2. 广西科学院广西红树林研究中心 广西红树林保护和利用重点实验室 广西 北海 536007;
3. 海南大学海洋学院 海南 海口 570228
2. Guangxi Mangrove Research Center, Guangxi Academy of Sciences, Beihai, Guangxi 536000, China;
3. College of Marine Science, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China
琼枝(Betaphycus gelatinae)隶属于红藻门(Rhodophyta)、真红藻纲(Florideae)、杉藻目(Gigartinales)、红翎菜科(Solieriaceae)、琼枝藻属(Betaphycus)，是中国南海特有的土著品种，是麒麟菜族(Eucheumatoidae)的重要栽培海藻之一，主要分布在热带和亚热带海区(邢诒炫等, 2019)。藻体多呈紫红色或黄绿色，由扁平分枝组成，分枝上有疣状突起(何培民等, 2018)。琼枝具有较高的经济价值，可以直接食用。李继伟等(2020)研究发现，琼枝是一种低脂肪、高纤维、不饱和脂肪酸和矿物元素丰富的天然保健食品，具有较高的营养保健价值。琼枝也是提取卡拉胶的重要原料之一，卡拉胶可用做胶凝剂、增稠剂、保鲜剂等，广泛应用于食品、医学科研和化学工业等领域(Hou et al, 2015; 邓春梅等, 2017)。琼枝可用作养殖生物的优质饵料，南方紫海胆(Anthocidaris crassispina)对其嗜食性较高(聂永康等, 2016)。此外，琼枝还可药用，有报道称琼枝富含的海藻多糖类活性物质具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗辐射以及降血脂等功效(Damonte et al, 2004; 于娟等, 2017; Chew et al, 2008)。
近年来，麒麟菜成为全球养殖产量第一的藻类，年产量高达1000万t以上(联合国粮食及农业组织, 2020)。而中国栽培的麒麟菜产量仍然较低，琼枝产量更是少之又少，涉及的因素主要是养殖模式落后、海域限制以及海洋环境的变化等(邢诒炫等, 2019)。多年以来，前人在琼枝养殖模式上进行了大量栽培实验，郑冠雄(2008)独创了采用水泥框网片养殖技术栽培琼枝。此外，还有鱼排浮筏式挂养技术以及西沙礁盘海区底播养殖技术等(杨湘勤等, 2015; 陈攀等, 2018)。尽管琼枝在养殖模式上取得了一定的成功，但依旧因产量低而难以满足市场需求。环境因子是藻类产量的决定因素之一，梁磊等(2014)和方哲等(2012a、b)研究发现，琼枝能够在实验室小水体环境中，在海水温度为21℃~36℃、光照强度为500~11000 lx、海水相对密度为1.014~1.030的条件下正常生长，环境因子超过或低于上述范围均不利于琼枝健康生长，为琼枝环境适应性研究提供了一定的理论基础。营养盐也是影响藻类生长的重要环境因子，葛红星等(2019)研究表明，在温度一定时，氮源对浒苔(Ulva prolifera)的生长速率有显著影响。韩婷婷等(2018)研究发现，不同氮源和氮浓度对半叶马尾藻(Sargassum hemiphyllum)幼苗的生长和部分生化组成有显著影响。黄中坚等(2014)研究发现，芋根江蓠(Gracilaria blodgettii)在适宜的营养盐条件下生长速率和生化组分表现较好。此外，营养盐含量的升高也是造成海水富营养化的原因，研究发现，极北海带(Laminaria hyperborea)在适宜温度对氮磷有显著的去除作用(袁艳敏等, 2020)，在日照海域养殖紫菜(Pyropia)有利于降低该海域的氮磷水平(梁洲瑞等, 2019)，琼枝也可有效去除富营养化海水中的氮磷，起到净化水质的作用(李春强等, 2015)。因此，研究琼枝生长的营养盐水平具有十分重要的现实意义。本研究通过模拟工厂化养殖模式，在大水体环境下设置不同的营养盐浓度培养琼枝，探究营养盐对琼枝的影响，不仅为琼枝规模化增殖栽培奠定基础，同时可为利用海藻进行生态环境治理提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验琼枝于2019年取自海南省海洋与渔业科学院琼海科研基地养殖池，养殖池长×宽×高为10.0 m× 1.0 m×1.5 m。琼枝于养殖池暂养6个月，与海区养殖的琼枝外观形态有少许差异(图 1)。海区琼枝分枝紧密，芽尖较多，藻体正面和背面因光照影响颜色区分明显，而养殖池暂养的琼枝分枝疏松光滑，芽尖较少，藻体正面及背面颜色基本相同且难以区分。暂养期培养液为过滤自然海水，经不间断化学分析仪(CleverChem 200, DeChemTech, 德国)检测，海水无机氮本底浓度为28.29 μmol/L，无机磷本底浓度为0.65 μmol/L，海水温度为23℃~28℃，盐度为30。挑选颜色正常、大小均一和生长旺盛的藻体，清洗表面附着生物与杂藻后直接用于实验。
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图 1 海区琼枝和实验琼枝的外观形态 Fig.1 Appearance morphology of B. gelatinae cultured in sea area and used in this experiment A：海区琼枝正面；B：海区琼枝背面；C：实验琼枝 A: Front view of B. gelatinae from the sea area; B: Rear view of B. gelatinae from the sea area; C: B. gelatinae used in this experiment |
研究在琼海基地养殖车间的大水体环境下进行，为保留琼枝藻体完整枝芽，藻体初始鲜重控制在2.5 g左右。将琼枝藻体固定于上口径为36 cm、高为13 cm的红色塑料筐中，然后将红色塑料筐分别悬浮于容量为100 L水体的白色塑料桶中，进行营养盐梯度实验，每个白色塑料桶内壁固定一个小水泵保持水体循环流动。无机氮浓度实验共设置50、100、200、400和800 μmol/L五个梯度，此时，NH4+-N/NO3--N浓度比和无机磷浓度分别设定为1∶1和10 μmol/L；无机磷浓度实验共设置2.5、5、10、20、40和80 μmol/L六个梯度，此时无机氮浓度和NH4+-N/NO3--N浓度比分别设定为100 μmol/L和1∶1；不同NH4+-N/NO3--N浓度比实验共设置0/100、25/75、50/50、75/25和100/0五个梯度，此时无机氮浓度和无机磷浓度分别设定为100和10 μmol/L。实验所用培养水体均为在过滤后的自然海水营养盐本底浓度基础上再人工添加不同梯度的NaNO3、NH4HCO3和KH2PO4，以满足实验营养盐浓度要求，对照组以本底浓度的自然海水作为培养水体，每个处理设置3个重复。培养水体温度约为26℃~28℃，盐度为30，光照强度约为80~100 μmol/ (m2·s)，光照周期为12∶12 (L∶D)，每隔1周更换1次培养水体并称量琼枝鲜重，实验持续5周后取样测定琼枝光合色素含量。
1.3 实验方法琼枝的生长通过测定增重率(weight gain rate, WGR, %)来表示，即藻体鲜重的变化，利用下列公式求得(Lideman et al, 2011)：
| ${\rm{WGR(\% ) = }}[({{M}_{\mathit{1}}}-{{M}_{\mathit{0}}})/{{M}_{\mathit{0}}}] \times 100\% $ |
式中，M0为藻体初始鲜重(g)，M1为5周后的藻体鲜重(g)，称量前用吸水纸快速吸干藻体表层水。
采用甲醇提取法测定藻体叶绿素a (Chl.a)和类胡萝卜素(Car)，采用磷酸缓冲液(pH 6.8)提取法测定藻体藻红蛋白(PE)和藻蓝蛋白(PC)。Chl.a的含量参考Porra (2002)的公式计算；Car的含量参考Parsons等(1963)的公式计算；PE和PC的含量参考Beer等(1985)的公式计算，具体公式如下：
| ${C_{{\rm{Chl}}.a}}({\rm{ \mathsf{ μ} g/mL}}) = 16.29 \times ({A_{\mathit{665}}}--{A_{\mathit{750}}})--8.54 \times ({A_{\mathit{652}}}-{A_{\mathit{750}}}) $ |
| ${C_{{\rm{Car}}}}({\rm{ \mathsf{ μ} g/mL}}) = 7.6 \times [({A_{\mathit{480}}}-{A_{\mathit{750}}})-1.49 \times ({A_{\mathit{510}}}-{A_{\mathit{750}}})] $ |
| $样品{\rm{Chl}}.a或{\rm{Car}}含量({\rm{ \mathsf{ μ} g/g}}\;{\rm{FW}}) = [({C_{{\rm{Chl}}.a}}或{C_{{\rm{Car}}}}) \times V]/{W_F} $ |
| ${C_{{\rm{R - PE}}}}({\rm{ \mathsf{ μ} g/mL}}) = [({A_{\mathit{564}}}-{A_{\mathit{592}}})-({A_{\mathit{455}}}-{A_{\mathit{592}}}) \times 0.2] \times 0.12 $ |
| ${C_{{\rm{R - PC}}}}({\rm{ \mathsf{ μ} g/mL}}) = [({A_{\mathit{618}}}-{A_{\mathit{645}}})-({A_{\mathit{595}}}-{A_{\mathit{645}}}) \times 0.51] \times 0.15 $ |
| $样品{\rm{R - PE}}或{\rm{R - PC}}含量({\rm{ \mathsf{ μ} g/g}}\;{\rm{FW}}) = [({C_{{\rm{R - PE}}}}或{C_{{\rm{R - PC}}}}) \times V]/{W_F} $ |
式中，CChl.a为提取液叶绿素的浓度(µg/mL)；CCar为提取液类胡萝卜素的浓度(µg/mL)；CR-PE为提取液藻红蛋白的浓度(µg/mL)；CR-PC为提取液藻蓝蛋白的浓度(µg/mL)；V为样品提取液总体积(mL)，实验研究中为5 mL；WF为样品鲜重(g)，以实际称取为准；A为提取液在相应波长下的吸光值。
1.4 数据处理应用Excel和SPSS 17.0统计软件对所得数据进行处理与统计分析，并采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和最小显著差异法(LSD)比较不同数据组间的差异，以P < 0.05表示差异显著水平。
2 结果 2.1 不同营养盐水平对琼枝生长的影响 2.1.1 无机氮对琼枝生长的影响在不同无机氮浓度培养条件下，琼枝每周鲜重变化和最终增重率见表 1和图 2A。结果显示，在无机磷浓度为10 μmol/L时，不同的无机氮浓度对琼枝生长具有显著影响。琼枝在对照组和氮浓度为50~200 μmol/L范围内能持续增长，藻体状态正常，养殖5周后琼枝的增重率无显著差异(P > 0.05)，藻体增重率最高，达(38.08±12.35)%；氮浓度为400 μmol/L时，琼枝在前3周保持轻微增长，第4周藻体出现白烂现象，鲜重开始下滑，最终藻体增重率显著低于对照组和氮浓度为50~200 μmol/L (P < 0.05)的组；氮浓度为800 μmol/L时，第1周藻体出现少量白烂，第2周藻体腐烂严重，藻体鲜重急剧下降，后续周期无法测量。
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表 1 不同无机氮浓度条件下琼枝的鲜重(n=3) Tab.1 Fresh weight of B. gelatinae at different conditions of inorganic nitrogen concentration (n=3) |
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图 2 在不同总无机氮浓度(A)、总无机磷浓度(B)和NH4+-N/NO3--N浓度比(C)的培养条件下琼枝的增重率(n=3) Fig.2 Weight gain rate of B. gelatinae at different conditions of total inorganic nitrogen concentration (A), total inorganic phosphorus concentration (B) and ratio of NH4+-N and NO3--N (C) after 5 weeks (n=3) 不同小写字母代表不同处理间有显著性差异(P < 0.05)，下同 Different lowercase letters indicate significance level at P < 0.05 among different treatments. The same as below |
在不同无机磷浓度培养条件下，琼枝每周鲜重变化和最终增重率见表 2和图 2B。结果显示，无机氮浓度为100 μmol/L时，不同无机磷浓度对琼枝生长具有显著影响。琼枝在对照组和磷浓度为2.5~20 μmol/L范围内能持续增长；磷浓度在40~80 μmol/L范围时，琼枝前4周保持缓慢增长，第5周藻体鲜重有下降趋势，藻体微烂并出现断裂现象。结果显示，琼枝在对照组和低磷浓度(2.5~10 μmol/L)条件下增重率均高于高磷浓度(20~80 μmol/L)条件下的增重率，其中，琼枝在磷浓度为2.5~5 μmol/L条件下的增重率显著高于磷浓度为20~80 μmol/L条件下的增重率(P < 0.05)，2.5 μmol/L的磷浓度培养条件下，琼枝增重率最高，达(52.06±5.04)%。
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表 2 不同无机磷浓度条件下琼枝的鲜重(n=3) Tab.2 Fresh weight of B. gelatinae at different conditions of inorganic phosphorus concentration (n=3) |
在不同NH4+-N/NO3--N浓度比培养条件下，琼枝每周的鲜重变化和最终增重率见表 3和图 2C。结果显示，在无机氮浓度为100 μmol/L、无机磷浓度为10 μmol/L时，不同处理组的琼枝在5周培养周期里均保持稳定增长。结果显示，琼枝增重率随NH4+-N/NO3--N浓度比的递增呈现先增高后降低的趋势，其中，NH4+-N/NO3--N为25/75时，琼枝的增重率达到最高，为(50.91± 13.97)%，显著高于NH4+-N/NO3--N为75/25和100/0时(P < 0.05)，与NH4+-N/NO3--N为0/100和50/50时以及对照组差异不显著(P > 0.05)。
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表 3 不同NH4+-N/NO3--N浓度比条件下琼枝的鲜重(n=3) Tab.3 Fresh weight of B. gelatinae at different conditions of ratio of NH4+-N and NO3--N (n=3) |
不同无机氮浓度对琼枝光合色素含量的影响见图 3A和图 3B。结果显示，琼枝在对照组的Chl.a和Car含量均低于实验组，但随着氮浓度的改变，Chl.a和Car含量总体变化不大。藻体在氮浓度为400 μmol/L时，Chl.a和Car的含量最高，分别为(100.78±18.29)和(28.29± 4.19) µg/g；PE和PC含量随着氮浓度的升高均逐渐递增，在氮浓度为400 μmol/L时，PE和PC含量最高，分别为(737.71±63.27)和(89.30±9.04) µg/g，显著高于其他氮浓度组(P < 0.05)。
不同无机氮浓度对琼枝光合色素含量的影响见图 3A和图 3B。结果显示，琼枝在对照组的Chl.a和Car含量均低于实验组，但随着氮浓度的改变，Chl.a和Car含量总体变化不大。藻体在氮浓度为400 μmol/L时，Chl.a和Car的含量最高，分别为(100.78±18.29)和(28.29± 4.19) µg/g；PE和PC含量随着氮浓度的升高均逐渐递增，在氮浓度为400 μmol/L时，PE和PC含量最高，分别为(737.71±63.27)和(89.30±9.04) µg/g，显著高于其他氮浓度组(P < 0.05)。
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图 3 不同无机氮浓度、无机磷浓度和NH4+-N/NO3--N比值对琼枝光合色素含量的影响(n=3) Fig.3 Effects of different inorganic nitrogen concentration, inorganic phosphorus concentration and ratio of NH4+-N and NO3--N on photosynthetic pigments contents of B. gelatinae (n=3) |
不同无机磷浓度对琼枝光合色素含量的影响见图 3C和图 3D。结果显示，实验设置的磷浓度梯度对琼枝光合色素含量影响均不明显。藻体Chl.a和Car含量在低磷浓度组(0~10 μmol/L)总体上低于高磷浓度组(20~ 80 μmol/L)。在磷浓度为40 μmol/L时，Chl.a和Car含量最高，分别为(102.66±12.10)和(35.01±6.27) µg/g，而磷浓度为10 μmol/L时，PE和PC含量最高，分别为(599.22±90.26)和(70.98±10.22) µg/g。
2.2.3 NH4+-N/NO3--N浓度比对琼枝光合色素含量的影响不同NH4+-N/NO3--N浓度比对琼枝光合色素的影响见图 3E和图 3F，结果显示，不同NH4+-N/NO3--N浓度比对琼枝光合色素含量影响同样不明显。但藻体Chl.a和Car的含量在NH4+-N/NO3--N浓度比较高组(75/25和100/0)略高于NH4+-N/NO3--N浓度比较低组(0/100、25/75和50/50)。NH4+-N/NO3--N浓度比为75/25时，Chl.a含量达到最高，为(97.92±7.96) µg/g，NH4+-N/ NO3--N浓度比为100/0时，Car含量达到最高，为(30.10±5.77) µg/g。
3 讨论营养盐是限制藻类生长的主要环境因子之一，主要包括氮和磷等营养元素，适量浓度的氮、磷能够促进藻类快速生长。目前，已有大量文献报道营养盐与藻类生长的关系(Karina et al, 2017; 韩汶均等, 2019)。杨湘勤(2017)研究发现，琼枝对水体无机氮、磷的吸收速率随氮、磷浓度的增加呈递增趋势，当氮、磷达到一定浓度，氮、磷吸收速率呈下降趋势，过高浓度的氮、磷对海藻有一定毒害作用。在本研究中，琼枝的增重率在低氮实验组(50~200 μmol/L)显著高于高氮实验组(400~800 μmol/L)，琼枝的增重率在低磷实验组(0~10 μmol/L)同样高于高磷实验组(20~ 80 μmol/L)。李俊等(2013)研究同样发现，海区氮、磷含量的降低有利于琼枝的生长，低潮带上部到低潮带下部氮、磷含量逐渐减小，琼枝生长效果越来越好。这与本研究的结果基本一致，故可以表明琼枝是一种适合低营养盐环境的热带海藻。当营养盐浓度恒定时，不同形态的营养盐比例是决定海藻生长状态的重要因素。黄鹤忠等(2006)研究发现，将不同形态的无机氮按适合细基江蓠繁枝变型(Gracilaria tenuistipitata var. liui Zhang et Xia)生活习性的配比混合，细基江蓠繁枝变型的生长更好。本研究发现，将氮、磷固定在适合琼枝生长的浓度时，琼枝增重率随NH4+-N/ NO3--N浓度比的递增呈先增高后降低的趋势，其中，NH4+-N/NO3--N浓度比为25/75时，琼枝的增重率达到最高值，为(50.91±13.97)%，说明不同氮源比例有效影响着琼枝的生长，在氮浓度一定的情况下，琼枝相对更容易吸收NO3--N，在NH4+-N与NO3--N以1/3配比的环境中琼枝生长更加旺盛。黄鹤忠等(2006)研究发现，不同的NH4+-N/NO3--N浓度比对细基江蓠繁枝变型的生长速率影响显著，过高或过低的NH4+-N/NO3--N浓度比均不利于江蓠生长，这与本研究结果一致。但李洋等(2016)和李春强等(2015)研究发现，琼枝优先吸收NH4+-N，其次才吸收NO3--N，这与本研究结果相反。作者认为，造成研究结果不同可能是由于本研究实验周期较长，每周分别补充恒定浓度(100 μmol/L)和比例的氮源，以琼枝的生长为依据，并且本研究在只有NH4+-N时(NH4+-N/NO3--N浓度比为100/0)琼枝的增重率达到最低为(21.88±3.24)%。而李洋等(2016)和李春强等(2015)的实验周期较短，氮浓度维持在50 μmol/L以下且没有补充，都是以琼枝对氮的吸收速率为依据。此外，乔倩等(2016)研究发现，在NO3--N和尿素按一定比例混合条件下，中肋骨条藻(Skeletonema costatum)的生长状况比单一氮源时更好，最佳生长出现在尿素/NO3--N为3/1的实验组中。说明，氮源的不同及配比不仅影响大藻生长，对微藻同样产生明显影响。而另有文献报道表明，不同氮源对龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)(徐永健等, 2006)和隅江蓠(Gracilaria cornea)(Navarro-Angulo et al, 1999)的生长影响差异不显著。唐贤明等(2015)研究发现，10 mg/L的NH4CO3虽能显著促进芋根江蓠(Gracilaria blodgettii)生长，但NaNO3、NH4NO3和尿素对芋根江蓠的相对生长率并无显著的差异，这种现象表明，不同氮源对不同海藻生长的影响程度有一定差异。
光合色素包含叶绿素a (Chl.a)、类胡萝卜素(Car)和藻胆素等，其中，Chl.a是光合作用的主要色素，能够有效吸收光能、保护光合机构免于光破坏、稳定捕光复合体的结构；Car主要作为辅助色素，还有防御光氧化破坏以及抗氧化剂的作用；藻胆素与脱辅基蛋白结合成藻胆蛋白，在光能吸收上同样发挥重要作用(Ke, 2001; 许大全, 2013)。植物生存依赖于光合色素，其含量的高低是反应植物生理活性变化的重要指标。本研究发现，琼枝的PE和PC含量除了随无机氮浓度的升高而显著上升外，在不同磷浓度和氮源配比实验中均无明显差异；不同氮、磷浓度和氮源配比对琼枝的Chl.a和Car含量均无明显影响。黄中坚等(2014)同样发现，随着无机氮浓度的升高，芋根江蓠的PE和PC含量也明显升高，Chl.a和Car含量则无明显变化；不同氮源配比实验中芋根江蓠光合色素含量均无明显差异，这与本研究结果基本一致。而王艳平(2017)研究发现，不同氮浓度和氮源配比对缢江蓠(Gracilaria salicornia)光合色素含量均有影响。造成实验结果的差异可能是受养殖环境、养殖品种以及设置的营养盐水平等因素的影响。因此，作者推测在其他环境条件相同的情况下，在本研究设定的营养盐条件范围内养殖琼枝，营养盐不是决定琼枝光合色素含量最主要的环境因素，需要开展进一步研究。此外，本研究在养殖车间大水体的环境中利用水泵促进流水的方式，可以建立琼枝工厂化养殖模式，尽可能将培养条件与海区环境的差异降到最低，旨在突破养殖海域的限制，为实现琼枝工厂化养殖奠定前提条件与理论基础。
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