棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)和蓝身大斑石斑鱼(E. tukula)均为我国重要的海水经济鱼类，其市场需求大，经济价值高。近年来，因人类滥捕行为，野生石斑鱼资源大幅减少，而人工养殖石斑鱼产业的快速发展在一定程度上缓解了野生资源捕捞的压力。渔业统计年鉴相关数据显示，我国石斑鱼养殖总量在2018年升至159, 579 t，广东、海南、福建三省养殖量分别位居前三，在石斑鱼总养殖量中占97.10%。在石斑鱼人工养殖产业快速发展的同时，面临着一些问题亟待解决，如出苗率低、生长周期长、病害等问题。因此，将杂交育种技术运用到石斑鱼育种中，旨在筛选出兼具双亲优势性状的石斑鱼新品种。本课题组利用棕点石斑鱼卵和蓝身大斑石斑鱼冷冻精子杂交获得杂交品种"金虎斑"，现已完成对金虎斑发育、生长及与其亲本在形态差异等方面的研究(田永胜等, 2019; 吴玉萍等, 2019)，但对其分子水平的遗传差异研究尚未见报道。

微卫星标记(microsatellite)，也称"简单重复序列"(simple sequence repeats, SSR)或"短串联重复序列"(short tandem repeats, STRs)，该DNA片段由长度为1~6个核苷酸的简单序列重复串联组成。微卫星标记具有多态性高、共显性、分析过程快等优点，在群体遗传结构分析、遗传连锁图谱构建、遗传多样性鉴定和亲鱼选择等方面，均具有应用价值(Chistiakov et al, 2006)。微卫星在石斑鱼属分子水平上的遗传多样性研究应用也很广泛，刘丽等(2008)利用13对多态微卫星引物对我国南海海域青石斑(E. awoara)进行遗传多样性分析，发现其遗传多样性较高，但种群结构和种质资源受到一定程度的人为干扰。陈省平等(2012)利用7对微卫星引物对7个赤点石斑鱼(E. akaara)群体进行分析，显示7个群体皆有较丰富的遗传多样性，且群体间存在遗传差异；Dong等(2007)通过微卫星分析发现，鞍带石斑鱼(E. lanceolatus)、斜带石斑鱼(E. coioides)、棕点石斑鱼等9种石斑鱼的遗传多样性处于中等水平。

目前，微卫星的检测方法主要有DNA指纹图谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法、毛细管电泳法、PCR-RFLP检测法和多重PCR微卫星荧光标记全自动基因组扫描法(管峰等, 2004)。微卫星荧光标记技术利用FAM、HEX和TAMRA三种不同颜色荧光染料中的一种标记微卫星引物，对PCR产物可进行电泳检测，利用软件图像分析和等位基因片段大小计算，此方法准确率更高，更加快速简单。本研究从分子水平利用微卫星荧光标记技术对金虎斑的遗传多样性进行分析，旨在为石斑鱼杂交育种、规模化繁殖以及新品种培育提供遗传学依据。

1 材料与方法 1.1 样品采集

实验用蓝身大斑石斑鱼与金虎斑取自山东莱州明波水产有限公司，棕点石斑鱼取自海南恒昌生物科技有限公司。每个群体随机挑选30尾，剪鳍条保存于无水乙醇中，置于–20℃冰箱备用。

1.2 DNA提取

采用常规酚–氯仿法提取3种石斑鱼样品基因组DNA (唐江等, 2018)，DNA纯度和浓度分别利用1%的琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白分析仪检测。根据所得检测结果计算稀释倍数，稀释DNA浓度至50 ng/μL，置于–20℃冰箱保存备用。

1.3 微卫星引物、PCR扩增和荧光检测 1.3.1 微卫星引物

本研究所用52对微卫星引物均从石斑鱼近缘物种[夏威夷石斑鱼(E.quernus)、赤点石斑鱼、鞍带石斑鱼、小鳞喙鲈(Mycteroperca microlepis)]开发的引物中选取，由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，从中筛选出28对有稳定扩增产物且具清晰条带的引物。

1.3.2 PCR扩增

PCR反应体系20 μL：DNA模板1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，正反向引物各0.5 μL，荧光标记引物(6-FAM、HEX或TAMRA) 0.2 μL，ddH₂O 7.8 μL。扩增反应在Veriti PCR仪上完成。PCR反应程序：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，退火30 s (采用降落PCR方法，退火温度由65℃降到55℃，分别为65℃、63℃、60℃、58℃和55℃，前4个温度各2个循环，55℃退火29个循环)，72℃延伸30 s，共36个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。

1.3.3 荧光检测

利用琼脂糖凝胶电泳对荧光PCR产物进行鉴定，筛选出条带单一且大小相符的引物，对照DNA Marker浓度进行定量，将所有产物稀释至相同的浓度范围，在ABI 3730 XL测序仪上进行自动荧光检测。使用GeneMarker软件，导入基因分析仪的原始结果文件，根据位点信息设置分析模板；使用GeneScan 500 LIZ Size Standard进行数据分析。

1.4 数据分析

利用Popgene32软件计算20个微卫星位点和3种石斑鱼群体的等位基因数(N_a)、有效等位基因数(N_e)、观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)以及群体间Nei氏遗传距离、群内近交系数(F_is)、遗传分化系数(F_st)和基因流(N_m)，基于Botstein等(1980)建立的公式，借助Excel 2010计算多态信息含量(PIC)：

${\rm{PIC}} = 1 - \sum\limits_{i = 1}^n {P_i^2} - \sum\limits_{i = 1}^{n - 1} {\sum\limits_{j = i + 1}^n {2P_i^2P_j^2} } $

式中，P_i、P_j分别为第i个和第j个等位基因频率，n为等位基因数。

参考群体间Nei´s标准遗传距离(Nei, 1973)，采用算术平均数的非加权成组配对法(UPGMA)，利用MEGA 4.0软件构建3个石斑鱼群体的系统进化树。

2 结果与分析 2.1 SSR位点多态性分析

对筛选的28对微卫星引物进行相关测定，其中20对引物的峰图清晰、等位基因数较多、多态性较好(表 1)，可用于后续遗传多样性分析。20个微卫星位点在蓝身大斑石斑鱼、棕点石斑鱼及金虎斑中均可扩增，片段大小为106~424 bp，各位点等位基因数有所区别，每个位点3~19个不等，平均等位基因为10.75个。观测杂合度、期望杂合度平均值分别为0.443 3、0.674 9。An22位点属于低度多态位点(PIC < 0.25)，此外，除An11、An32、CX-6和CX-20位点为中度多态位点(0.25 < PIC < 0.5)外，其他位点皆属于高度多态位点(PIC > 0.5)，平均多态信息含量为0.638 6 (表 2)。

2.2 遗传多样性分析

由表 3可以看出，蓝身大斑石斑鱼、棕点石斑鱼和金虎斑的平均有效等位基因数分别为2.412 8、4.367 9和3.370 6。棕点石斑鱼的观测杂合度、期望杂合度在3种石斑鱼群体中均为最高，分别为0.474 9、0.701 3，金虎斑次之(0.473 6、0.603 2)，蓝身大斑石斑鱼的观测杂合度、期望杂合度最低，分别为0.385 5、0.462 4。3种石斑鱼群体中，棕点石斑鱼的平均多态信息含量最高(0.645 3)，高度多态性位点占75%；蓝身大斑石斑鱼的平均多态信息含量最低(0.491 9)，中度、高度多态位点分别占30%、40%；杂交子代金虎斑的平均多态信息含量为0.555 1，高度多态位点占60%。上述结果表明，本研究所选用的20对微卫星引物可作为蓝身大斑石斑鱼、棕点石斑鱼及杂交子代金虎斑的有效标记，可用于3类石斑鱼群体相应遗传多样性分析。

2.3 Hardy-Weinberg平衡检验

借助Hardy-Weinberg平衡来检验3类石斑鱼的20个位点。结果显示，蓝身大斑石斑鱼、棕点石斑鱼、金虎斑分别有7、13、9个位点表现出极显著偏离哈迪温伯格平衡(P < 0.01)。此外，蓝身大斑石斑鱼的An22、CX-6和CX-20位点呈现单态(表 4)。

2.4 群体间遗传分化分析

表 5为3种石斑鱼群体遗传分化结果。由表 5可知，群内近交系数、总群体近交系数平均值分别为0.228 0、0.344 1，有5个位点的杂合子过剩(F_is < 0)，15个位点的杂合子缺失(F_is > 0)；遗传分化系数在不同位点差异较大，其变化范围在0.024 6~0.529 0之间，平均值为0.150 4，表明3种石斑鱼之间的遗传变异中有15.04%存在于各群体之间，而多数遗传变异源自个体。在F_st值的基础上，估算石斑鱼群体间的基因流平均值为1.411 9。

2.5 遗传距离、遗传相似系数与聚类分析

表 6所示为3类石斑鱼群体间的遗传相似系数以及遗传距离情况。从表 6可以看出，杂交子代金虎斑与母本棕点石斑鱼的遗传距离最近(0.117 5)，且遗传相似系数最高(0.889 2)。聚类分析(图 1)表明，母本棕点石斑鱼和杂交后代金虎斑聚为一支，父本位于最外支。上述结果表明，金虎斑与母本棕点石斑鱼的亲缘关系更近。

3 讨论 3.1 SSR荧光标记技术的应用

微卫星荧光标记–半自动基因分型技术实现了SSR标记与高效、自动化技术的结合，近年来得到广泛应用及改进。吕锋骅等(2010)利用SSR荧光标记技术对我国南方海域4种石斑鱼的遗传多样性及系统发生关系进行研究，发现4类石斑鱼的遗传多样性均很丰富，且分化关系明确。本研究通过SSR荧光标记技术分析了20对引物在3种石斑鱼群体中的多态性，结果表明，20个微卫星位点的平均等位基因数为10.75，平均多态信息含量为0.638 6，20个位点中存在15个高度多态位点，可用于3类石斑鱼遗传多样性分析。

3.2 石斑鱼的遗传多样性

通过有效等位基因数，可了解群体的遗传变异状况。本研究中，相比等位基因数，各位点的有效等位基因数均偏小，蓝身大斑石斑鱼、棕点石斑鱼及金虎斑的平均有效等位基因数分别为2.412 8、4.367 9和3.370 6，杂交子代有效等位基因数高于父本蓝身大斑石斑鱼，低于母本棕点石斑鱼，基因杂合性介于亲本之间。

通过基因杂合度，能够了解群体遗传变异具体程度，可有效衡量群体遗传变异情况(Ott, 1999)，该值愈大，说明遗传多样性愈高，种群适应环境改变以及自然选择的能力愈强(Beardmore et al, 1997)。通过微卫星标记法，Zeng等(2008)围绕鞍带石斑鱼开展了遗传多样性分析，其观测杂合度和期望杂合度范围分别为0.200~0.733和0.185~0.801；董秋芬等(2007)的研究结果表明，9种石斑鱼平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为0.589 8、0.472 8；尹绍武等(2008)分别对海南近海的点带石斑鱼野生以及养殖群体开展了遗传变异研究，研究发现，在杂合度上，野生与养殖群体无明显不同(P=0.637 > 0.05)，二者种质资源均较好。本研究结果显示，杂交子代金虎斑平均观测杂合度(0.473 6)与母本棕点石斑鱼(0.474 9)近似，而比父本蓝身大斑石斑鱼(0.385 5)高，存在部分遗传变异。

多态信息含量是等位基因频率和数目变化的函数，其范围在0~1之间，通常认为PIC > 0.5为高度多态，若0.25 < PIC < 0.5，则为中度多态，PIC < 0.25为低度多态(Botstein et al, 1980)。本研究中，蓝身大斑石斑鱼、棕点石斑鱼及二者杂交子代金虎斑平均多态信息含量分别为0.491 9、0.645 3和0.555 1，棕点石斑鱼与金虎斑均表现为高度多态，父本蓝身大斑石斑鱼为中度多态，金虎斑多态性高于父本、低于母本，与同是石斑鱼杂交子代的虎龙杂交斑(0.5426)(周翰林等, 2012)、云龙石斑鱼(0.544 6或0.481 8) (唐江等, 2018; 李炎璐等, 2018)的多态性相近，具有一定杂交优势。

哈迪–温伯格平衡定律主要反映群体中等位基因频率和基因型频率之间的关系。本研究3种石斑鱼群体多个位点均处于不平衡状态，尤其是棕点石斑鱼有13个基因座存在不平衡现象，造成这种现象的原因可能是金虎斑为人工繁殖而来的子一代，亲本经过人工选择、数量有限，限制了基因间的交流(唐江等, 2018)。因此，在选育过程中，应该避免形成封闭群体，扩大亲本选择范围。

3.3 群体遗传结构

影响种群遗传结构的因素有生境、地理隔离、种群瓶颈、基因流和选择等，物种适应环境变化主要通过必要的遗传变异，对广布种的种群遗传学研究能够发现种群的遗传隔离和潜在的种的分化(全迎春等, 2006)。本研究结果中，3种石斑鱼群体平均遗传分化系数是0.150 4，群体间遗传分化较大(F_st= 0.15~0.25)；基因流是1.411 9，能够有效抑制因遗传漂变所致的种群间分化(Wright, 1978)。群体间存在遗传分化的主要原因是基因流的存在，本研究虽然存在基因流，但群体仍出现较大分化，推测可能与亲本的人工选择有关(Shapiro et al, 1969)。

群体间遗传分化和变异可以通过遗传距离来反映，群体间遗传距离愈大，亲缘关系愈远，遗传分化愈大。本研究中，父本蓝身大斑石斑鱼与母本棕点石斑鱼的遗传距离最远(0.716 6)，杂交子代金虎斑与母本之间的遗传距离最近(0.117 5)。亲本之间的遗传距离是衡量亲本间异质性的一个重要指标，且遗传距离与杂种优势呈正相关(Dong, 1998)，遗传育种方面，为防止盲目进行杂交实验，可以通过遗传距离的大小预测杂交组合的优劣性(孙少华等, 2000)。

本研究利用20对微卫星标记，对蓝身大斑石斑鱼、棕点石斑鱼和金虎斑的遗传多样性进行研究，发现金虎斑存在较为丰富的遗传多样性表现，对环境的适应能力较好，亲缘关系与母本更近，体现出一定杂交优势。