褐藻生物量巨大，生长速度较快，被视为最有前景的生物资源之一(Flórez-Fernández et al, 2019)。褐藻含有多种生物活性物质，如褐藻胶、岩藻聚糖、岩藻黄质、甘露醇、多酚和植物激素等(Li et al, 2019a; Sharma et al, 2014、2016)。其中，褐藻胶约占褐藻干物质的22%~44% (w/w)，是褐藻细胞壁的主要成分(Wargacki et al, 2012)。

褐藻胶是一种线性聚合物，由β-d-甘露糖醛酸(M)和α-1-古罗糖醛酸(G)作为单体单元组成。单体通过1, 4-糖苷键以不同顺序结合，构成聚古罗糖醛酸片段(PolyG)、聚甘露糖醛酸酯片段(PolyM)和杂聚物片段(PolyMG)(Wong et al, 2000)。褐藻胶裂解酶能切断褐藻胶的1, 4-糖苷键，在相对温和可控的条件下，将褐藻胶水解成褐藻寡糖(alginate oligosaccharides, AOS) (Li et al, 2019b)。AOS具有抗氧化、抗肿瘤和抗凝血等生理活力，在医疗健康相关领域具有潜在的应用(孙丽萍等, 2005; Iwamoto et al, 2003; 辛现良等, 2001; Lin et al, 2007)。此外，AOS对植物根系发育具有显著的促进作用(Xu et al, 2003; Zhang et al, 2014)。

多种海洋细菌可以产生褐藻胶裂解酶，包括链霉菌(Streptomycete sp.)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、黄杆菌(Flavobacterium sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和弧菌(Vibrio sp.)等(Chen et al, 2016; Inoue et al, 2016; Jagtap et al, 2014; Li et al, 2015; Schiller et al, 1993; Thomas et al, 2013)。为了提高褐藻胶裂解酶的活力，研究者克隆了多种褐藻胶裂解酶的编码基因并进行重组表达(He et al, 2018; Zhang et al, 2020)。其中，低温褐藻胶裂解酶受到广泛关注。在低温条件下，植物激素等活性物质的不稳定性能够得到控制，并且低温催化具有低污染风险和低能耗的优势(Gao et al, 2018)。但由于低温酶通常稳定性差且活力低，已报道的褐藻胶裂解酶并不能满足工业要求。因此，需要筛选出符合工业应用需求的、具有鲁棒性的低温褐藻胶裂解酶。

本研究筛选到的海洋细菌Yangia sp. SJ-H-12能在低温条件下分泌褐藻胶裂解酶，克隆褐藻胶裂解酶编码基因Alyya并在食品级真核宿主解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中表达，分泌的褐藻胶裂解酶ALYYA具有较好的温度稳定性和pH稳定性，可以适应不同盐度，并可制备较低分子量的寡糖，说明ALYYA可以成为褐藻胶降解的有效工具。

褐藻胶购自明月海藻集团(青岛)。PolyM和PolyG购自青岛博智汇力生物技术有限公司。分泌表达采用解脂耶氏酵母系统，URA–菌株和表达载体pINA1312由中国海洋大学池振明教授提供。在以褐藻胶为单一碳源的ASC(褐藻酸唯一碳源培养基，alginate as sole carbon source)固体培养基中筛选和培养产褐藻胶裂解酶的菌株。ASC培养基包含10 g/L褐藻胶钠、5.0 g/L (NH₄)₂SO₄、1.0 g/L MgSO₄·7H₂O和0.1 g/L FeSO₄，海水配制。在含有1.7 g/L酵母基础氮源、10.0 g/L葡萄糖、5.0 g/L (NH₄)₂SO₄和25.0 g/L琼脂的YNB板上筛选解脂耶氏酵母转化子(Madzak et al, 2015)。GPPB培养基用于重组酶生产，包含30.0 g/L葡萄糖、1.0 g/L (NH₄)₂SO₄、2.0 g/L酵母提取物、2.0 g/L KH₂PO₄、3.0 g/L K₂HPO₄和0.1 g/L MgSO₄·7H₂O，pH为6.8。2216E培养基包含1.0 g/L酵母提取物、5.0 g/L蛋白胨、0.01 g/L磷酸铁和20.0 g/L琼脂，海水配制。

对采集的绿烂海带(Saccharina japonica)样品使用无菌海水清洗3次，加0.5 mL无菌海水研磨成匀浆液，稀释涂布在ASC平板，放置于20℃培养7 d。平板上分离得到的菌株转移至ASC液体培养基中，并在20℃下培养48 h，发酵液以5000×g离心。以0.5%(w/v)褐藻胶溶液作为底物，采用DNS(3, 5-二硝基水杨酸)法检测褐藻胶裂解酶活力，1 U酶活力定义为1 min产生1 μmol还原糖所需酶量(褚洪蕊等, 2008)。分离得到的菌株在含30%甘油的2216E保种液中–80℃保藏。

产褐藻胶裂解酶菌株于2216E液体培养基中培养2~3 d。从每个培养基取1 mL菌液离心，取菌体，95℃保温5 min，破碎细胞释放细菌DNA，作为PCR模板DNA，用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3′)扩增细菌的16S rDNA。对菌株的16S rDNA进行测序。通过BLAST，与其他16S rDNA序列进行比较。使用MEGA 7.0软件根据Neighbor-Joining的方法构建系统发育树。

SJ-H-12菌株基因组DNA已完成测序和注释(诺禾致源)。序列分析显示，基因组中存在1个潜在的褐藻胶裂解酶基因，大小为1113 bp。使用SignalIP 4.1服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)分析信号肽；在保守域数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)中进行结构域分析；在线预测理论pI和MW(http://web.expasy.org/compute_pi/)。基于报道的褐藻胶裂解酶，使用MEGA 7.0软件根据Neighbor- Joining的方法构建系统发育树。

对Alyya基因进行密码子优化，连接XPR2信号肽基因(Synbio Technologies, 中国)。合成的DNA片段连接pINA1312质粒，用于转化URA^–菌株。在GPPB (glucose in phosphate buffer)液体培养基中30℃培养84 h，检测到阳性转化子的褐藻胶裂解酶活力。将菌株M34上清液调节pH为7.5，然后加至Ni-NTA琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare, 美国)。将ALYYA酶连接至凝胶，用咪唑溶液洗涤。用12%(w/v)凝胶SDS- PAGE验证ALYYA的纯度和分子量。以polyM、polyG和褐藻胶为底物，研究ALYYA的底物偏好性。

在温度为10℃~60℃、pH=8.0的10 mmol/L甘氨酸–NaOH缓冲液中进行ALYYA催化水解反应。检测活力以确定最佳反应温度。为评估ALYYA的热稳定性，将纯化的ALYYA在10℃~60℃下孵育12 h，然后在35℃下测量剩余活力。在不同pH的10 mmol/L缓冲液[Na₂HPO₄–柠檬酸(pH 3.0~8.0)，甘氨酸–NaOH (pH 8.5~11.0)]中，制备褐藻胶溶液作为底物。使用这些褐藻胶溶液测定酶活力以确定最佳反应pH。通过估计在不同pH的缓冲液中于4℃孵育12 h后剩余的酶活力来检测pH的稳定性。所有反应均重复3次。

配制0.5%(w/v)的褐藻胶溶液(pH 8.0)，分别加入不同量的NaCl。以不同盐度的褐藻胶溶液为底物，加入等量的ALYYA，在35℃下测定酶活力，研究NaCl对ALYYA活力的影响。

将纯化的ALYYA (40 U)加入10 mL、pH 8.0的0.5%(w/v)褐藻胶溶液中，35℃下反应40 min。每5 min检测黏度和235 nm的吸光度。当黏度和吸光度均稳定时，将降解产物脱盐并通过ESI-MS确定聚合度(DP)。

从绿烂海带中共分离得到46株海洋细菌。其中，7个菌株20℃下能在ASC平板上生长，说明这些菌株能够产生低温褐藻胶裂解酶。SJ-H-12菌株在液体ASC培养基中能分泌最高活力的褐藻胶裂解酶，达到2.44 U/mL。在2216E平板上，菌株SJ-H-12的菌落光滑且不透明，呈乳黄色，圆形菌落边缘整齐(图 1a)；显微镜下，该菌株呈不规则球形(图 1b)。Blast比对分析发现，其16S rDNA序列与海洋细菌Yangia属相似度最大。聚类分析表明，菌株SJ-H-12与Yangia sp. CDJ15B-A02在同一分支上(图 2)。综合Blast和系统发育树的结果，认为SJ-H-12属于Yangia属，命名为Yangia sp. SJ-H-12。

图 1(Fig. 1)

图 1 SJ-H-12菌株的平板菌落形态(a)和细胞形态(b) Fig.1 Plate colony (a) and cell (b) morphology of SJ-H-12 strain

图 1(Fig. 1)

图 2 基于16S rDNA序列以Neighbor-Joining的方法构建系统发育树(比例尺表示0.020的遗传距离) Fig.2 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence (The scale bar indicated a genetic distance of 0.020)

菌株SJ-H-12的基因组中存在1个潜在的褐藻胶裂解酶编码基因。开放阅读框由1113 bp组成，编码370个氨基酸的蛋白质(MT533612)。该酶被命名为ALYYA，并进行进一步的生物信息学分析。ALYYA的前23个氨基酸是信号肽，与分泌特征一致。去掉信号肽后，成熟酶的理论等电点(pI)为4.00，分子量(MW)为38.1 kDa。在NCBI上分析发现，ALYYA具有单个保守结构域。为确定ALYYA的进化位置，根据氨基酸序列和其他已报道的褐藻胶裂解酶构建了系统进化树。如图 3所示，ALYYA与Pseudomonas sp. E03的AlgA和Enterobacter sp. FY-07的AlgL位于同一分支。已报道的多数褐藻胶裂解酶属于多糖水解酶7家族(PL7)和17家族(PL17)，而AlgA和AlgL均属于5家族(PL5)，具有polyM片段偏好性(Inoue et al, 2016; Qin et al, 2018; Uchimura et al, 2010)。ALYYA的发现丰富了PL5家族褐藻胶裂解酶的研究，推测具有较强的polyM片段偏好性。

图 1(Fig. 1)

图 3 基于褐藻胶裂解酶氨基酸序列构建的Bootstrap consensus系统发育树 Fig.3 Bootstrap consensus phylogenetic tree based on alginate lyase amino acids sequence

在以往研究中，大多数褐藻胶裂解酶在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达。然而，由于大肠杆菌分泌能力弱、合成内毒素且具有细胞壁抗原物质，大肠杆菌表达褐藻胶裂解酶在工业生产中受到了限制(Miyamoto et al, 2009)。本研究在食品级宿主解脂耶氏酵母中表达了ALYYA，这是一种广泛使用的异源宿主，具有出色的分泌能力(Madzak, 2015)。重组菌株M34显示出最高的细胞外活力。如图 4a所示，在GPPB培养基中培养60 h后，重组菌株M34中的ALYYA活力达到34.2 U/mL，生物量为16.2 g/L。胞外酶的活力是野生菌株(2.44 U/mL)的14倍。从上清液中纯化ALYYA蛋白，并通过SDS-PAGE分析，如图 4b所示，在泳道上具有单一条带，分子量约为39.0 kDa，与去掉信号肽的氨基酸序列加上有His标签得到的理论分子量接近。纯化的ALYYA对褐藻胶的比活力为676.4 U/mg，而对polyG片段和polyM片段的比活力分别为213.2 U/mg和913.6 U/mg。此结果验证了生物信息学分析ALYYA对polyM偏好的预测。

图 1(Fig. 1)

图 4 分泌到培养基中的ALYYA活力的时间曲线(a)和纯化ALYYA的SDS-PAGE分析(b) Fig.4 Time curve of ALYYA activity secreted into the culture medium (a) and SDS-PAGE analysis of purified ALYYA (b) 数据均基于3个平行；M泳道表示预染色蛋白梯；泳道1表示纯化的ALYYA Data were based on 3 parallels; Lane M represents pre-stained protein ladder; Lane 1 represents purified ALYYA

在酶纯化的基础上，研究了ALYYA的酶学性质。如图 5a所示，ALYYA的催化活力在30℃时最高；在25℃~35℃之间检测到80%以上的最高活力。当温度升至40℃以上时，活力急剧下降。在较低温度10℃和20℃下的催化活力分别为最高值的53.2%和38.4%。低于35℃时，ALYYA非常稳定；在40℃下孵育2 h后，剩余约60%的活力。高于45℃时，ALYYA丧失大部分活力。多数褐藻胶裂解酶在约40℃时具有最高活力，而低温褐藻胶裂解酶在低于35℃时具有最高的催化活力，在20℃时具有最高活力的50%以上。当前，尚无能应用于工业生产的商品化褐藻胶裂解酶，且报道的褐藻胶裂解酶多数为中温酶。与已经报道的少数低温褐藻胶裂解酶相比，ALYYA在20℃时的活力更高，并具有更好的热稳定性(图 5b)。ALYYA可作为降解褐藻胶的新型工具酶。

图 1(Fig. 1)

图 5 不同温度对ALYYA活力(a)和稳定性(b)的影响 Fig.5 Effects of different temperature on the activity (a) and stability (b) of ALYYA

如图 6a所示，ALYYA活力在pH 8.0时最高，且在pH 6.0~9.0时超过80%。此外，在孵育12 h后，ALYYA在pH 5.0~10.0的范围内保留了超过60%的活力。在本研究的整个pH范围(3.0~11.0)，孵育12 h后均保留了40%以上的活力(图 6b)。而细菌来源的褐藻胶裂解酶多数倾向于在中性附近催化水解反应(Mochizuki et al, 2015)。与其他低温褐藻胶裂解酶相比，ALYYA在更大的pH范围内表现出催化活力。例如，TsAly6A和AlgNJU-03的pH稳定范围分别仅为6.60~8.95和6.0~9.0 (Zhuang et al, 2018; Zhu et al, 2017)。实际上，ALYYA的pH稳定范围甚至比中温褐藻胶裂解酶AlgNJ04的还要大(Zhu et al, 2018)。这种独特的pH稳定性使ALYYA可以在不同催化环境下完成褐藻中活性物质的提取和转化。另外，Pseudomonas sp. E03的AlgA同样属于PL5家族，最适反应温度为30℃，最适反应pH为8，与本研究中ALYYA的pH和温度特性类似(Zhu et al, 2015)。

图 1(Fig. 1)

图 6 不同pH对ALYYA活力(a)和稳定性(b)的影响 Fig.6 Effects of different pH on the activity (a) and stability (b) of ALYYA

如图 7所示，NaCl在0~2.0 mol/L的浓度下能够明显激活ALYYA的活力。在0.75 mol/L NaCl浓度下，ALYYA的活性达到最高(290.0%)。NaCl对大多数褐藻胶裂解酶的活化是必不可少的。在1 mol/L NaCl中，AlgM4活力比无NaCl时增加了7倍左右(Huang et al, 2015)。在0.3 mol/L NaCl中的Aly08活力是无NaCl时的8倍左右(Wang et al, 2019)。相比之下，ALYYA的活力较为稳定，对NaCl的依赖较弱，并具有耐盐性。不同来源、品种和加工方法得到的褐藻的成分和盐度均有所区别。因此，ALYYA是一种可以适应不同盐度的酶，能满足各种加工需求。

图 1(Fig. 1)

图 7 不同浓度NaCl对ALYYA活力的影响 Fig.7 The effect of different concentration of NaCl on activity of ALYYA

图 1(Fig. 1)

图 8 通过ESI-MS分析ALYYA的降解产物 Fig.8 Analysis of degradation products of ALYYA by ESI-MS

使用ALYYA水解褐藻胶溶液40 min，当黏度不再下降时，通过负离子ESI-MS检测终产物。如图 7所示，产物主要为二糖(351.05 m/z)，另有少部分单糖(175.00 m/z)和三糖(526.90 m/z)。因此，ALYYA是一种内切褐藻胶裂解酶。而低温褐藻胶裂解酶Algb和AlgNJU-03产生的寡糖主要是DP2~DP5 (Zhu et al, 2017)。ALYYA可制备较低分子量的寡糖，具有潜在的药物应用前景。

综上所述，本研究克隆了一种新型的低温褐藻胶裂解酶的编码基因，并对其进行了胞外分泌表达和性质研究。ALYYA在温度为25℃~35℃时表现出80%以上的活力，且在30℃时表现出最高活力，是典型的低温褐藻胶裂解酶；此外，ALYYA在pH为4.0~10.0的范围内保持了70%以上的活力，在pH为3.0~11.0的范围内保持了40%以上的活力，它的pH稳定范围比中温褐藻胶裂解酶大，表现出优异的pH稳定性；研究发现，ALYYA是一种可以适应不同盐度的酶，并可制备较低分子量的寡糖。因此，ALYYA可以成为工业应用的有效工具。