类(罗新等, 2011)；分子标记成本高且检测相对复杂(李树华等, 2014)等。因此，探索适合草鱼(特别是鱼苗)增殖放流标记和评价方法刻不容缓。

耳石存在于大多数硬骨鱼类的内耳的膜迷路内，有矢耳石、微耳石和星耳石3种类型，对鱼类的听觉和身体的平衡有重要的作用(Campana, 1999)。耳石标记常用的荧光物质包括盐酸四环素(Tetracycline hydrochloride, TCH)、土霉素(Oxytetracycline, OTC)、钙黄绿素(Celcein, CAL)、茜素红S(Alizarin red S)和茜素络合物(Alizarin complexone, ALC)，其中，ALC使用最广且效果较好(宋昭彬等, 1999; 付自东等, 2005)。此前，草鱼耳石的研究多集中在形态比较及类群判别(宋昭彬等, 2003a、b; 曾祥波等, 2012)、年龄鉴定及与生长的关系(宋昭彬等, 2001; 李建军等, 2010)、孵化期推算(管兴华等, 2007; 张国等, 2013)等方面，尚未见有相关化学标记研究。本研究利用ALC对草鱼仔鱼的耳石进行标记，探讨此方法对该鱼种的适用性，为今后草鱼相关的大规模标记提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法 1.1 实验材料

本实验在中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南区实验基地开展。实验所用的仔鱼苗由基地于2019年5月19日采购(3日龄)。根据陈真然(1963)的划分标准，将其归为仔鱼(图 1)。鱼苗采购后，置于装有经48 h曝气自来水的玻璃缸(长×宽×高为100 cm × 45 cm×50 cm)中暂养。暂养过程中投喂蛋黄水，每日投喂2次，每日清理鱼体排泄物及换水1次，换水量为养殖水体的1/4。随机选取规格基本一致[平均全长为(8.31±1.21) mm，平均体重为(0.06±0.02) g]的草鱼仔鱼，放入桶中作为供试鱼，于2019年5月25日开始茜素络合物(ALC)标记实验，标记期间不喂食，浸泡标记24 h后，移到恢复养殖缸(长×宽×高为50 cm× 50 cm× 40 cm)中进行养殖，在恢复养殖期间，前期继续投喂蛋黄水，待草鱼达到30日龄后开始投喂粉状普通配合饲料，每日投喂2次，每日清理鱼体排泄物及换水1次，换水量占养殖水体的1/4。在暂养及整个实验期间均正常充气增氧，水温在23~32℃之间，自然光照，不控光周期。

1.2 实验方法

本研究的茜素络合物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，包装规格为1 g/瓶。实验分为2个阶段，第1个阶段为浸泡标记阶段。参考邱晨等(2018)的方法，使用茜素络合物对鲤(Cyprinus carpio)仔鱼的浸泡浓度，实验设置对照组及标记组(100 mg/L)，各组随机选择100尾鱼进行24 h浸泡实验。浸泡标记期间，统计12、24 h对照组及标记组的个体急性死亡情况。第2个阶段为恢复养殖阶段。浸泡标记结束后，将标记组实验鱼移出，放到恢复养殖缸中继续养殖。本研究样本采集分为2个阶段，在恢复养殖的0~40 d中，标记组和对照组每5 d定期取样，每次取样5尾，以设置样本重复。取至第40天后，每10 d取样1次，同样每次取样5尾，以确保样本重复，直至取样到第60天结束。取样之后，利用电子天平测量其体重，电子游标卡尺测量其全长(数据分别精确至0.001 g和0.01 mm)。0~20 d的样品先保存在100%无水乙醇中，然后置于4℃的冰箱中冷藏，25~60 d的样品直接放入自封袋中，于-20℃冰箱中冷冻。在恢复养殖期间，统计标记组和对照组死亡数，并及时移出死鱼。

1.3 耳石样品的摘取、制备及检测方法

将样本鱼置于载玻片上，放于解剖镜下，用解剖针将耳石从听囊中快速取出。先用去离子水清洗去除耳石表面的杂质及黏液，然后用无水乙醇脱水、干燥，使用电子探针微区分析仪(JXA-8100，日本电子株式会社)对3类耳石形态进行扫描拍照(图 1)。参考邱晨等(2018)对鲤仔鱼荧光标记的处理措施，使用无色透明指甲油将耳石包埋固定在载玻片上(无需打磨)，待指甲油凝固后，避光保存(Stöter et al, 2019)。在OLYMPUS BX51型显微镜(日本)的可见光、蓝色激发光(WBS)和绿色激发光(WGS)下对其进行观察，比较最适光源，并利用显微镜自带的Stream start软件进行图谱拍照和图像处理。在进行耳石浸泡标记的时滞观察时，先将耳石打磨至露出核心，再在其表面用无色透明指甲油二次固定。使用OLYMPUS BX51型显微镜对耳石日轮数目进行计数。耳石标记效果参照欧阳斌等(1999)的方法按无(-)、微弱(+)、较明显(++)、明显(+++)和非常明显(++++) 5个等级进行记录。

1.4 数据分析

利用Excel 2010对数据进行统计分析和制图。同时，利用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，对实验鱼生长差异进行显著性分析，设定差异显著性水平为P < 0.05。

2 结果 2.1 ALC标记对草鱼仔鱼生存及生长的影响

在24 h的ALC浸泡过程中，实验组和对照组均未出现死亡，存活率为100%。在浸泡过程中，标记组仔鱼的游泳能力正常，没有表现出任何异常行为，说明100 mg/L的ALC标记对草仔鱼产生的影响较小或者未产生影响。浸泡标记24 h后，移到恢复养殖缸中继续养殖。在恢复养殖的0~60 d内，统计标记组和对照组的死亡数，截止第60天取样，标记组死亡2尾，对照组死亡9尾，样本数统计不包括死亡数。

随着恢复养殖天数的增加，鱼体发生明显变化，各个器官逐渐发育完全，接近成鱼。观察发现，标记组和对照组在鱼体发育的成熟度上没有明显差异，其摄食和游泳能力均正常。对样本的平均体重及平均全长计算可以看出(图 2)，草鱼仔鱼的体重及全长随恢复养殖天数增加而逐渐增加。同时，0~10、20~40 d标记组与对照组的平均体重存在显著差异(P < 0.05)，15、50、60 d标记组样本鱼的平均体重与对照组差异不显著(P > 0.05)。5~10、20~35 d标记组与对照组的平均全长差异显著(P < 0.05)，0、15、40~60 d标记组样本鱼的平均全长与对照组差异不显著(P > 0.05)。综合来看，标记组和对照组的平均体重及平均全长的差异性呈无规律性。

2.2 茜素络合物浸泡标记草鱼仔鱼耳石效果检测 2.2.1 草鱼仔鱼3类耳石的ALC浸泡标记效果

在荧光显微镜的可见光及2种激发光源下观察草鱼仔鱼矢耳石、微耳石和星耳石的标记效果，发现草鱼仔鱼微耳石的标记效果最好，矢耳石次之(图 3)。微耳石的形状为椭圆形，经过ALC浸泡标记过的耳石在其上面形成了一个明显的橘红色标记环，且微耳石的日轮轮纹清晰，在显微镜的可见光下，能清楚地计数日轮数目。同样，矢耳石的标记环也清晰可见，形状为箭矢形，具有中间厚两端薄的特点，随着生长天数的增加，观察到的标记环逐渐模糊。在本实验中，星耳石的荧光标记结果有2种，一种是耳石的标记部分表现为一个小点或一个小环，另一种是观察不到任何标记现象。因此，草仔鱼微耳石的荧光标记效果最佳，是观察草鱼仔鱼标记效果的理想选择。以下内容以微耳石为依据进行比较。

2.2.2 微耳石经ALC浸泡标记后在3种光源下的信号检测效果

在可见光、蓝色激发光和绿色激发光下，对微耳石进行拍照观察，发现标记强度明显不同(表 1)。所有微耳石在可见光、蓝色激发光和绿色激发光下，均能看到1个明显的标记环，但三者对标记产生的颜色反应不同(图 3)。在可见光下，ALC浸泡过后在耳石上看到一个深红色的标记环，但随着恢复养殖天数的增加，深红色标记环的颜色逐渐变淡，甚至完全观察不到。在蓝色激发光下，微耳石上形成一个橘红色的标记环，与没有标记的绿色部分形成强烈反差，颜色鲜艳，容易观察。在绿色激发光下，ALC浸泡过后，耳石上形成一个深红色的标记环，没有被标记部分呈淡橘红色，二者颜色相近，容易造成混淆，且标记环与未标记部分界线不容易区分，对于识别准确的标记日轮产生一定的干扰。因此，对于草鱼仔鱼荧光标记来说，蓝色激发光为较理想的观察光源。

2.2.3 不同恢复养殖天数草鱼仔鱼微耳石在蓝色激发光下的ALC标记检测效果

观察不同恢复养殖天数下的微耳石(图 4)可以看到，荧光标记信号强度呈先增强后减弱的趋势。在第0天取样时，即浸泡完成当天取样，就能在耳石上观察到一个明显的标记环，且标记环清晰，说明ALC在浸泡当日就在耳石上积累形成了标记。第5天时，已能看到耳石标记环外面的新区域，与标记环里的区域形成强烈反差，标记环观察更为清晰。第10~40天的耳石标记环强度基本没有发生变化，荧光信号强度稳定，为最佳观察时间段。但从第50天和第60天的耳石标记强度来看，荧光信号强度有下降趋势，标记环略模糊，但仍然具有很强的可见性。

2.3 草鱼仔鱼经ALC浸泡后耳石标记出现和消失的时滞

以浸泡标记第5天的微耳石为例(图 5)，在显微镜下，3种可见光下的耳石相同位置上能观察到颜色不同的标记环。在可见光下对耳石的部分进行放大，观察日轮并计算耳石荧光信号标记出现和消失的时滞。由于草鱼仔鱼的日龄为生长轮数目加1(宋昭彬等, 2001)，因此，具有第一日轮的草鱼为2日龄，完整的日轮由明带和暗带共同组成。草鱼仔鱼浸泡当日为9日龄，开始浸泡标记时间为17:00，此时，第8日轮的明带已经形成，暗带开始形成；而浸泡结束时草鱼仔鱼为10日龄，此时，第9日轮的明带已经形成，暗带尚未形成。从耳石的荧光标记环来看，耳石的荧光标记信号在第9日轮的明带和暗带上，在第9日轮前后都无荧光信号出现。即在浸泡当晚，耳石第8日轮暗带形成的过程中，荧光物质并没有随着碳酸钙进入耳石，即为浸泡开始与标记出现的时滞，约12 h。当浸泡完成后，第9日轮的暗带开始形成，此时，仔鱼已经不处于荧光物质溶液中，其上面存在的荧光标记信号即为浸泡结束与标记消失的时滞，约12 h。因此，荧光标记环的产生和消失与浸泡的开始和结束均存在约12 h的时滞。

3 讨论 3.1 草鱼仔鱼3对耳石标记差异性特征

曾祥波等(2012)研究发现，草鱼的矢耳石和微耳石在鱼体孵化时便已存在，而鱼体的星耳石则在第12天出现，相对较晚，此现象在各种不同种类的鱼体存在(付自东等, 2005; 赵亚鹏等, 2013)。由于3对耳石在生长阶段变化的差异性，先前的研究对象主要集中在微耳石和矢耳石上(宋昭彬等, 2003a、b; 徐永江等, 2016; 付自东等, 2005)，星耳石的研究较少。草鱼仔鱼的矢耳石在刚孵化的时候为圆形，随着日龄的增加，逐渐向两端生长，变成两端薄中间厚的箭矢形；微耳石最初的形状为圆形，此外，还观察到部分微耳石的2个核心紧紧相邻，其日轮清晰，便于观察，随着日龄的增加，耳石逐渐生长为椭圆形。在本研究中，浸泡当日仔鱼为9日龄，浸泡24 h之后为10日龄，故仔鱼的星耳石尚未发育出来，在观察中看不到荧光物质留下的标记环，但部分个体的星耳石上又能观察到一个微弱的橘红色标记环，说明在浸泡当日有部分个体已经发育出了星耳石，发育之后星耳石为一豆形，其核心十分模糊，不具有一个明显的原基，但随着日龄的增加，星耳石逐渐发育完全，形状逐渐规则，向圆形过渡，轮纹清晰。本研究中所有样本鱼理论上处于同一发育日龄，由于鱼体新陈代谢的差异，不能完全保证所有鱼体具有完全一致的胚胎孵化周期(Stöter et al, 2019)，因此，不同的鱼苗日龄之间存在偏差，故能在极个别的样本鱼的星耳石上看到微弱的标记环。还有一种可能是星耳石的发育存在个体差异，受外界环境的影响，比如水温、营养、压力等，部分个体加快了其形成时间。

曾祥波等(2012)研究发现，草鱼的矢耳石和微耳石在鱼体孵化时便已存在，而鱼体的星耳石则在第12天出现，相对较晚，此现象在各种不同种类的鱼体存在(付自东等, 2005; 赵亚鹏等, 2013)。由于3对耳石在生长阶段变化的差异性，先前的研究对象主要集中在微耳石和矢耳石上(宋昭彬等, 2003a、b; 徐永江等, 2016; 付自东等, 2005)，星耳石的研究较少。草鱼仔鱼的矢耳石在刚孵化的时候为圆形，随着日龄的增加，逐渐向两端生长，变成两端薄中间厚的箭矢形；微耳石最初的形状为圆形，此外，还观察到部分微耳石的2个核心紧紧相邻，其日轮清晰，便于观察，随着日龄的增加，耳石逐渐生长为椭圆形。在本研究中，浸泡当日仔鱼为9日龄，浸泡24 h之后为10日龄，故仔鱼的星耳石尚未发育出来，在观察中看不到荧光物质留下的标记环，但部分个体的星耳石上又能观察到一个微弱的橘红色标记环，说明在浸泡当日有部分个体已经发育出了星耳石，发育之后星耳石为一豆形，其核心十分模糊，不具有一个明显的原基，但随着日龄的增加，星耳石逐渐发育完全，形状逐渐规则，向圆形过渡，轮纹清晰。本研究中所有样本鱼理论上处于同一发育日龄，由于鱼体新陈代谢的差异，不能完全保证所有鱼体具有完全一致的胚胎孵化周期(Stöter et al, 2019)，因此，不同的鱼苗日龄之间存在偏差，故能在极个别的样本鱼的星耳石上看到微弱的标记环。还有一种可能是星耳石的发育存在个体差异，受外界环境的影响，比如水温、营养、压力等，部分个体加快了其形成时间。

ALC标记环能够长期存在于耳石上，但随着时间的增加，标记环会逐渐模糊(王正鲲等, 2015)，特别是在可见光下看到的深红色标记环(邱晨等, 2019)。何春林等(2008)在对重口裂腹鱼(Schizothorax davidi)进行ALC标记时，在可见光下观察到的标记环也较微弱。在本研究50 d和60 d的样本中，在可见光下几乎看不到此标记环，而在蓝色激发光和绿色激发光下依然能够清晰地看到，但没有前期的标记环清晰。这可能是由于恢复养殖时间过长，新的日轮在不断形成，耳石在不断变大，厚度增加而减弱了荧光的穿透性(Iglesias et al, 1997; Noda et al, 2013)。另外，进行浸泡标记时，鱼体年龄很小，标记日轮靠近中心，之前经过标记的日轮与后面长出来的新的日轮形成对比，长出的区域越多，显得标记环越小，也增加了标记检测的难度。司飞等(2019)对牙鲆(Paralichthys olivaceus)进行锶标记时发现，随着标记部分所占比重的减少，某种程度可能会影响耳石上锶标记的检出效果。

3.2 草鱼仔鱼耳石ALC标记环出现和消失的时滞特征

ALC对多种鱼类均有较好的标记效果(Vigliola, 1997; Skov et al, 2001; Liu et al, 2009; 赵亚鹏等, 2013; Lü, et al 2014)。但关于浸泡开始和结束与荧光标记信号的产生和消失是否存在时间差的研究却很缺乏。邱晨等(2018)通过对鲤仔鱼的观察发现，其荧光标记信号的产生和消失与浸泡开始和结束的时间均有1 d的时滞。在本研究中，荧光标记环的产生和消失与浸泡的开始和结束均存在约12 h的时滞。这可能与不同种类的鱼具有不同的代谢速率有关。荧光标记在鱼类耳石中沉积的原理是鱼的新陈代谢促使荧光物质随着碳酸钙进入耳石，参加下一轮的碳酸钙沉积，随着时间的增加，带有荧光物质的碳酸钙积累越来越多，逐渐形成一个荧光标记环(徐永江等, 2016)。鱼苗的日龄越低，其新陈代谢速率越快，仔鱼的代谢速率要高于稚鱼和成鱼。本研究浸泡当日的鱼苗为9日龄，正处于代谢旺盛的时期，对荧光物质具有较好的吸收，荧光物质随着碳酸钙一起沉积在耳石上，形成了肉眼可见的标记环。在进行时滞观察时，由于日轮中还存在部分亚日轮，会影响日轮的正确计数，在进行时滞观察前，需要先将耳石进行打磨，直至暴露出核心为止。姜涛等(2016)在对刀鲚(Coilia nasus)耳石几种前处理方法所得年轮的观察中发现，横截面法比矢状面法更有优势。在本研究中，打磨后的耳石矢状面已经能直接清晰地看到日轮，并且无需酸蚀。打磨之后进行抛光，再用无色透明指甲油进行二次包埋，增加耳石的透光性，即可得到较为准确的日轮数目。

3.3 草鱼仔鱼耳石ALC标记实验条件的特征

对于本研究中的草鱼仔鱼来说，在100 mg/L的ALC溶液中浸泡标记24 h，经无色透明指甲油包埋的耳石(无需打磨)可以明显观察到荧光标记，能取得理想的效果。对比可见光和不同荧光下不同耳石的标记效果，发现微耳石是检测荧光标记最适宜的耳石类型，且在蓝色荧光下观察效果最佳。邱晨等(2018)对鲤仔鱼的浸泡时间选为48 h，在本研究中对浸泡时长进行了优化，选择24 h作为草鱼仔鱼的浸泡时长，以期能在较短时间下获得理想的荧光标记效果，减少荧光物质浸泡对鱼苗的伤害，节约成本。同时，在经过长达60 d的恢复养殖后，仍能取得不错的荧光标记效果。荧光标记一般用来标记仔鱼(Yang et al, 2016)，考虑到鱼体生理胁迫的耐受力及鱼体发育的差异性，不同种类、不同规格鱼体的最佳浸泡浓度和浸泡时间也不一样，而浸泡浓度的多少和浸泡时间的长短对标记效果有着决定性的作用(王正鲲等, 2015; 何春林等, 2008; 赵亚鹏等, 2013)。本研究中，由于草鱼仔鱼刚孵化时，星耳石尚未发育(曾祥波等, 2012)，即使发育之后星耳石的核心也十分模糊。标记初期如果正好在星耳石产生之时，则标记环相对模糊，但邱晨等(2018)研究表明，星耳石是鲤仔鱼荧光标记的最佳选择，从极个别草鱼仔鱼已经发育出来的星耳石上的标记环也可以看出，一旦星耳石发育形成，ALC标记同样对星耳石具有很好的适用性，能够在其上形成标记环。如果使用星耳石来观察荧光标记，研究星耳石从何时开始生长且到何时开始长出清晰且有规律的生长是重要环节。在进行荧光标记实验的过程中，不仅仅是区分到仔稚鱼，根据耳石形成的特点具体到某日龄的鱼进行标记能够得到更好的效果。因此，在下一步工作中，作者将进行不同日龄的草鱼在不同浓度茜素络合物和不同浸泡时间下的比较研究，以便确定最适的浸泡规格、浸泡时间及浸泡浓度，同时，标记之后将进行更长期的养殖观察以确定其持久性。

4 结论

本研究首次通过100 mg/L的茜素络合物对草鱼仔鱼进行1 d浸泡实验，获得了理想的标记结果。在可见光、蓝色激发光和绿色激发光下，在3种耳石上均能观察到明显的标记环，其中，微耳石的标记效果最好，矢耳石次之；蓝色激发光的检测效果最佳，绿色激发光次之；在可见光下，耳石日轮数目的观察清晰度最高。鱼体浸泡开始和结束的时间与荧光标记环出现和消失的时间均存在约12 h的时间差，同时，在长达60 d恢复养殖的情况下，仍然能在耳石上检测到明显的标记环。相关结果能够对今后草鱼仔鱼的增殖放流工作效果的有效评估提供理论参考、技术支撑以及条件优化的思路。