2. 通威股份有限公司水产畜禽营养与健康养殖农业农村部重点实验室 四川 成都 610093;
3. 通威股份有限公司水产健康养殖四川省重点实验室 四川 成都 610093
2. Key Laboratory of Aquatic, Livestock, Poultry Nutrition and Healthy Culturing, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Tongwei Co. Ltd., Chengdu, Sichuan 610093, China;
3. Key Laboratory of Aquatic Healthy Aquaculture of Sichuan Province, Tongwei Co., Ltd., Chengdu, Sichuan 610093, China
水产品是人类食品中优质动物蛋白的主要来源之一。我国是水产养殖第一大国，2019年全国水产品总产量为6450万t，其中，养殖产量为5050万t。然而，部分养殖水产品的土腥味令消费者很难接受，是困扰水产养殖业已久的问题，直接影响到水产品的消费和养殖经济效益。据研究，土臭味素(geosmin, GSM)和2-甲基异莰醇(2-methylisoborneol, 2-MIB)是易引起水产品肉质产生土腥味最常见的2种化合物，是放线菌(Actinomycetes)、蓝藻(Cyanobacteria)、细菌(Bacteria)和真菌(Fungi)等微生物的次级代谢产物在萜烯合成酶的作用下产生的，参与这些生物合成的酶和基因最早是在链霉菌(Streptomyces)上发现的，后来也在蓝藻中发现(Cane et al, 2006; Dickschat et al, 2007; Ludwig et al, 2007)。研究表明，人体对土臭味素和2-甲基异莰醇的嗅觉阈值分别为0.9和0.6 μg/kg (Robertson et al, 2005; Persson, 1980)；水体中4~10 ng/L的土臭味素和9~42 ng/L的2-甲基异莰醇就能使水体及水产品产生异味；当鱼肉组织中的这2种化合物浓度超过0.7 μg/kg时，就不再适合零售(徐立蒲, 2009)。国内外相关研究人员采用臭氧(薛勇, 2006; 杜国伟, 2006; Schrader et al, 2010; 王国超, 2012; Zhang et al, 2016)、乙酸(Lindholm-Lehto et al, 2019)、调节水质(Schrader et al, 2010; 王赛, 2012)和暂养(杨玉平, 2010)等方法脱除或降低养殖水产品中的土腥味物质。目前，有关土臭味素和2-甲基异莰醇等的测定方法主要为感官分析法(Grimm et al, 2004; Howgate, 2004; Robin et al, 2006)、气相色谱法(Howgate, 2004)和气相色谱–质谱联用法(GC-MS) (陈依萍等, 2020)。GB/T 32470-2016 (张振伟等, 2016)规定了顶空固相微萃取–气相色谱质谱联用法测定生活饮用水及其水源水中的土臭味素和2-甲基异莰醇。相关研究(张婷等, 2009; 王国超等, 2011; Deng et al, 2012; 周梦海, 2015)报道了采用微波蒸馏－固相微萃取－气相色谱质谱联用法测定鲶鱼(Silurus asotus)、罗非鱼(Oreochromis mossambicus)肌肉中的土臭味素和2-甲基异莰醇。Ruan等(2013)采用搅拌棒吸收萃取–热脱附-气相色谱质谱联用法(SBSE-TD-GC-MS)测定大西洋鲑(Salmo salar)肌肉中的土臭味素和2-甲基异莰醇含量，土臭味素加标回收率达93%~96%，但2-甲基异莰醇加标回收率仅为23%~30%，不满足检测需求。为准确测定水产品中的土臭味素和2-甲基异莰醇含量，本研究采用顶空固相微萃取法(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)提取鱼肉中的土腥味物质，以顺式-十氢-1-萘酚为内标、气相色谱质谱联用法进行定性和定量测定，旨在建立鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇的检测方法，为养殖水产品异味物质脱除提供检测方法。
1 材料与方法 1.1 仪器、试剂和材料7890A-5975C气相色谱–质谱联用仪，G1701EA质谱工作站：Agilent公司，美国；T10均质仪，IKA公司，德国；SPME手柄、65 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，Sigma-Aldrich公司，美国；DF-Ⅱ集热式磁力加热搅拌器，江苏金坛市医疗仪器厂；40 mL顶空瓶，上海安谱科学仪器有限公司；LD6100-1电子天平，沈阳龙腾电子有限公司。
100 μg/mL土臭味素和2-甲基异莰醇混和标准溶液，顺式-十氢-1-萘酚标准物质：Sigma-Aldrich公司，美国；甲醇：色谱纯；水为Milli-Q Gradient去离子水。
肌肉样品：鲫鱼(Carassius auratus)、乌鱼(Channa argus)、罗非鱼、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、斑点叉尾
准确称取样品10 g (精确至0.1 g)于40 mL顶空瓶中，加入1 μg/mL顺式-十氢-1-萘酚溶液10 μL作为内标，加入10 mL去离子水，用均质器均质3 min，将样品完全破碎，放入微型搅拌子，备用。
1.2.2 顶空固相微萃取提取土臭味素和2-甲基异莰醇萃取头老化：第一次使用DVB/CAR/PDMS萃取头时，需置于气相色谱进样口250℃下老化2 h (氮气保护下)；之后使用时，需在250℃下处理30 min，以确保脱去可能吸附的挥发性成分。
SPME提取：将装有样品的顶空瓶置于磁力搅拌台上，于60℃水浴中平衡10 min，将SPME针管插入顶空瓶中(含65 μm/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头，使用前于250℃下处理30 min，以确保脱去可能吸附的挥发性成分)，固定萃取头在顶空瓶中的位置，搅拌速度为1000 r/min左右，顶空萃取30 min后取出，迅速插入气相色谱仪的进样口，解吸5 min，使SPME纤维头涂膜吸附的挥发性成分在高温下迅速热解吸，即可通过GC-MS进行分析鉴定。
1.2.3 土臭味素和2-甲基异莰醇标准工作溶液0.1 μg/mL土臭味素和2-甲基异莰醇混合标准储备液：准确移取100 μL 100 μg/mL土臭味素和2-甲基异莰醇混合标准溶于100 mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容，摇匀，备用。
1 μg/mL顺式-十氢-1-萘酚内标储备液：准确称取顺式-十氢-1-萘酚标准物质10 mg于1000 mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容，摇匀，备用。
土臭味素和2-甲基异莰醇混合标准系列工作液：称取10 g去离子水于40 mL顶空瓶中，加入10 mL去离子水，分别加入10、20、50、100、200和1000 μL 0.1 μg/mL土臭味素和2-甲基异莰醇混合标准储备液，10 μL 1 μg/mL顺式-十氢-1-萘酚内标储备溶液，摇匀，得到浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2和10 μg/L土臭味素和2-甲基异莰醇系列标准工作液。
1.2.4 土臭味素和2-仪器工作条件色谱柱：HP-5 ms弹性毛细管柱(30.00 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；程序升温：柱初温60℃，保持4 min，然后以8.5℃/min升至200℃，保持15 min，以20℃/min升至250℃，保持2 min；进样口温度250℃；载气：He，流量1.0 mL/min；解吸温度250℃，解吸时间5 min，不分流模式进样。
传输线温度260℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV。扫描方式：SIM选择性离子扫描；土臭味素扫描离子为125、112和97；2-甲基异莰醇的扫描离子为135、108和95；顺式-十氢-1-萘酚的扫描离子为136、94和121。
1.2.5 标准工作曲线绘制和样品分析按照上述色谱质谱条件和方法，进行GC-MS分析，以标准液中被测组分的峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，以标准液中被测组分的浓度和内标浓度的比值为横坐标绘制标准工作曲线。在相同条件下测定样品，从标准工作曲线上求得样品中土臭味素和2-甲基异莰醇的含量。
2 结果与讨论 2.1 提取方法的选择国内外有关土臭味素和2-甲基异莰醇的提取方法主要有微波蒸馏－固相微萃取、顶空固相微萃取和搅拌棒吸收萃取–热脱附等(张婷等, 2009; 王国超等, 2011; Deng et al, 2012; 周梦海, 2015; 张振伟等, 2016)。微波蒸馏提取需对微波萃取功率、微波蒸馏时间和载气气流等参数进行确认，由于微波萃取所用的仪器大多为家用微波炉，不同品牌和型号的微波炉使用功率不一致，很难统一微波萃取功率和固化实验条件。前期准备实验时发现，鱼肉中含有70%~80%的水分，微波萃取时，鱼肉中的水分汽化为水蒸气，在载气吹扫和冷凝水冷却双重作用下，水蒸气在管道中冷凝下来，附着在冷凝管上，影响土臭味素和2-甲基异莰醇的收集，导致回收率偏低，多次实验结果的重复性、稳定性差。本方法选择顶空固相微萃取提取土臭味素和2-甲基异莰醇，称取样品后加入等体积的超纯水均质，采用60℃顶空固相微萃取法对目标化合物进行提取和富集，该前处理操作简单、易标准化，加标回收实验、实际样品测定结果表明，采用该提取方法具有良好的重现性，可满足鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇的检测需求。
2.2 固相微萃取条件的选择和优化 2.2.1 萃取头的选择Sung等(2005)对土臭味素和2-甲基异莰醇提取过程中萃取头的选择进行了研究，分析了PDMS、PDMS/DVB、PA、CAR/PDMS、CW/DVB和DVB/CAR/PDMS等6种不同吸附材质对水中土腥味物质的吸附效果。结果表明，DVB/CAR/ PDMS对土臭味素和2-甲基异莰醇的萃取效果最好，实验最终选择DVB/CAR/PDMS作为土臭味素和2-甲基异莰醇提取的萃取头。
2.2.2 NaCl的选择固相微萃取中，一般来说，加入NaCl将获得较高的萃取效果，但由于鱼肉样品挥发性风味成分较多，加入NaCl会导致鱼肉中多种易吸附的挥发性成分吸附于萃取头，使萃取头容易达到饱和，从而减少土臭味素和2-甲基异莰醇的吸附，降低土臭味素和2-甲基异莰醇的回收率，最终影响土臭味素和2-甲基异莰醇的准确定量，纤维头的寿命也会因此显著下降，比较实验结果见图 1。实验最终选择萃取过程中不添加NaCl。
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图 1 未加入NaCl和加入NaCl总离子流图 Fig.1 Total ion chromatograms without/with NaCl 1: 2-甲基异莰醇; 2: 顺式-十氢-1-萘酚; 3: 土臭味素1: 2-MIB; 2: cis-Decahydro-1-naphthol; 3: GSM |
设定搅拌时间30 min，萃取温度为60℃，考察搅拌速度分别为300、600、900、1200、1500和2000 r/min对萃取效果的影响，实验结果见图 2。结果表明，土臭味素和2-甲基异莰醇的回收率随着搅拌转速的增大而增大，当搅拌速率达到1500 r/min之后，回收率基本趋于稳定。实验最终确定搅拌速率为1500 r/min。
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图 2 不同搅拌转速对加标回收率的影响(n=3) Fig.2 Effects of different stir speeds on recovery rate (n=3) |
实验以65 μm DVB/CAR/PDMS为实验用萃取头。萃取温度均设置为60℃，平衡10 min后，吸附时间选取20、30和40 min，考察土臭味素和2-甲基异莰醇的加标回收率，结果见图 3。结果显示，30和40 min吸附时间的回收率明显高于20 min，30和40 min的回收率相接近。综合比较，萃取时间30 min为最佳。
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图 3 不同萃取时间对加标回收率的影响(n=3) Fig.3 Effects of different extraction time on recovery rate (n=3) |
萃取温度对萃取结果有两方面影响，一方面温度升高有利于土臭味素和2-甲基异莰醇的挥发，增加吸附量；另一方面，温度升高时，其余干扰物质吸附增加，从而减少目标化合物吸附量。选取萃取时间为30 min，设置40℃、60℃和80℃对实验结果的影响，以考察土臭味素和2-甲基异莰醇的加标回收率，结果见图 4。结果表明，萃取温度为60℃时，加标回收率最高。
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图 4 不同萃取温度对加标回收率的影响(n=3) Fig.4 Effects of different extraction temperature on recovery rate (n=3) |
由于土臭味素和2-甲基异莰醇为半挥发性物质，不稳定，易损失。本研究采用外标法和内标法(顺式-十氢-1-萘酚)开展加标回收实验，结果见图 5。结果显示，外标法的回收率在40.6%~46.7%之间，内标法回收率在70.6%~72.3%之间，内标法的回收率明显高于外标法。因此，选择内标法作为鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇含量的测定方法。
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图 5 外标法和内标法对加标回收率的影响(n=3) Fig.5 Effects of external standard method and internal standard method on recovery rate (n=3) |
实验选用了2-异丁基-3-甲氧吡嗪和顺式-十氢-1-萘酚2种与目标化合物化学性质相似、沸点相近的内标物进行加标回收实验。结果显示，用顺式-十氢-1-萘酚作为内标物，土臭味素和2-甲基异莰醇回收率分别为71.2%和69.1%；而用2-异丁基-3-甲氧吡嗪作为内标物，土臭味素和2-甲基异莰醇回收率分别为57.3%和48.9%。因此，选择顺式-十氢-1-萘酚作为内标物。
2.4 线性范围、检出限和定量限土臭味素和2-甲基异莰醇混合标准系列工作液分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和10.0 μg/L，顺式-十氢-1-萘酚(内标)的浓度均为1 μg/L时进样测定。以标准液中被测组分的峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，以标准液中被测组分的浓度和内标浓度的比值为横坐标，绘制标准工作曲线，并分别计算、验证最低检出浓度(S/N=3.0，P/P)、最低定量浓度(S/N=10.0，P/P)。土臭味素和2-甲基异莰醇GC-MS总离子流图见图 6，线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限等结果见表 1。
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图 6 土臭味素、2-甲基异莰醇和顺式-十氢-1-萘酚(内标)标准液总离子流图(5.0 ng/mL) Fig.6 Total ion chromatogram of 5.0 ng/mL geosmin, 2-methylisoborneol and cis-decahydro- 1-naphthol standard solution |
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表 1 土臭味素和2-甲基异莰醇的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限 Tab.1 Regression equations, correlation coefficients (r2), detection limits and quantification limits for geosmin and 2-methylisoborneol |
对鲫鱼、乌鱼、罗非鱼和斑点叉尾
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表 2 精密度实验结果 Tab.2 Results of precision test |
对鲫鱼和罗非鱼进行加标实验，并计算回收率，结果见表 3。从表 3可以看出，土臭味素的加标回收率为68.67%~80.30%，2-甲基异莰醇的加标回收率为62.67%~83.40%，相对标准偏差均小于10%。由此可见，该方法能较准确测定鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇的含量。
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表 3 回收率实验结果(n=3) Tab.3 Spiked recovery of different feed material samples (n=3) |
为考察方法的适用性，在水产市场上购买鲫鱼、乌鱼、罗非鱼、草鱼、花鲢、鲤鱼和武昌鱼进行土臭味素和2-甲基异莰醇测定实验，每个样品重复测定3次，结果见表 4，草鱼实际样品检测总离子流图见图 7。7种鱼类的土臭味素的含量为0.179~0.306 μg/kg，2-甲基异莰醇的含量为0.222~0.531 μg/kg。在实际样品测定中，目标化合物和内标物分离良好，无干扰峰，可满足鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇的定性定量测定。
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表 4 7种实际样品测定结果 Tab.4 Quantification determination results for 7 fish muscle samples |
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图 7 草鱼样品总离子流图 Fig.7 Total ion chromatogram of geosmin, 2-methylisoborneol, and cis-decahydro-1-naphthol in extract solution of grass carp |
由于鱼肉中挥发性风味物质成分复杂、种类繁多，风味物质的检测一直备受关注。土腥味物质作为一类影响鱼肉品质的挥发性成分，提取和吸附难度大，干扰物质繁多，其检测难度较大。本方法选择顶空固相微萃取技术作为土腥味物质的提取和富集方法，前处理方法简单，不使用有机溶剂，不对环境造成污染。称取鱼肉样品后加入等体积的超纯水，均质，将鱼肉中的土臭味素和2-甲基异莰醇溶解于水相中，经顶空固相微萃取对目标物进行提取和富集，以顺式-十氢-1-萘酚为内标物，通过GC-MS定量分析，可减少检测过程中其他风味成分对土臭味素和2-甲基异莰醇的干扰，达到完好分离，方法精密度均小于5%，土臭味素的加标回收率为68.67%~80.30%，2-甲基异莰醇的加标回收率为62.67%~83.40%，相对标准偏差均小于10%，表明该方法可满足鱼肉中土臭味素和2-甲基异莰醇的定量检测需要，可作为养殖水产品异味物质脱除检测方法。
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