紫菜(Pyropia)是倍受喜爱的食用藻类，具有很高的营养价值和经济价值，广泛栽培于中国、日本、韩国等国家，随着紫菜栽培面积的扩大及环境污染、种质退化、气候变暖等原因，紫菜病害发生越来越频繁，每年由于病害造成的损失超过10% (Im et al, 2019)。

目前，已报道的常见紫菜病害有赤腐病(red rot disease)、拟油壶菌病(Oplidiopsis disease)、绿斑病(green spot disease)、黄斑病(yellow spot disease)等(Taniguchi et al, 1970; Sekimoto et al, 2008; Lee et al, 2015; 李杰等, 2019)。紫菜拟油壶菌病是由拟油壶菌(Olpidiopsis sp.)侵染造成的一种卵菌性病害(Migita, 1969)，与赤腐病同为紫菜栽培期的主要病害。拟油壶菌为活体营养型专性细胞内寄生致病菌，目前，尚没有体外分离培养的方法(Sekimoto et al, 2008)，其鉴定和检测只能依靠高分辨率的油镜观察以及分子生物学手段。该病最早于1960年在日本报道(Arasaki, 1960)，由于被感染的紫菜细胞呈壶状而被称为壶状菌病(chytrid blight disease)；Sekimoto等(2008)根据对其18S rRNA和cox2基因的分析及形态学观察，将该病原正式命名为紫菜拟油壶菌(Olpidiopsis porphyrae)，属卵菌纲(Oomycetes)、拟油壶菌目(Olpidiopsidales)、拟油壶菌科(Olpidiopsidaceae)、拟油壶菌属(Olpidiopsis)。马家海(1992)通过显微观察首次发现了江苏省南部沿海栽培的条斑紫菜(P. yezoensis)存在壶状菌病，于2007年将该病更名为拟油壶菌病(Olpidiops-disease) (马家海等, 2007)。

江苏省是我国条斑紫菜栽培的主产区，产量占全国的97%以上。每年10月至翌年4月期间为条斑紫菜海上栽培阶段。2019年1月4日，据国家藻类体系南通综合试验站报告，江苏省盐城市大丰区沿岸某条斑紫菜栽培海区出现大面积病烂。本研究对大丰区病烂紫菜进行了调查和病原的鉴定分析，期望为紫菜流行病学研究和病害防控提供基础数据。

病烂的条斑紫菜样品取自江苏省盐城市大丰区海域半浮动筏式条斑紫菜栽培区(33.20°N, 120.47°E)，水温为(4.07±0.06)℃，海水盐度为29.64±0.06。用于人工感染实验的紫菜为中国海洋大学藻类遗传实验室提供的条斑紫菜RZ品系，在实验室的正常栽培条件：PES海水培养液(马家海, 1996)，温度为10℃，盐度为30，光照强度为62.5 μmol/(m²·s)，光周期为L∶D=12∶12，充气培养，每隔3 d更换1次PES海水培养液。

乘船至栽培海域调查病害的基本情况，现场咨询栽培面积和发病情况，观察病烂紫菜外观症状，采集多个区域不同网帘上的发病紫菜样品，分别置于无菌样品袋中并存放于低温保温箱，带回实验室进行后续研究。在实验室的无菌操作台内，用无菌海水冲洗紫菜样品3~5次，然后，用灭菌的毛笔去除表面杂质，再用无菌刀片切取面积约为1 cm²的条斑紫菜典型病烂部位，在显微镜下观察、记录病烂紫菜的组织病理变化。取部分病烂紫菜样品进行匀浆，将匀浆液涂布于PDA培养基(海博生物, 青岛)上，进行可培养微生物的分离，培养温度为25℃(邱丽萍, 2018)，每天观察培养基上是否有微生物生长，持续观察2周。

由于在PDA培养基上未分离到微生物，分别采用患病紫菜的完整叶片和匀浆液，在10℃和20℃条件下，使用500 mL的锥形瓶进行人工感染实验。每个锥形瓶中添加200 mL无菌PES海水，放入5片正常条斑紫菜叶状体(湿重约0.1 g)。感染实验分为共培养感染和匀浆感染。共培养感染：取3~5片病烂的紫菜叶片加入上述体系，对照组不添加病烂紫菜叶片。匀浆感染：将病烂紫菜用玻璃匀浆器研磨至无肉眼可见颗粒的匀浆液，取1 mL匀浆液加入上述体系，对照组不添加匀浆液。每个实验组设置3个平行，分别置于10℃和20℃的光照培养箱中培养，光照强度为62.5 μmol/(m²·s)，光周期为L∶D=12∶12，每天观察记录紫菜叶片的病理变化。

紫菜病烂多由腐霉(Pythium sp.)和拟油壶菌引起(Gachon et al, 2010; Im et al, 2019)。为确定本研究病原的种类，验证显微镜观察的结果，采用扩增紫菜腐霉cox1序列的特异引物cox1-pyth-F (5′-ATTAGAATG GAATTAGCACAAC-3′)和cox1-pyth-R (5′-CTTAAAC CWGGAGCTCTCAT-3′) (Lee et al, 2015)，扩增拟油壶菌cox1序列的特异引物cox1-olpi-F (5′-CGGAGCTTT TTCTGGTGT-3′)和cox1-olpi-R (5′-GCTCCGGCTAAA ACAGGTA-3′) (Kwak et al, 2017)进行PCR鉴定。现场采集和人工侵染的病烂紫菜样品用无菌海水冲洗3~5次，去除叶片表面杂质后，用真菌基因组DNA提取试剂盒(思科捷, 青岛)提取基因组DNA作为PCR扩增模板。25 μL PCR反应体系：2×ExTaq Mix (TaKaRa, 日本) 12.5 μL，正反向引物各1 μL (0.4 μmol/L)，提取的基因组模板1 μL，ddH₂O 9.5 μL，同时，设置1组以ddH₂O作为模板的阴性对照组。PCR反应程序：95℃预变性5 min；95℃变性30 s；55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35个循环；72℃保温10 min。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，目的片段使用胶回收试剂盒(OMEGA, 美国)进行回收和纯化，所得DNA用pCloneEZ-TA-AMP载体连接试剂盒(中美泰和, 北京)连接T载体后，转化到DH10β大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞中，将阳性克隆送青岛派森诺公司测序。所得序列在GenBank中进行BLAST同源性比对，采用Mega 5.0软件邻接法来构建系统发育进化树，模型选择为Kimura2- parameter，同时，通过自展法(bootstrap)进行各个分支的置信度检验，循环次数设置为1000次，其他参数设为默认。

发病区域位于江苏省盐城市大丰区某条斑紫菜栽培海区，海区面积约为1334 hm²，其中，条斑紫菜栽培面积约为334 hm²，出现病烂的海区面积约为134 hm²。发病初期，在局部区域的个别网帘出现病烂紫菜，之后病烂逐步向四周传播，在1周内致使约134 hm²的紫菜脱苗(图 1B)。发病紫菜长度约为3 cm，病程较轻的叶片边缘、基部和中部可见粉色的病斑，病程严重的叶片出现褪色甚至溃烂、脱落(图 1A)。在显微镜下观察发现，病灶部位的紫菜细胞内寄生1~ 4个不规则圆球形或椭圆形的原生质团，寄生菌体大小不一(长约为10~15 μm, 宽约为10~20 μm)，内有颗粒状和发亮的油滴状物质，寄主紫菜细胞被挤压变形，色素体被挤到细胞边缘，呈绿色突起状，部分紫菜细胞出现萎缩或藻红素解体(图 1C)。还可观察到，拟油壶菌孢子囊伸出典型的释放管结构和释放的游动孢子(图 1D、图 1E)，孢子囊呈球形，直径为3~ 12 μm，游动孢子为圆球状，直径约为2 μm，释放管径为2~3 μm，供游动孢子单行通过，与已报道的拟油壶菌孢子囊和游动孢子结构相同(Sekimoto et al, 2009; Klochkova et al, 2016; Kwak et al, 2017)。孢子释放完后留下孢子囊空壳，释放管长度约20 μm (图 1F)。另外，本研究观察发现，拟油壶菌可侵染紫菜的精子囊(图 1G)。上述特征与国内外报道的紫菜拟油壶菌病的病理变化特征一致(Ding et al, 2005; 马家海等, 2007; Sekimoto et al, 2009; 刘一萌等, 2012; Klochkova et al, 2016; Kwak et al, 2017)。

图 1(Fig. 1)

图 1 海区患病条斑紫菜的病理症状 Fig.1 Histopathology of natural fungal infection in cultured diseased P. yezoensis A：患病紫菜叶片；B：病害导致紫菜网帘几乎全部脱落；C：发病紫菜细胞萎缩(红色箭头)，内有明亮的油滴状物质(黑色箭头)，细胞内容物被挤压导致藻红素解体(黄色箭头)，细胞一端形成浓绿色突起(绿色箭头)，有些细胞内有多个菌体寄生(蓝色箭头)；D：释放管；E：孢子囊伸出释放管(黑色箭头)，游动孢子释放(红色箭头)；F：空的孢子囊伸出长而弯曲的释放管；G：精子囊细胞被感染(黑色箭头)，空的孢子囊(红色箭头) A: Diseased P. yezoensis blade; B: P. yezoensis fall off caused by disease; C: Diseased cells get smaller (red arrow), oil drop-like substances in the fungus (black arrow), the cell contents are squeezed and the phycoerythrobilin disintegrates (yellow arrow), one side of the cell with rich-green outgrowth (green arrow), several parasitic thalli in one cell (blue arrow); D: Liberation tube; E: Sporangium begins to push out the liberation tube (black arrow), zoospores are releasing (red arrow); F: Long and curved liberation tubes of the empty parasitic sporangium; G: Infected spermatangium cells (black arrows), and the empty sporangium (red arrow)

在10℃和20℃条件下，患病紫菜的叶片和匀浆液均可引起紫菜发病。在10℃条件下，3 d内可观察到紫菜叶片整体颜色变浅，边缘呈透明的浅绿色(图 2A)，5~6 d后，变成无色并溃烂脱落，病烂从叶片边缘逐渐往内部延伸发展，7 d内叶片全部溃烂。在20℃条件下，2 d内即可观察到在叶片近中部出现肉眼可见的病斑，病斑的中央为红色、边缘为绿色，逐步发展为无色并溃烂成孔洞(图 2B)，4 d内叶片全部溃烂。对照组紫菜叶片生长正常，均未出现发病情况(图 2C)，在显微镜下观察，未发现紫菜细胞有明显变化(图 2E)。2种温度条件下被感染紫菜的组织病理变化一致，在紫菜细胞中均发现拟油壶菌感染的典型特征：细胞内有溶出的藻红素、菌体内有大量的油滴状物质以及被拟油壶菌挤压到细胞边缘而呈绿色突起状的细胞质(图 2D)。

图 1(Fig. 1)

图 2 人工感染紫菜的病理观察 Fig.2 Histopathology of experimentally infected P. yezoensis A：10℃侵染3 d时的紫菜叶片；B：20℃侵染2 d时的紫菜叶片；C：对照组紫菜叶片；D：人工感染紫菜叶片，紫菜细胞萎缩(红色箭头)，菌体内有明亮的油滴状物质(黑色箭头)，细胞内藻红素溶出(黄色箭头)，细胞一端形成浓绿色突起(绿色箭头)，3个菌体寄生于同一细胞(蓝色箭头)；E：对照组紫菜细胞 A: Infected Pyropia blade in 10℃ at the third day; B: Infected Pyropia blade in 20℃ at the second day; C: Pyropia blades in negative control group; D: Experimental infection Pyropia blade, the Pyropia cells shrink (red arrow), oil drop-like substances in the fungus (black arrow), the phycoerythrobilin in the cell disintegrates (yellow arrow), one side of the cell product with rich-green outgrowth (green arrow), three parasitic thalli in one Pyropia cell (blue arrow); E: Pyropia cells in negative control group

以采集和人工感染的病烂紫菜的基因组DNA作为模板，分别用腐霉、拟油壶菌的cox1引物进行PCR扩增。结果显示，采集和人工感染的病烂紫菜均检测到拟油壶菌cox1序列的特异条带，未检测到腐霉的cox1序列条带。将扩增得到的DNA产物进行序列测定和BLAST同源性比对，结果显示，与紫菜拟油壶菌(O. pyropiae, O. porphyrae)的cox1基因序列相似度为100%。在系统发育进化树的分析上，现场采集(OlpBL20 1901)及人工感染(OlpRZ20 1901)的拟油壶菌序列与紫菜拟油壶菌聚为一支(图 3)。

图 1(Fig. 1)

图 3 基于cox1序列的系统发育进化树 Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on cox1 gene sequences

本研究对江苏省盐城市大丰区条斑紫菜栽培海区的病烂紫菜进行了调查和病原分析鉴定，综合发病紫菜的病理症状、人工感染实验、病原PCR鉴定的结果，确定了引起此次条斑紫菜大面积病烂的病原为紫菜拟油壶菌(Olpidiopsis sp.)。

本调查发现，病烂的条斑紫菜叶片长约为3 cm，为幼叶期紫菜，细胞生长和分裂速度快，且细胞壁薄，拟油壶菌更易穿过紫菜边缘未完全形成的细胞壁而寄生(Migita, 1969)。紫菜细胞壁是抵御病原的重要屏障，厚度与其应对卵菌侵染能力密切相关(Park et al, 2014)。因而，拟油壶菌病更易在紫菜的幼叶期或收割后发生(Migita, 1969; Klochkova et al, 2016)。在发病初期，有红色病斑出现在紫菜叶片的边缘、基部、中部，病斑处的紫菜细胞被圆形菌体感染，菌体内可见多个油滴状物质。随着病程的发展，病斑颜色变浅，从而导致整个叶片颜色变浅，最后溃烂溶解。拟油壶菌孢子囊呈球形，直径为3~12 μm，孢子囊的释放管径为2~3 μm；游动孢子从释放管逸出，全部释放完后留下孢子囊空壳，此时，释放管长度可达20 μm；游动孢子为圆球状，直径为2 μm左右。这些特征与紫菜拟油壶菌病感染症状一致(Ding et al, 2005; 马家海等, 2007; Sekimoto et al, 2009; 刘一萌等, 2012; Klochkova et al, 2016; Kwak et al, 2017)。拟油壶菌不仅能侵染紫菜叶状体营养细胞，还能寄生于生殖细胞和丝状体细胞。Arasaki (1960)通过显微镜观察发现，拟油壶菌可偶见于甘紫菜(P. tenera)果孢、未成熟的果孢子及丝状体中，但并不存在于精细胞中。刘一萌等(2012)研究发现，拟油壶菌亦可侵染坛紫菜(Porphyra haitanensis)的精细胞。本研究发现，拟油壶菌也可寄生于条斑紫菜的精细胞中，其可能通过精细胞与果孢的有性生殖进行传递，寄生于果孢子中，果孢子萌发后进而在丝状体中存活，使拟油壶菌能在夏季存活于海区，并在温度合适时释放游动孢子，成为紫菜栽培期的病原。因而，在育苗过程中，应对果孢子或自由丝状体进行镜检，避免拟油壶菌的引入。

拟油壶菌属种类繁多，形态特征相近，由于具有明显差异的形态特征较少，一般通过寄生的宿主以及分子生物学的方法进行分类。Dick(2001)根据拟油壶菌的寄生宿主将其划分为3个属：寄生陆生植物及淡水藻类的拟油壶菌属(Olpidiopsis sp.)、寄生海洋红藻的桥壶菌属(Pontisma sp.)及寄生海洋绿藻的离壶菌属(Sorplpidium sp.)。但其对拟油壶菌属的重新分类由于仅仅基于寄生宿主，而没有基于任何超微结构和分子数据而受到质疑(Sekimoto et al, 2008)。随着分子生物学技术的发展，越来越多适合卵菌分类的分子标记被报道，如18S rRNA、cox1和cox2等基因序列(Sekimoto et al, 2009; Klochkova et al, 2016; Kwak et al, 2017)，使紫菜卵菌病害的病原鉴定更加便利。本研究分析了采集和人工感染病烂紫菜疑似病原的cox1序列，结果显示，与紫菜拟油壶菌cox1序列相似性为100%，在系统发育上聚为一支。目前，已报道的有3种拟油壶菌可以感染紫菜的叶状体，分别为韩国鉴定的致病菌O. pyropiae (Klochkova et al, 2016)，日本鉴定的致病菌O. porphyrae (Sekimoto et al, 2008)及其变种O. porphyrae var. koreana (Kwak et al, 2017)；另有一种拟油壶菌O. bostrychiae可以感染紫菜丝状体(West et al, 2006)。Klochkova等(2016)通过分析日本致病菌和韩国致病菌的18S rRNA基因，发现韩国致病菌与日本致病菌相比缺少第1类内含子，因而将韩国致病菌鉴定为O. pyropiae。Kwak等(2017)研究发现，1株韩国致病菌的18S rRNA基因在第2和第3内含子之间插入了1个第5内含子，因此将此韩国致病菌鉴定为O. porphyrae的变种O. porphyrae var. koreanae。本研究尝试根据已有文献的引物扩增18S rRNA基因序列，进一步鉴定拟油壶菌的分类地位，但未能扩增出相应的条带，推测可能由于本次发病的拟油壶菌18S rRNA基因序列与以往的菌株存在部分差别，具体原因有待进一步验证。因此，不能判断本研究鉴定的病原菌属于O. porphyrae还是O. pyropiae，暂时鉴定为Oplidiopsis sp.。

由于拟油壶菌属于专性活细胞内寄生菌，尚无体外分离培养的方法(Sekimoto et al, 2008)。目前，实验室人工感染实验均以发病紫菜叶片作为感染源，通过发病紫菜叶片与健康紫菜共培养来实现(马家海等, 2007; Sekimoto et al, 2008、2009; Klochkova et al, 2016; Kwak et al, 2017)。本研究分别采用被感染的紫菜叶片及其匀浆液作为感染源进行人工感染实验，结果显示，二者均可使健康紫菜出现与海区病烂紫菜一致的症状和病理特征。马家海(1992)研究表明，拟油壶菌感染的最适水温为15℃~20℃，本研究结果也显示，在20℃条件下出现拟油壶菌病感染的症状早于10℃条件下。一般认为，拟油壶菌的游动孢子在10℃条件下的感染和寄生较慢，在5℃下不感染(马家海, 1992)。目前，尚未有10℃以下拟油壶菌感染紫菜的报道。本研究中的条斑紫菜拟油壶菌病发生于1月，海区水温约为4℃，推测可能由于紫菜栽培温度受光照、潮汐和干出等的影响，局部温度升高引起拟油壶菌感染和传播，也可能是引起此次发病的拟油壶菌与以往报道存在差别，在低温下仍具有很强的致病力，其原因和机制有待进一步深入研究。

综上所述，本研究鉴定了引起江苏省盐城市大丰区条斑紫菜病烂的拟油壶菌为Oplidiopsis sp.，可为我国栽培期紫菜的拟油壶菌病害防控提供有效参考。