主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)是编码主要组织相容性抗原的基因群的统称，在脊椎动物抵抗疾病和免疫应答过程中发挥重要作用(冯美惠等, 2017)。MHC类分子主要分为MHCⅠ和MHCⅡ，是由MHC基因编码的一类细胞表面转膜蛋白，主要参与抗原呈递(于文博等, 2017; 童正飞等, 2020; 徐田军等, 2008)。Hashimoto等(1990)成功扩增鲤鱼(Cyprinus carpio)的部分MHC基因序列。目前，关于水产动物MHC研究主要集中在鱼类，对中华鳖(Pelodiscus sinensis)MHC的研究还较少。

中华鳖是我国重要的名特优养殖品种之一，具有较高的营养价值及药用价值，近年来创造了巨大的经济效益(彭娜等, 2018; 陈贞年等, 2020)。目前，高度集约化养殖、种质退化及抗生素滥用等导致中华鳖疾病频发，治疗仍主要是通过化学药物，易导致水产品药物残留及产生抗药性(尹梦雅, 2018)。但关于中华鳖免疫基因的遗传分析和抗病性研究却相对较少。本研究利用RACE技术克隆中华鳖MHCⅡα基因cDNA全长，并以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为刺激物，分析中华鳖MHCⅡα基因在组织中的表达特征，旨在了解中华鳖免疫基因及免疫应答，为中华鳖病害免疫防治和培育抗病新品系等提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验中华鳖购自湖南河洲甲鱼养殖基地，选取同批次、体重为100 g左右的健康中华鳖幼鳖60只，随机分为2组，每组设3个平行，每个平行10只，分别饲养于水温为(26±1)℃的容器中。暂养稳定后，实验组腹腔注射0.1 mL浓度为10⁸ CFU/mL的嗜水气单胞菌，对照组注射0.1 mL生理盐水。分别取注射后6 h、12 h、1 d、3 d和5 d中华鳖的肝脏、脾脏、肾脏及肠道4种组织于加有RNA保护液的1.5 mL EP管中，置于–20℃保存备用。同时，选取健康中华鳖幼鳖3只，不做处理，分别取其肝脏、脾脏、肾脏、肠道、心脏、肌肉、脑及胃组织于1.5 mL EP管，液氮冷冻后，–80℃保存。

1.2 主要药品与试剂

RNA提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购于Omega，SMARTer RACE 5′/3′ Kit、TA克隆相关试剂和TB Green Premix Ex TaqⅡ购自大连宝生物工程(TaKaRa)公司，2×TransTaq-T PCR superMix (+dye) (北京全式金生物)和cDNA合成试剂盒购自Thermo Scientific公司。

1.3 实验方法 1.3.1 引物合成

根据本课题组获得的中华鳖转录组数据，利用Primer 6.0软件设计特异性引物(MHCHX-F, MHCHX-R)，克隆获得核心序列，并根据核心序列设计特异性引物(MHCⅡ-F, MHCⅡ-R)，进行后续基因全长的扩增，荧光定量PCR以GAPDH为内参基因，扩增引物为GAPDH-F和GAPDH-R。引物(表 1)由上海铂尚生物科技有限公司合成。

1.3.2 RNA提取及cDNA的合成(qPCR)

采用RNA提取试剂盒(Omega)提取各组织RNA，实验操作按照试剂盒说明书进行，得到各组织RNA后进行琼脂糖凝胶电泳并使用BioSpectrometer Basic核酸蛋白仪(Eppendorf)检测其完整度、浓度及相关比值，选择OD_{260 nm/280 nm}值在1.8~2.0之间且条带完整性良好的RNA用于后续cDNA的合成。

1.3.3 中华鳖MHCⅡα基因cDNA全长克隆

根据SMARTer RACE cDNA amplification kit(TaKaRa)说明书合成5′和3′末端cDNA模板，并按照要求进行稀释。按照说明书分别进行MHCⅡα基因的5′或3′端序列的扩增。PCR体系：5′或3′端cDNA模板2 μL，10×UPM引物5 μL，5′或3′端扩增引物1 μL，ddH₂O 17 μL，2×TransTaq-T PCR SuperMix (+dye) 25 μL。反应均为25个循环：94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min。扩增所得目的PCR条带用凝胶回收试剂盒回收，连接pMD18-T Vector载体后测序。

1.3.4 生物信息学分析及系统进化树构建

使用Chromas软件将测序结果中的载体序列去除，利用DNAMAN 6.0软件将克隆片段拼接，得到中华鳖MHCⅡα基因全长序列，通过NCBI数据库进行对比分析。利用ExPASy translate在线工具预测编码的氨基酸序列，利用Protparam在线软件预测蛋白质理化性质，利用SMART及SignalP 5.0等在线软件预测蛋白质结构，使用SWISS-MODEL在线软件预测蛋白质三级结构。运用MEGA-X软件，采用邻位相接法(NJ法)构建氨基酸系统发育树，并设置Bootstrap重复1000次，计算各分支的置信度。

1.3.5 荧光定量PCR

1.3.2中合成的cDNA稀释5倍后，取1 μL作为荧光定量PCR模板，设置3个重复。GAPDH为内参基因，内参基因引物采用表 1中的GAPDH-F和GAPDH-R，荧光定量引物使用MHCⅡ-F和MHCⅡ-R。运用CFX96荧光定量PCR仪(Bio-Rad)进行荧光定量PCR：TB Green Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa) 5 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板1 μL以及3.2 μL ddH₂O。反应程序：95℃ 30 s；40个循环的95℃ 15 s，60℃ 20 s。采用CFX manager 3.1 (Bio-Rad)软件收集和分析基因表达量数据，并采用GraphPad Prism 7软件绘图。

2 结果与分析 2.1 中华鳖MHCⅡα基因cDNA全长序列分析

通过RACE技术扩增获得了中华鳖MHCⅡα基因cDNA全长序列(图 1)，全长为1296 bp (GenBank登录号: MT834970)，其开放阅读框为807 bp，共编码268个氨基酸，利用SMART软件预测蛋白结构域，发现MHCⅡα氨基酸序列包括信号肽(1~37)、Ⅱ类组织相容性抗原α结构域(44~125)、IGc1结构域(143~214)及跨膜结构域(230~252) 4个功能结构域(图 2)。ProtParam tool预测MHCⅡα蛋白分子式为C₁₃₄₅H₂₀₈₁N₃₆₃O₃₈₅S₈，分子量为29.75 kDa，等电点为5.67，总平均亲水性(GRAVY)为–0.220。

2.2 中华鳖MHCⅡα系统进化树的构建

在NCBI网站中选取人(Homo sapiens, CAA25142.1)、黑猩猩(Pan troglodytes, XP_003950844.1)、西部锦龟(Chrysemys picta bellii, XP_005315098.1)、澳洲棕蛇(Pseudonaja textilis, XP_026577346.1)、鸮鹦鹉(Strigops habroptila, XP_030366648.1)、鹌鹑(Coturnix japonica, XP_032297688.1)、白梭吻鲈(Sander lucioperca, XP_ 031149428.1)及红鳍东方鲀(Takifugu rubripes, XP_ 029695924.1)共8种动物的已知或预测MHCⅡα氨基酸序列，利用MEGA-X软件构建NJ系统进化树，发现中华鳖与西部锦龟属于同一分支(图 3)，亲缘关系较近。

2.3 中华鳖MHCⅡα的蛋白质三级结构

使用SWISS-MODEL在线软件预测MHCⅡα的蛋白质三级结构(图 4)。SWISS-MODEL预测结果显示，匹配的模板与MHCⅡα氨基酸序列一致度为60.67%，GMQE值为0.59，QMEAN值为–2.08，说明MHCⅡα的蛋白质三级结构预测结果可信。

2.4 MHCⅡα mRNA组织表达分析

通过检测MHCⅡα mRNA在健康中华鳖不同组织中的相对表达量，分析其组织表达差异。结果显示，MHCⅡα mRNA在中华鳖的脾、心、肝及肠组织中表达水平较高，显著高于肾、肌肉、脑及胃组织(P < 0.05)，在肌肉组织中表达量最低(图 5)。

2.5 MHCⅡα mRNA的时空表达

腹腔注射嗜水气单胞菌后，分析中华鳖的肝、脾、肠及肾组织在不同时间点(6 h、12 h、1 d、3 d及5 d)的MHCⅡα mRNA相对表达水平(图 6)。MHCⅡα mRNA在肝、脾、肠及肾组织中均出现显著上调表达。各组织MHCⅡα mRNA相对表达量均在1 d时最高。但在脾、肠及肾3个组织的相对表达结果中有下调表达的时期，在脾的表达量在12 h及3 d时呈下调表达，在肠的表达量在3 d时呈下调表达，在肾的表达量在12 h内呈下调趋势以及3 d时呈下调表达。

3 讨论

MHC基因在脊椎动物中广泛存在，且大多数位于同一条染色体上，具有高多态性，在免疫抗病及遗传育种等研究中备受青睐。根据表达产物类型，MHC基因目前分为MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ和MHC-Ⅲ，都由多基因座组成，但在表达组织类型、结构组成、刺激的T细胞类群及多态性演化上均有差异(庞纪彩等, 2012; 林友福等, 2018; Lindqvist et al, 2005)。MHC-Ⅱ类基因被命名为MHC-D，并划分为MHC-DR、MHC-DQ、MHC-DP等亚区(亢孝珍等, 2014)。目前，水产动物MHC-Ⅱ基因研究已较为广泛，大多数研究主要集中在鱼类，现已得到草鱼(Ctenopharyngodon idella)、斑马鱼(Brachydanio rerio var)、军曹鱼(Rachycentron canadum)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)等的MHC-Ⅱ类基因cDNA全长(van Erp et al, 1996; Hideki et al, 1992; 茅莉娜等, 2010; Prapansak et al, 2004; Zhang et al, 2006)，而关于龟鳖类水产动物MHC-Ⅱ基因的研究较少，且中华鳖MHC基因家族尚未有相关报道。本研究通过RACE技术成功获得中华鳖MHCⅡα基因cDNA全长1296 bp，编码268个氨基酸，通过预测蛋白结构域，发现MHCⅡα存在明显的信号肽序列、Ⅱ类组织相容性抗原α结构域、IGc1结构域及跨膜结构域。通过建立氨基酸系统进化树分析发现，中华鳖MHCⅡα基因与西部锦龟亲缘关系更近，而与其他爬行类、哺乳类、鸟类及鱼类亲缘关系较远。

MHC与免疫系统有密切关系，其编码产物分布于细胞膜上，参与抗原呈递，与水产动物、家禽及哺乳动物的遗传多样性、抗病性及生产性状等相关(Ruan et al, 2016; Johannes et al, 2013; Zhou et al, 2003; 侯卓成等, 2002; Katarzyna et al, 2012; Łopucki et al, 2016; Lindqvist et al, 2005)。MHC-Ⅱ类基因的组织表达具有差异性(Liu et al, 2002)。本研究荧光定量PCR结果显示，MHCⅡα基因在健康中华鳖所检测的8个组织中均有表达。在中华鳖感染后，实验组肝脏、脾脏、肠道及肾组织MHCⅡα mRNA的相对表达量均出现显著上调，且均在1 d时达到最高。肝脏、脾脏、肠道及肾均与免疫密切相关，据此推测，中华鳖MHCⅡα基因参与了免疫调节。

本研究首次获得了中华鳖MHCⅡα基因的全长，并对该基因序列及结构、所编码的氨基酸序列及结构特点进行分析，构建相关系统发育树，丰富了水产动物中龟鳖类MHC-Ⅱ类基因库，为进一步探索中华鳖MHCⅡα基因免疫调控机制提供了理论依据，也有利于促进中华鳖疾病防控及抗病育种的发展。