维生素B₆是一种水溶性维生素，以吡哆醇、吡哆醛和吡多胺3种形式存在(Halsted, 2003)。维生素B₆与生物体内营养物质的代谢密切相关。首先，维生素B₆作为生物体内转氨酶和脱羧酶的辅酶，参与催化氨基酸转氨、脱羧、消旋、脱硫和裂解等反应，在氨基酸代谢中起重要作用(Shiau et al, 2003)；其次，作为糖原磷酸化酶的辅酶参与碳水化合物代谢，为糖异生提供碳架，维持血糖浓度；同时，其与必需脂肪酸的代谢、mRNA的合成，糖皮质激素及白蛋白的基因表达有关(Zehra et al, 2018 ; (Natori et al, 1997)；此外，它还参与神经物质如γ-氨基丁酸(GABA)、多巴胺、组胺、5-羟色胺(5-HT)等的生物合成，从而影响神经系统的发育和功能(Huang et al, 2005;Akhtar et al, 2010 )。水产动物缺乏维生素B₆会产生相应的缺乏症，但维生素B₆过量并不会对水产动物产生明显的毒副作用。通过生长指标、肝脏维生素B₆的含量、转氨酶活性等评价指标，确定了水产动物维生素B₆的需求量约为1~12 mg/kg(He et al, 2009; Zehra et al, 2018; Hosokawa et al, 1992)，其中，斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)维生素B₆需求量为1.75~2.22 mg/kg(Huang et al, 2005)，缺乏时表现为厌食，生长不良，惊厥，螺旋状游泳等；大菱鲆(Scophthalmus maximus)维生素B₆需求量为1~2.5 mg/kg(Adron et al, 1978)，缺乏时表现为生长不良，厌食，运动失调，水肿，神经紊乱等；金头鲷(Spatrus aurata)维生素B₆需求量为1.97 mg/kg (Kissil et al, 1981)，缺乏时表现为生长迟缓，死亡率高，游泳行为不稳定和周围神经退行性改变等。

许氏平鲉(Sebastes schlegeli)，隶属于鲉形目(Scorpaeniformes)、鲉科(Scorpaenidae)、平鲉属(Sebastes)，又称黑鲪、黑头等，是一种冷温性卵胎生的鱼类，分布于我国黄海、渤海和东海，国外分布于朝鲜、日本和鄂霍次克海南部(刘蝉馨, 1988; 朱龙等, 1999)。许氏平鲉肉质鲜美，在沿海有黑石斑的美誉，是人工鱼礁资源增殖和网箱养殖的理想种类(冒树泉等, 2014)。目前，关于许氏平鲉营养需求研究主要涉及蛋白质、脂肪、糖类、矿物质及饲料添加剂等方面(Lee et al ,2002、2009; Cho et al, 2015; Katya et al, 2017)，维生素营养需求的报道仅见维生素C (Lee et al ,1998)和维生素E (Bai et al, 1998)，B族维生素研究方面尚处于空白。本研究通过在饲料中添加不同梯度的维生素B₆，研究其对生长、肝脏酶活和转氨酶基因表达等指标的影响，确定许氏平鲉幼鱼对维生素B₆的最适需求量，为其配合饲料的开发提供参考。

以鱼粉、酪蛋白为主要蛋白源，鱼油为主要脂肪源，设计粗蛋白约为49.56%、粗脂肪约为9.12%的基础饲料配方。在基础饲料中分别添加0、1、2、4、8和32 mg/kg的盐酸吡哆醇(纯度为98.6%，购自上海麦克林生化科技有限公司)，配制维生素B₆实际含量为2.08、3.25、4.16、6.32、10.17和31.14 mg/kg 6组等氮等能的实验饲料，命名为D1、D2、D3、D4、D5和D6组，其中，D1为对照组。表 1为实验饲料的配方及营养组成。

表 1(Tab.1)

表 1 饲料配方及营养组成(%干物质) Tab.1 Formulation and nutrient composition of the experimental diets(% dry matter) 项目 Items 组别 Groups D1 D2 D3 D4 D5 D6   原料Ingredients     鱼粉Fish meal 45.00 45.00 45.00 45.00 45.00 45.00     酪蛋白Casein 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00     α-淀粉α-starch 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00     鱼油Fish oil 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00     大豆卵磷脂Soybean lecithin 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00     维生素预混料Mineral premixa 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50     矿物质预混料Vitamin premixb 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50     甜菜碱Betaine 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50     抗氧化剂Antioxidant 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10     磷酸二氢钙Ca(H2PO4)2 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50     氯化胆碱Choline chloride 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50     羧甲基纤维素钠CMC 3.40 3.40 3.40 3.40 3.40 3.40     盐酸吡哆醇Pyridoxine Hydrochloride (mg/kg) 0 1.00 2.00 4.00 8.00 32.00   营养组成(%干物质)Nutrient composition (% dry matter)     粗蛋白Crude protein 49.73 49.79 49.55 49.41 49.71 49.18     粗脂肪Crude lipid 8.93 8.99 9.37 9.17 9.23 9.00     粗灰分Crude ash 12.09 11.78 12.01 11.79 11.83 12.07     能量Energy (KJ/g) 20.77 20.81 20.81 20.77 20.81 20.72     维生素B6 Vitamin B6 (mg/kg) 2.08 3.25 4.16 6.32 10.17 31.14    注：a:维生素预混料(g/kg饲料)：维生素C 121.2 g; 维生素E 18.8 g; 维生素B1 2.7 g; 维生素B2 9.1 g; 烟酸27.8 g; 泛酸钙12.7 g; 肌醇181.8 g; 生物素0.27 g; 叶酸0.68 g; 维生素K 1.8 g; 维生素A 0.73 g; 维生素D 0.003 g; 维生素B12 0.003 g    b:矿物质预混料(g/kg饲料)：硫酸镁80 g; 磷酸二氢钠370 g; 氯化钾130 g; 柠檬酸铁40 g; 硫酸锌20 g; 氯化亚铜0.2 g; 氯化铝0.15 g; 碘化钾0.15 g; 亚硒酸钠0.01 g; 蛋氨酸锰2.0 g; 氯化钴1.0 g    Note: a: vitamin premix (g/kg diet): vitamin C 121.2 g; vitamin E 18.8 g; vitamin B1 2.7 g; vitamin B2 9.1 g; niacin 27.8 g; calcium pantothenate 12.7 g; inositol 181.8 g; biotin 0.27 g; folic acid 0.68 g; vitamin K 1.8 g; vitamin A 0.73 g; vitamin D 0.003 g; vitamin B12 0.003 g    b: Mineral premix (g/kg diet): magnesium sulfate 80 g; sodium dihydrogen phosphate 370.0 g; potassium chloride 130 g; ferric citrate 40 g; zinc sulfate 20.0 g; cuprous chloride 0.2 g; aluminum chloride 0.15 g; potassium iodide 0.15 g; sodium selenite 0.01 g; manganese methionine 2.0 g; cobalt chloride 1.0 g

表 1 饲料配方及营养组成(%干物质) Tab.1 Formulation and nutrient composition of the experimental diets(% dry matter)

各原料经粉碎过80目标准筛，按配比称重后，逐级扩大法混合均匀，添加鱼油和适宜的蒸馏水，再次混合混匀，用小型饲料挤压机制成粒径为2和4 mm的颗粒饲料，60℃烘干，用塑料袋密封后于–20℃冰箱保存备用。

实验所用许氏平鲉幼鱼购自山东日照传真养殖场，养殖实验在山东日照片联绿色养殖示范基地的水泥养殖池内挂网箱(60 cm×60 cm×50 cm)中进行。正式实验前采用对照组饲料驯化，14 d后挑选体质健壮、大小均一、初始体重为(36.35±0.06) g的实验鱼540尾。实验随机分为6个组，每组3个重复，每个网箱30尾鱼，共18个网箱。养殖期间持续充气，养殖用水为深井海水，采用流水养殖。水温为16℃~18℃，溶解氧(DO) > 5.0 mg/L，pH为7.0左右，氨氮和亚硝态氮 < 0.05 mg/L。每天08:00和16:00投喂2次，初始投喂量为鱼体重的1%，并按其摄食情况调整，每日记录死鱼数量和重量。实验进行63 d。

养殖实验结束后，禁食24 h，记录每个网箱鱼的数量并称重，每个网箱随机取4尾鱼，用于鱼体常规成分测定，另取8尾鱼测量体重及体长后，尾静脉取血，解剖分离内脏，分别称量内脏团、肝胰脏、肠道的重量。全鱼、背肌、肝脏样品置于–80℃条件下保存，待测。每桶中随机取2尾鱼，无菌环境下解剖，取肝尖置于无RNase离心管中并迅速置于液氮中速冻，后于–80℃超低温冰箱中保存，用于组织中相关基因表达量的分析。

实验饲料及样品中水分采用105℃恒重法测定(GB/T6435-2014)，粗蛋白采用凯氏定氮法测定(GB/T6432-2018)，粗脂肪采用索氏抽提法测定(GB/ T6433-2006)，粗灰分采用550℃失重法测定(GB/T 6438-2007)，能量采用燃烧法测定(IKA, C6000, 德国)。

肝脏中维生素B₆的含量采用上海酶联生物科技有限公司试剂盒测定。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、谷草转氨酶(Glutamic oxalacetic transaminase, GOT)和谷丙转氨酶(Glutamic-pyruvic transaminase, GPT)均采用南京建成生物工程的试剂盒进行测定，肝脏组织蛋白含量采用考马斯亮兰法测定，酶活力单位定义参照试剂盒说明书。

使用Trizol法提取总RNA，提取完成后使用核酸蛋白仪(Nanoprop 2000，美国)检验RNA的浓度，并使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。采用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒(Takara，日本)去除基因组DNA并反转录成cDNA后于–80℃保存待用。根据本实验室所得的许氏平鲉转录组数据，找到谷草转氨酶(GOT1和GOT2)、谷丙转氨酶(GPT1和GPT2)、酪氨酸转氨酶(TAT)、丝氨酸转氨酶(SerC)的基因序列，NCBI Nucleotide BLAST进行同源性比对分析，确定同源性较高的基因序列，利用Primer 5.0软件设计引物，选用核糖体蛋白L17(RPL17)作为内参基因(Ma et al, 2013)，引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如表 2所示。实时荧光定量PCR试剂盒为TaKaRa的TB Green^TMPremix Ex Taq^TMII (TliRNaseH Plus)。PCR程序：95℃预变性30 s，1个循环；95℃变性5 s，相应基因退火温度下退火30 s，72℃延伸60 s，共40个循环后增长至95℃。通过荧光定量PCR仪得出目的基因及内参基因的Ct值，按照2^–∆∆Ct计算目的基因的相对表达量。本研究中，RPL17、GOT1、GOT2、GPT1、GPT2、TAT和SerC的扩增效率分别为0.992、0.962、0.979、0.965、0.989、1.055和1.027。

表 2(Tab.2)

表 2 基因表达的引物序列 Tab.2 Primer sequences for gene expression 引物名称 Primers 核苷酸序列(5’~3’) Sequence(5’~3’) RPL17 Forward: AGGCGACGCACCTACCG Reverse: CCTCTGGTTTGGGGACGA GOT1 Forward: GCGTTGTTGCCATAACTCTT Reverse: CTGCTCTGTGATGTGGTCCC GOT2 Forward: TGTAACGACGCAGAGGAGGCA Reverse: TTGGTGGGTTGGAGTAAATGG GPT1 Forward: CTGGTGTCGGTGCGTCTGT Reverse: CTGCCGCCTTTGCCTTGT GPT2 Forward: TGGACAGGCTCTAATGGACC Reverse: TTTTCAGGGATGCTTATGCG TAT Forward: GGCTGGATGATGCGTGGACAAC Reverse: CACTGCTTGCCCTCGCTGAC SerC Forward: TTGCTGCCTTTGCCGACCAC Reverse: GACAGTTCAGCGGCGTTCCTC

表 2 基因表达的引物序列 Tab.2 Primer sequences for gene expression

增重率(Weight gain rate, WGR, %)=(鱼体末重–鱼体初重)/鱼体初重×100；

特定生长率(Specific growth rate, SGR, %/d) =(ln鱼体末重–ln鱼体初重)/养殖周期×100；

摄食率(Feed intake, FI, %/d)=摄食饲料量/[(鱼体初重+鱼体末重)/2×养殖天数] ×100；

饲料系数(Feed conversion ratio, FCR)=摄食饲料量/(鱼体末重–鱼体初重)；

蛋白质效率(Protein efficiency ratio, PER, %)=(鱼体末重–鱼体初重)/(摄食饲料量×饲料中粗蛋白的含量)×100；

脏体比(Viscerosomtic index, VSI, %)=内脏团重/鱼体末重×100；

肝体比(Hepatosomatic index, HSI, %)=肝脏重/鱼体末重×100；

肠体比(Intestine-somatic index, ISI, %)=肠道重/鱼体末重×100；

肥满度(Condition factor, CF)=鱼体末重/体长³× 100；

存活率(Survival rate, SR, %)=终末鱼尾数/初始鱼尾数×100。

数据统计使用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。每组数据采用平均值±标准误(Mean±SE)表示，差异显著(P < 0.05)时用Duncan’s检验进行多重比较分析。采用折线模型拟合数据，确定许氏平鲉维生素B₆的最适需求量。

由表 3可知，随着维生素B₆含量的升高，实验鱼增重率和特定生长率呈先上升后下降的趋势，D3组显著高于对照组(P < 0.05)。D2~D6组的摄食率无显著差异(P > 0.05)，均显著高于对照组(P < 0.05)。D3组饲料系数最低，D3~D6组显著低于对照组(P < 0.05)。蛋白质效率呈现先上升后下降的趋势，D3组最高。D3组的脏体比显著高于对照组(P < 0.05)；D2~D5组的肝体比显著高于对照组(P < 0.05)；D2~D6组的肠体比显著高于对照组(P < 0.05)，呈先升后降的趋势，在D3组达到最高值；各组间的肥满度和存活率无显著差异(P > 0.05)。

表 3(Tab.3)

表 3 饲料中维生素B6对许氏平鲉幼鱼生长和形体指标的影响 Tab.3 Effects of dietary vitamin B6 on growth performance and body indices of juvenile S. schlegeli 生长性能Growth performances 组别 Groups D1 D2 D3 D4 D5 D6 初始体质量 IBW (g) 36.36±0.04 36.31±0.03 36.41±0.08 36.33±0.04 36.34±0.06 36.34±0.01 终末体质量) FBW (g) 67.46±0.40a 75.25±0.33b 78.57±0.94c 76.78±1.85bc 74.99±0.18b 74.97±0.90b 增重率 WGR (%) 85.57±1.27a 107.24±0.75b 115.78±2.25c 111.32±4.93bc 106.33±0.51b 105.02±2.68b 特定生长率 SGR (%/d) 1.00±0.01a 1.18±0.01b 1.24±0.02c 1.21±0.04bc 1.17±0.01b 1.16±0.02b 摄食率 FI (%/d) 1.05±0.02a 1.19±0.01b 1.21±0.01b 1.21±0.03b 1.19±0.00b 1.18±0.00b 饲料系数 FCR 1.14±0.03c 1.10±0.03bc 1.02±0.01a 1.07±0.03ab 1.07±0.01ab 1.07±0.01ab 蛋白质效率 PER (%) 1.77±0.04a 1.83±0.05ab 1.98±0.02c 1.88±0.04bc 1.89±0.01bc 1.88±0.01bc 脏体比 VSI (%) 9.03±0.08a 9.27±0.10ab 9.35±0.11b 9.32±0.05ab 9.24±0.12ab 9.27±0.08ab 肝体比 HSI (%) 2.30±0.03a 2.47±0.01b 2.49±0.06b 2.46±0.02b 2.46±0.05b 2.42±0.07ab 肠体比 ISI (%) 1.57±0.02a 1.64±0.04b 1.76±0.01d 1.72±0.01cd 1.69±0.01bc 1.68±0.01bc 肥满度 CF 2.75±0.02 2.73±0.02 2.72±0.01 2.74±0.01 2.72±0.01 2.76±0.02 存活率 SR (%) 95.56±2.94 96.67±1.93 98.89±1.11 96..67±0.00 100±0.00 97.78±1.11    注：同一行的不同上标字母代表差异显著(P < 0.05)，下同    Note: Values within the same row with different letters are significantly different (P < 0.05)，the same as below

表 3 饲料中维生素B6对许氏平鲉幼鱼生长和形体指标的影响 Tab.3 Effects of dietary vitamin B6 on growth performance and body indices of juvenile S. schlegeli

以增重率为评价指标，经折线模型拟合后得许氏平鲉幼鱼对饲料维生素B₆的需求量为3.53 mg/kg(图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 许氏平鲉幼鱼增重率与饲料中维生素B6含量的折线回归关系 Fig.1 The broken-line regression analysis based on weight gain rate and dietary vitamin B6 of juvenileS. schlegeli

由表 4可知，维生素B₆含量对许氏平鲉幼鱼全鱼水分和粗灰分含量无显著影响(P > 0.05)，全鱼粗蛋白呈先上升后下降的趋势，D3~D6组的全鱼粗蛋白显著高于对照组(P < 0.05)，且在D4组达到最高值；全鱼粗脂肪呈先上升后下降的趋势，对照组有最低值，D5组有最高值，D3~D6组之间无显著差异(P > 0.05)。

表 4(Tab.4)

表 4 饲料中维生素B6对许氏平鲉幼鱼鱼体常规成分的影响(%湿重) Tab.4 Effects of dietary vitamin B6 on proximate composition of juvenile S. schlegeli (% wet weight) 体组成Body composition 组别 Groups D1 D2 D3 D4 D5 D6 全鱼 Whole body 水分 Moisture 72.27±0.22 70.04±1.52 70.42±0.06 70.01±0.47 70.39±0.79 70.99±0.65 粗蛋白 Crude protein 15.91±0.08a 16.14±0.20ab 16.50±0.08bc 16.74±0.15c 16.45±0.01bc 16.36±0.03b 粗脂肪 Crude lipid 6.31±0.03a 7.07±0.14b 8.17±0.07c 8.23±0.03c 8.31±0.10c 8.16±0.25c 粗灰分 Crude ash 4.61±0.02 4.58±0.05 4.44±0.03 4.49±0.08 4.53±0.03 4.58±0.08 肌肉 Muscle 水分 Moisture 76.68±0.39b 74.76±0.08a 75.08±0.35a 74.84±0.13a 74.83±0.15a 75.17±0.39a 粗蛋白 Crude protein 19.89±0.08a 20.30±0.06b 20.96±0.03c 20.68±0.03c 20.68±0.05c 20.68±0.18c 粗脂肪 Crude lipid 2.79±0.03a 3.54±0.05bc 3.57±0.05bc 3.67±0.06c 3.38±0.13b 3.4±0.11b 粗灰分 Crude ash 1.31±0.01 1.29±0.01 1.30±0.01 1.29±0.01 1.31±0.02 1.31±0.01

表 4 饲料中维生素B6对许氏平鲉幼鱼鱼体常规成分的影响(%湿重) Tab.4 Effects of dietary vitamin B6 on proximate composition of juvenile S. schlegeli (% wet weight)

许氏平鲉幼鱼D3~D6组肌肉水分含量显著低于对照组(P < 0.05)；肌肉粗蛋白随着维生素B₆含量的增加呈先上升后下降的趋势，对照组含量最低，D3~D6组无显著差异(P > 0.05)；对照组肌肉粗脂肪呈先上升后下降的趋势，D4组最高；肌肉粗灰分含量无显著变化(P > 0.05)。

由表 5可知，随着维生素B₆含量的增加，肝脏超氧化物歧化酶活力呈先上升后下降的趋势，D3~D5组显著高于对照组(P < 0.05)，D3组最高。丙二醛含量呈现先下降后上升的趋势，D2~D6组显著低于对照组(P < 0.05)，D3组最低。D2~D6组的肝脏谷草转氨酶活力显著高于对照组(P < 0.05)，D4~D6组之间无显著差异(P > 0.05)。肝脏谷丙转氨酶活力呈先上升后下降的趋势，D3~D6组显著高于对照组(P < 0.05)。肝脏维生素B₆含量随着饲料维生素B₆含量的增加，呈先升高后平稳的趋势，D2~D6组显著高于对照组(P < 0.05)，D3~D6组间无显著差异(P > 0.05)。

表 5(Tab.5)

表 5 饲料中维生素B6对许氏平鲉幼鱼肝脏酶活及维生素B6含量的影响 Tab.5 Effects of dietary vitamin B6 on liver enzyme activities and vitamin B6 content of juvenile S. schlegeli 肝脏酶活力 Liver enzyme activities 组别 Groups D1 D2 D3 D4 D5 D6 超氧化物歧化酶SOD(U/mg prot) 1382.95±24.77a 1494.70±16.83ab 1659.47±28.28c 1536.36±20.49b 1529.73±55.12b 1502.27±64.03ab 丙二醛MDA(nmol/mg prot) 0.92±0.01c 0.74±0.02b 0.54±0.03a 0.68±0.03b 0.68±0.02b 0.72±0.01b 谷草转氨酶GOT (U/g prot) 18.67±2.35a 29.61±1.88b 32.82±1.82bc 40.72±4.56cd 40.42±2.30cd 48.56±3.22d 谷丙转氨酶GPT (U/g prot) 111.05±2.62a 115.43±5.24a 139.42±7.14b 172.42±10.91c 165.16±3.92c 160.11±8.67bc 维生素B6含量 Vitamin B6 content (μg/g) 5.28±0.13a 6.13±0.40b 7.17±0.14c 7.77±0.19c 7.83±0.10c 7.63±0.28c

表 5 饲料中维生素B6对许氏平鲉幼鱼肝脏酶活及维生素B6含量的影响 Tab.5 Effects of dietary vitamin B6 on liver enzyme activities and vitamin B6 content of juvenile S. schlegeli

以肝脏维生素B₆含量为评价指标，经折线模型拟合后得许氏平鲉幼鱼对饲料维生素B₆的需求量为4.96 mg/kg(图 2)；以肝脏谷丙转氨酶活力为评价指标，经折线模型拟合后得许氏平鲉对饲料维生素B₆的需求量为6.32 mg/kg(图 3)。

图 1(Fig. 1)

图 2 许氏平鲉幼鱼肝脏维生素B6含量与饲料中维生素B6含量的折线回归关系 Fig.2 The broken-line regression analysis based on liver vitamin B6 content and dietary vitamin B6 content of juvenile S. schlegeli

图 1(Fig. 1)

图 3 许氏平鲉幼鱼肝脏谷丙转氨酶活性与饲料中维生素B6含量的折线回归关系 Fig.3 The broken-line regression analysis based on liver glutamic-pyruvic transaminase and dietary vitamin B6 content of juvenile S. schlegeli

随着维生素B₆含量的增加，谷草转氨酶1(GOT1)基因相对表达量呈先上升后下降的趋势，D4组显著高于对照组(P < 0.05)，D3~D6组之间无显著差异(P > 0.05)(图 4)；D2~D6组谷草转氨酶2(GOT2)基因相对表达量显著高于对照组(P > 0.05)，D3组为最大值，D4~D6组间差异不显著(P > 0.05)(图 5)；谷丙转氨酶1(GPT1)和谷丙转氨酶2(GPT2)基因相对表达量呈先上升后下降的趋势，均在D4组有最大值，且显著高于对照组和D2组(P < 0.05)，D3~D6组差异不显著(P > 0.05)(图 6和图 7)；酪氨酸转氨酶(TAT)呈先上升后下降的趋势，D4组有最大值，D3~D5组显著高于其他组(P < 0.05)(图 8)；丝氨酸转氨酶(SerC)呈下降趋势，D3~D6组显著低于对照组和D2组(P < 0.05)，D6组为最低值(图 9)。

图 1(Fig. 1)

图 4 肝脏谷草转氨酶1(GOT1)基因相对表达量 Fig.4 The relative expression level of the glutamic oxalacetic transaminase1(GOT1) mRNA in liver 不同小写字母代表组间差异显著(P < 0.05)，下同 Columns with different letters indicate significantly different between groups (P < 0.05), the same as the following

图 1(Fig. 1)

图 5 肝脏谷草转氨酶2 (GOT2)基因相对表达量 Fig.5 The relative expression level of the glutamic oxalacetic transaminase2(GOT2) mRNA in liver

图 1(Fig. 1)

图 6 肝脏谷丙转氨酶1(GPT1)基因相对表达量 Fig.6 The relative expression level of the glutamic-pyruvic transaminase 1(GPT1) mRNA in liver

图 1(Fig. 1)

图 7 肝脏谷丙转氨酶2(GPT2)基因相对表达量 Fig.7 The relative expression level of the glutamic-pyruvic transaminase 2(GPT2) mRNA in liver

图 1(Fig. 1)

图 8 肝脏酪氨酸转氨酶(TAT)基因相对表达量 Fig.8 The relative expression level of the tyrosine aminotransferase (TAT) mRNA in liver

图 1(Fig. 1)

图 9 肝脏丝氨酸转氨酶(SerC)基因相对表达量 Fig.9 The relative expression level of the serine aminotransferase (SerC) mRNA in liver

实验结束后，对照组的增重率和特定生长率均显著低于其他组，且随着维生素B₆含量的增加呈先上升后下降的趋势，说明维生素B₆是维持许氏平鲉正常生长发育所必需的营养物质。维生素B₆在多种代谢过程中起作用，它的缺乏可导致细胞蛋白质合成和转化反应的错位，在饲料中添加适量的维生素B₆会提高蛋白质的利用率(Baker et al, 1995)。本研究中，添加维生素B₆组的蛋白质效率显著高于对照组，饲料系数呈先降后升的趋势，饲料利用率有所提高。水产动物缺乏维生素B₆会出现相应的症状，如黄尾(Seriolalalandi)出现厌食，生长不良，贫血，神经紊乱和高死亡率的缺乏症(Hosokawa et al, 1992)；条石鲷(Oplegnathus fasciatus)的缺乏症是生长缓慢，厌食，神经失调，游泳异常，高死亡率和贫血(Ishibashi et al, 2002)。实验中对照组未出现常见的维生素B₆缺乏症，有可能因为实验开始前，许氏平鲉幼鱼体内积累了一部分维生素B₆；养殖实验在水泥池挂网箱中进行，水体中也有部分维生素B₆的存在，而不能及时排出；摄食饲料中也添加了鱼粉(含有一些维生素B₆)，因此，对照组缺乏症不明显，只出现了摄食不积极的症状，但存活率较其他组无显著差异，说明2.08 mg/kg的维生素B₆可以防止许氏平鲉幼鱼出现严重的缺乏症。

本实验以增重率、肝脏维生素B₆含量和谷丙转氨酶为评价指标，得出许氏平鲉幼鱼维生素B₆的需求量为3.53~6.32 mg/kg，与印度鲶(Heteropneustes fossilis) 3.21 mg/kg(Mohamed, 2001)、红罗非鱼(Oreochromis mossambicus × O. niloticus) 3 mg/kg(Lim et al, 1995)、大黄鱼(Pseudosciaena crocea) 4.49~4.61 mg/kg(张春晓, 2006)、鲈鱼(Lateolabrax japonicus) 4.38~4.53 mg/kg (张春晓, 2006)、团头鲂(Megalobrama amblycephala) 4.17~ 5.02 mg/kg (王莹等, 2013)的需求量类似；高于大菱鲆1~2.5 mg/kg(Adron et al, 1978)、斜带石斑鱼1.75~2.22 mg/kg(Huang et al, 2005)的需求量；低于翠鳢(Channa punctatus) 7.6~10.4 mg/kg(Zehra et al, 2018)、黄尾2.2~11.7 mg/kg(Hosokawa et al, 1992)、吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus) 9.22~10.11 mg/kg (吴凡等, 2018)的需求量。不同实验鱼有不同需求量，原因可能与实验鱼的种类、大小、实验环境、实验饲料、饲喂频率和方式、实验方法和评估标准的有关。

鱼体营养状态可以通过形体指标来反映，如脏体比、肝体比和肠体比。研究表明，未添加维生素B₆时，吉富罗非鱼和异育银鲫(Carassius auratas gibelio)肝体比显著低于其他组(吴凡等, 2018; 王锦林等, 2011)；大西洋鲑(Salmo salar)10 mg/kg组的肝体比显著高于其他组(Albrektsen et al, 1994)；建鲤(Cyprinus carpio)对照组的肠体比为最低值(He et al, 2009)，本实验的脏体比、肝体比和肠体比均呈先上升后下降的趋势，对照组最低，说明维生素B₆不足可能会影响许氏平鲉幼鱼的器官发育能力。

随维生素B₆的增加，许氏平鲉幼鱼全鱼粗蛋白、全鱼和肌肉的粗脂肪呈先上升后下降的趋势，肌肉粗蛋白含量先上升后趋于平稳，对照组肌肉水分显著低于其他各组，这与吉富罗非鱼(吴凡等, 2018)、异育银鲫(王锦林等, 2011)的研究结果类似。维生素B₆以5’-磷酸吡哆醛的形式作为转氨酶的辅酶，参与氨基酸分解代谢的第一步去除α-氨基，使氨基酸转化为相应的酮酸。维生素B₆含量的增加会提高鱼体蛋白利用率，增加机体蛋白的含量，促进蛋白的合成(Baker et al, 1995; Giri et al, 1997)；因此，全鱼和肌肉的粗蛋白含量会随维生素B₆含量的增加而有所提高。此外，维生素B₆在乙酰辅酶A和脂肪酸利用等方面的脂质代谢中起重要作用。在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)中发现添加维生素B₆可以调节和平衡多不饱和脂肪酸的代谢，有助于脂蛋白酯酶等的合成与释放，促进了脂肪的运输和利用，避免了脂质的沉积(冯秀妮, 2005; 黄世蕉等, 1992)。本研究中，对照组全鱼和肌肉的粗脂肪含量显著低于其他各组，随着维生素B₆的增加，D5、D6组肌肉的粗脂肪和D6组全鱼的粗脂肪出现了下降，在印度鲮(Cirrhinus mrigala)的研究上也有类似结果(Zehra et al, 2017)。大西洋鲑未添加维生素B₆组的全鱼和肝脏脂质含量最低(Albrektsen et al, 1994)。以上结果说明，添加适量的维生素B₆，能促进机体蛋白质的合成和脂质代谢反应的正常进行。

维生素B₆在氨基酸代谢和含氮化合物的反应中充当氨基转移酶和脱羧酶的辅酶，参与非必需氨基酸的合成(Baker et al, 1995)。鱼类肝脏是维生素代谢和蓄积的重要器官，肠道吸收的水溶性维生素被运送到肝脏，以满足新陈代谢的需要，肝脏中维生素B₆的含量常作为特征性的评价指标(Zehra et al, 2017)。因此，测定肝脏中维生素B₆的含量能更好的确定维生素B₆的需求量。通过折线回归模型，以肝脏维生素B₆含量为评价指标，许氏平鲉幼鱼维生素B₆需求量为4.96 mg/kg。

维生素B₆具有间接的抗氧化作用，可以清除机体超氧化物自由基并进一步预防氧化应激，而缺乏维生素B₆会增加自由基的生成、降低抗氧化酶活性(Kumar et al, 2017)。抗氧化物酶作为鱼体抗氧化防御的重要组成部分，其中，SOD是一类抗氧化酶，从细胞环境中清除具有破坏性的活性氧(ROS)，具有清除体内自由基的能力，抑制超氧化物的生成，在机体的防御系统和免疫系统中发挥着重要的作用(胡凯, 2008; Cui et al, 2016)。MDA是脂质过氧化的终产物，含量可反映机体细胞受自由基攻击的严重程度(Mccord, 1969)。在斜带石斑鱼、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的研究中发现，维生素B₆缺乏组SOD活性显著降低(Huang et al, 2005; 黄晓玲, 2014)，与本实验结果相似，随着饲料维生素B₆含量的增加，SOD活性呈先上升后下降的趋势，MDA呈先下降后上升的趋势，均在D3组出现极值，这表明添加适当含量的维生素B₆可以提高机体的抗氧化能力。

维生素B₆以5’-磷酸吡哆醛的形式，作为转氨酶参与氨基酸代谢的标志性辅酶(Zehra et al, 2018)，肝脏作为氨基酸代谢的主要场所，肝脏的谷草转氨酶和谷丙转氨酶常被用作评价鱼体营养状况的敏感指标，其活力间接反映蛋白质合成效率，同时，也是反映肝功能是否正常的重要指标(陈壮等, 2014; 马俊等, 2016; Smith et al, 1974)。故测定肝脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活力可以更准确得出维生素B₆的需求量。本研究表明，对照组肝脏维生素B₆含量和转氨酶活力均显著低于其他组，随着维生素B₆含量的增加，肝脏维生素B₆含量呈先上升后平稳的趋势；谷草转氨酶呈上升的趋势，但在D3~D6组无显著差异；谷丙转氨酶呈先上升后下降的趋势。这与吉富罗非鱼、异育银鲫和印度鲶的研究结果类似(Mohamed, 2001; 吴凡等, 2018; 王锦林等, 2011)，说明添加维生素B₆可以提高转氨酶的活力，保证鱼体蛋白质代谢的正常进行。通过折线回归模型，以谷丙转氨酶为评价指标，许氏平鲉幼鱼维生素B₆需求量为6.32 mg/kg。

GOT在真核细胞中存在2种遗传上不同的同工酶，细胞质和线粒体蛋白分别由GOT1和GOT2基因编码(Jiang et al, 2015)；GPT基因也常分为2个亚型，即肝细胞质中的谷丙转氨酶1(GPT1)和位于肝线粒体中的谷丙转氨酶2(GPT2)(荆晓丽, 2010)。目前，在水产动物上尚无关于维生素B₆对转氨酶基因表达水平影响的报道，但研究发现，维生素B₆缺乏的大鼠(Rattus norvegicus)肝脏细胞质的谷草转氨酶mRNA水平比对照组高7倍，施用皮质醇可以诱导肝谷草转氨酶mRNA的表达，而给予维生素B₆会抑制由皮质醇诱导的谷草转氨酶的合成；缺乏维生素B₆会增强糖皮质激素受体的DNA结合活性，提高谷草转氨酶的基因表达(Kondo et al, 1985;Oka et al, 1995)。研究表明，维生素B₆缺乏不但降低了肝脏丙氨酸-乙醛酸转氨酶活性，而且还下调了肝细胞丙氨酸-乙醛酸转氨酶的基因表达(Nishijima et al, 2003)。给大鼠喂食缺乏维生素B₆的饲料后，丙氨酸-乙醛酸转氨酶1活性的降低比丙氨酸-乙醛酸转氨酶2活性(在14 d内降低33%相比86%)更快速和显著(Takada et al, 1984)。5’-磷酸吡哆醛(PLP)作为糖皮质激素受体的体内调节剂，PLP水平变化会影响糖皮质激素受体的DNA结合位点，并最终影响酪氨酸转氨酶(TAT)的活性(Disorbo et al, 1981)。丝氨酸转氨酶(SerC)参与氨基酸合成通路的表达，使谷氨酸转氨基生成3-磷酸丝氨酸，SerC基因作为调控和关键酶参与L-丝氨酸的合成(刘浩等, 2015)，维生素B₆作为所有转氨酶的辅酶，也会影响丝氨酸转氨酶基因的表达水平。

本研究中，随着饲料中维生素B₆含量的升高，GOT1的mRNA基因表达呈先上升后下降的趋势，对照组的基因表达量显著低于其他各组，D3~D6组间没有显著差异；GOT2的对照组基因表达水平最低，D3组高表达，以上结果表明，添加维生素B₆会提高谷草转氨酶的基因表达。GPT1和GPT2的mRNA基因表达水平呈相似的趋势，均是先升高后降低，且在D4组表达量最高，对照组表达量最低，由此可见，维生素B₆缺乏会降低谷丙转氨酶的基因表达，适宜的维生素B₆添加会使其高表达。同时，TAT的基因表达水平也是对照组最低，在D3~D5组表达量显著高于对照组、D2和D6组。SerC基因表达水平呈下降趋势，对照组和D2组表达量显著高于D3~D6组。本研究结果与以上结论有差异的原因可能是物种、实验条件和方法、实验形式等所致。

随着维生素B₆的添加，谷草转氨酶活力呈上升趋势，谷丙转氨酶活力先升后降，这与mRNA表达水平趋势类似，说明适宜含量的维生素B₆能促进谷草转氨酶和谷丙转氨酶基因的转录，提高谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活力，促进鱼体蛋白质合成效率和利用率，更好的调控许氏平鲉幼鱼的蛋白质代谢。此外，添加维生素B₆会上调酪氨酸转氨酶基因的表达量，下调丝氨酸转氨酶基因的表达量，具体作用机制需要进一步的实验来证实。

综上，维生素B₆是许氏平鲉幼鱼生长发育和维持正常生理功能的必需营养物质。适宜含量的维生素B₆可以提高许氏平鲉幼鱼抗氧化能力和代谢酶活性，提高谷草转氨酶、谷丙转氨酶和酪氨酸的基因表达水平，降低丝氨酸转氨酶的基因表达水平。以增重率、肝脏维生素B₆含量和谷丙转氨酶为评价指标，36 g的许氏平鲉幼鱼维生素B₆的需求量为3.53~6.32 mg/kg饲料。