我国大约有140多种海参，在辽宁、山东、福建省有丰富的资源(王丽丽等, 2019)，可食用的种类有20多种，其中，在黄海和渤海区域的刺参食用品质及营养价值最高(李忠清等, 2016)。海地瓜(Acaudina molpadioides)是海参的一个种类，属棘皮动物门(Echinodermata)、海参纲(Holothuroidea)、芋参目(Molpadida)、海地瓜属(Acaudina)，因其外观形似地瓜，故被称为海地瓜；其体壁纤维粗壮，食用品质较差，被列为中国海参市场上的低值海参(赵丽等, 2019)。海地瓜营养成分不亚于刺参(Stichopus japonicus)(伏纬华等, 1991)，其含有蛋白质、多糖、皂苷等多种生物活性物质(王方国等, 1998)。海参胶原肽是海参胶原蛋白在一定条件下螺旋结构发生分解后的产物，通常采用酶法制备(王晴等, 2020)，具有抗氧化、抗炎、降血压和降糖等功效(Ratih et al, 2018)。

双螺杆挤压技术是一种高温高压加工技术，通过螺杆转动，推动挤出物料，在摩擦力和剪切力的作用下，物料发生破碎、捏合、混炼、杀菌、成型等物理和生化反应，最后通过不同的模口形成不同形态的“熔化物”(刘鹏等, 2018; 王旭等, 2020)。研究表明，挤压加工使蛋白质的酶作用位点暴露，多肽得率有所提升(张旭娜等, 2017)，提高多肽的生物活性(王瑞斌等, 2019)。侯殿志等(2020)研究发现，挤压小米多肽与发酵小米多肽相比有更强的血管紧张素转换酶(angiotensin-I-converting enzyme, ACE)抑制活性和抗氧化能力，并能提高蛋白质消化率。齐宝坤等(2016)利用双螺杆挤压膨化预处理制备豆粕多肽，制得的多肽抗氧化能力得到提升。Ralston等(2008)利用亚硫酸钠(Na₂SO₃)和半胱氨酸处理蛋白质，使其二硫键断裂，可提高溶解度。苏笑芳(2018)通过Na₂SO₃诱导大豆分离蛋白原料并进行双螺杆挤压，使蛋白原料中的二硫键断裂，游离巯基含量增多，蛋白质聚集程度降低。目前，尚未见利用双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理技术制备海洋动物蛋白多肽的研究报道。

为解决海地瓜利用率低、肽提取率低的问题，本文以海地瓜为原料，研究了双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理对海地瓜多肽提取率和抗氧化活性的影响，以期为海地瓜开发利用及其多肽加工新工艺提供参考。

1 实验与方法 1.1 材料与试剂

海地瓜干品(山东帆歌海洋食品有限公司)；亚硫酸钠、乙腈和三氟乙酸(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇(分析纯，广东西陇化工股份有限公司)；牛血清白蛋白生化试剂(沪试级BR)、福林酚(分析纯)、胰蛋白酶和DPPH(1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼)(北京索莱宝科技有限公司)；大孔吸附树脂(DA201-C)(河南郑州勤实科技有限公司)；超氧阴离子试剂盒(南京建成生物科技有限公司)。

1.2 仪器与设备

G32型双螺杆挤压机(山东济南盛润机械公司)；DFY-500D高速粉碎机(浙江温岭市林大机械有限公司)；DHG-9146鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；HH-4恒温水浴锅(江苏金坛市科析仪器有限公司)；GL-20G-Ⅱ-D台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；Ultimate 3000高效液相色谱仪(DIONEX公司，美国)；T6新世纪-H紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.3 实验方法 1.3.1 样品前处理

将海地瓜干品充分泡发，洗净去泥沙，剪成1 cm³左右的碎块，于70℃的干燥箱中烘干至恒重，取出，用粉碎机粉碎成大小均匀的粉末，过60目筛，装入密封袋中于–20℃中冷藏备用。以该方法制备的海地瓜干粉作为空白对照，记为CK组。

1.3.2 双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理海地瓜工艺

参考苏笑芳(2018)方法略作修改，以1.3.1制备的海地瓜干粉为原料，分别用0 g/100 g、1.5 g/100 g、3.0 g/100 g干基原料的亚硫酸钠溶于去离子水，调节海地瓜干粉水分含量至50%，并于4℃条件下平衡水分，过夜。设置螺杆转速为34 Hz，机筒温度为140 ℃，喂料速度为18 Hz，进行挤压加工，挤出物二次烘干并粉碎过筛，装袋备用。以该方法制备的海地瓜干粉为双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理组。

1.3.3 海地瓜多肽制备工艺

CK组和双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理海地瓜多肽制备工艺：以制备的海地瓜干粉→酶解→醇沉除多糖→旋蒸浓缩→冷冻干燥备用。酶解工艺条件：选用胰蛋白酶，pH值为8，酶解温度为37℃，酶解时间为4 h，加酶量为10, 000 U/g，料液比1∶120。

1.3.4 多肽提取率的测定

参考Lowry等(1951)的方法，取适量酶解液，加入10%的三氯乙酸(檀志芬等, 2005)，使大分子蛋白质沉淀，离心后取上清液，稀释一定倍数，取1 mL按制作标准曲线方法操作，于640 nm处测定OD值，根据标准曲线和以下公式计算多肽提取率。

$ \text { 多肽提取率 }(\%)=\frac{C \times V \times d}{m} \times 100 $

(1)

式中，C为测定样品的质量浓度(μg/mL)；V为测定时取用的体积(mL)；d为稀释倍数；m为样品质量(g)。

1.3.5 游离巯基含量的测定

参考Anderson等(2000)的方法，准确称取30 mg样品，加入1.0 mL A液(pH为8.0的0.2 mol/L Tris-HCl，8 mol/L的尿素，1% SDS和3 mmol/L EDTA)，迅速混匀，25℃振荡水浴1 h，加入0.1 mL B液(pH 8.0的0.2 mol/L Tris-HCl和10 mmol/L DTNB)，继续25℃振荡水浴1 h，12, 000 r/min离心15 min，取上清液，于412 nm处测定OD值，并作空白对照。

1.3.6 蛋白质溶解度的测定

参考Wu等(2012)的方法，称取1 g样品，加20 mL蒸馏水，振荡混匀，95℃水浴20 min，取出后补蒸馏水至液面线位置，冷却，4500 r/min离心20 min，福林酚法测定上清液中蛋白质含量。根据公式计算出样品的蛋白质溶解度，计算公式如下：

$ \text { 蛋白质溶解度 }(\%)=\frac{m_{\text {测 }}}{m} \times 100 $

(2)

式中，m_测为上清液中蛋白质含量(mg)；m为样品中总蛋白质含量(mg)。

1.3.7 海地瓜多肽的分离纯化方法

参照孟春英(2016)和王颖(2015)的方法，选择DA201-C型大孔吸附树脂纯化双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理海地瓜多肽粗提物。实验条件：柱规格为1.5 cm×30.0 cm，样品浓度为10 mg/mL，上样量为10 mL，洗脱速度为4 mL/min，用25%、50%、75%和95%的乙醇进行梯度洗脱，于220 nm处测定OD值，收集洗脱峰旋转浓缩，冻干备用。

1.3.8 海地瓜多肽分子量的测定

参照朱翰林等(2020)的方法，色谱柱选用TSK-GEL G2000SW_XL (7.8 mm×300.0 mm, 5 μm)，流动相为乙腈∶超纯水∶三氟乙酸(35∶65∶0.1)，流速为0.8 mL/min，进样量为10 μL，样品浓度为2 mg/mL，检测波长为220 nm。制作标准曲线的标准品：细胞色素C (12, 400 Da)，抑肽酶(6500 Da)，维生素B₁₂ (1355 Da)，谷胱甘肽(613 Da)和L-精氨酸(174 Da)，以洗脱体积和相对分子质量的对数(lg MW)作图得到的相对分子质量校正曲线及方程：y= –0.268 5x+5.641 6，R= 0.999 6。

1.3.9 海地瓜多肽DPPH自由基清除率的测定

参照赵梦倩等(2020)的方法，取各浓度的样品2.0 mL，加入2.0 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液，漩涡振荡混匀，室温条件下避光反应30 min，于517 nm处测定OD值，记为A_s。取各浓度的样品2.0 mL，加入2.0 mL的无水乙醇，记为A。取2.0 mL无水乙醇，加入2.0 mL的DPPH溶液，记为A₀。DPPH自由基清除率计算公式如下：

$ \mathrm{DPPH} \text { 自由基清除率 }(\%)=\left(1-\frac{A_{s}-A}{A_{0}}\right) $

(3)

1.3.10 海地瓜多肽超氧阴离子自由基清除率的测定

根据南京建成超氧阴离子试剂盒的说明书，对纯化海地瓜多肽超氧阴离子自由基清除率进行测定。

1.3.11 不同纯化组分海地瓜多肽对LO₂细胞存活率的影响

参照霍嘉颖等(2018)的方法，采用MTT法测定纯化组分Ⅰ和纯化组分Ⅱ海地瓜多肽对人正常肝细胞(human normal liver cell, LO₂)细胞存活率的影响。取对数生长期细胞，以1.5×10⁴ cells/孔的密度接种于96孔板，每孔100 μL，于培养箱中培养24 h后加入不同浓度的纯化组分Ⅰ和纯化组分Ⅱ海地瓜多肽，空白对照组不作处理。培养箱中继续培养24 h后弃去培养液，每孔加入100 μL的0.5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h后避光加入150 μL的DMSO溶液，振荡10 min，在酶标仪上测定490 nm吸光值，其中，空白对照组记为OD₀，样品组为OD₁，按以下公式计算细胞存活率。

$ \text { 细胞存活率 } / \%=\frac{O D_{1}}{O D_{0}} \times 100 $

(4)

1.3.12 H₂O₂诱导LO₂细胞氧化损伤模型的建立

按照1.3.11方法培养细胞，设空白对照组(不做任何处理)，损伤组(不同浓度的H₂O₂溶液处理)于培养箱中培养4 h后弃去培养液，每孔加入100 μL的0.5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h后避光加入150 μL的DMSO溶液，振荡10 min，在酶标仪上测定490 nm处吸光值，按公式(1~4)计算细胞存活率。

1.3.13 不同纯化组分海地瓜多肽对LO₂细胞氧化损伤保护作用

按照1.3.11方法培养细胞，设空白对照组(不做任何处理)，损伤组(H₂O₂处理)和样品组(不同浓度的纯化组分Ⅰ溶液或纯化组分Ⅱ溶液+H₂O₂)，于培养箱中培养24 h后，加入终浓度为80 μmol/L的H₂O₂，于培养箱中继续培养4 h，弃去培养液，加入100 μL的0.5 mg/mL MTT溶液，孵育4 h后避光加入150 μL的DMSO溶液，振荡10 min，在酶标仪上测定490 nm处吸光值，按公式(1~4)计算细胞存活率。

1.4 数据处理

每个实验均独立重复3次以上，使用Microsoft Excel 2016和Statistics 17等软件对数据进行处理，使用Adobe Photoshop软件对图像进行处理，实验结果以x±s表示，P < 0.05差异表示具有统计学意义。

2 结果与分析 2.1 双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理对海地瓜多肽提取率、游离巯基含量和蛋白质溶解度的影响

海地瓜的多肽提取率、蛋白质溶解度和游离巯基含量见表 1，CK组多肽提取率为(49.47±0.26)%，游离巯基含量为(5.00±0.05)%，蛋白质溶解度为(23.81± 0.28)%。在双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理组中，当Na₂SO₃添加量为0时，与CK组相比，多肽提取率显著增加了(2.52±0.01)% (P < 0.05)，游离巯基含量增加了(7.15±0.05)%，蛋白质溶解度增加了(1.41±1.06)%；当Na₂SO₃添加量为1.5%时，与CK组相比，多肽提取率显著增加了(4.24±0.48)% (P < 0.05)，游离巯基含量显著增加了(21.64±0.03)% (P < 0.05)，蛋白质溶解度增加了(1.96±1.25)%；当Na₂SO₃添加量为3.0%时，与CK组相比，多肽提取率显著增加了(7.65±0.35)%，游离巯基含量显著增加了(105.32±0.01)%，蛋白质溶解度显著增加了(4.91±0.15)%。

双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理提高了海地瓜多肽提取率，可能是海地瓜胶原蛋白在Na₂SO₃作用下蛋白质二硫键断裂并发生解聚，游离巯基含量增多，使得蛋白质溶解度提高，再经过双螺杆挤压，海地瓜胶原蛋白在剪切力和摩擦力的作用下，蛋白质分子展露出更多的酶作用位点，使得酶能充分作用于底物，进而加强酶解效果，从而使多肽提取率得到提升。根据上述结果，双螺杆挤压辅助3.0% Na₂SO₃处理组的多肽提取率最高，选用该组进行后续分离纯化实验。

2.2 双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理海地瓜多肽的分离纯化

海地瓜粗肽的分离纯化结果见图 1，样品经25%、50%、75%和95%乙醇梯度洗脱后得到2个组分，经25%乙醇洗脱得到的组分命名为纯化组分Ⅰ，经50%乙醇洗脱得到的组分命名为纯化组分Ⅱ。以上2个组分海地瓜多肽分别经旋蒸浓缩后冻干备用。

2.3 纯化海地瓜多肽相对分子质量的分布分析

纯化组分Ⅰ和纯化组分Ⅱ的高效液相色谱图见图 2，根据纯化组分Ⅰ和纯化组分Ⅱ的保留时间，由相对分子质量校正曲线的回归方程y= –0.268 5x +5.641 6，R=0.999 6计算得出，纯化组分Ⅰ中相对分子质量在1000~3000 u范围内的多肽占相对含量的(61.97±1.71)%，相对分子质量在1000 u以内的多肽占相对含量的(37.49±2.67)%；纯化组分Ⅱ中的多肽相对分子质量大多在1000 u以内。

2.4 海地瓜多肽体外抗氧化能力分析 2.4.1 海地瓜多肽DPPH自由基清除率的分析

对CK组、双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理组及其分离纯化后制得的纯化组分Ⅰ和纯化组分Ⅱ的DPPH自由基清除率进行测定。如图 3所示，随着样品浓度的增加，4种海地瓜多肽对DPPH自由基的清除均呈上升趋势，IC₅₀值分别为25.51、12.72、6.58和9.02 mg/mL。与CK组相比，原料经处理后制得的海地瓜多肽抗氧化活性得到提升，其中，纯化组分Ⅰ的DPPH自由基的清除效果最好。

2.4.2 海地瓜多肽对超氧阴离子自由基清除率的分析

对CK组、双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理组及其分离纯化后制得的纯化组分Ⅰ和纯化组分Ⅱ的超氧阴离子自由基清除率进行测定。如图 4所示，随着样品浓度的增加，4种海地瓜多肽对超氧阴离子自由基的清除均呈上升趋势，IC₅₀值分别为25.56、13.51、11.87和8.44 mg/mL。与CK组相比，原料经处理后制得的海地瓜多肽抗氧化活性得到提升，其中，纯化组分Ⅱ的超氧阴离子自由基的清除效果最好。

这可能是由于原料经双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理后酶解制得的海地瓜与未处理原料制得的海地瓜多肽相比，在多肽的氨基酸序列和相对含量等方面会有所改变，从而影响了多肽的抗氧化活性。关于本研究中海地瓜多肽的氨基酸序列和相对含量与抗氧化活性之间的关系，还有待进一步研究。

2.5 不同纯化组分海地瓜多肽对LO₂细胞氧化损伤的保护作用 2.5.1 不同纯化组分海地瓜多肽对LO₂细胞存活率的影响

不同纯化组分海地瓜多肽对LO₂细胞存活率的影响见图 5。纯化组分Ⅰ浓度在20~100 μg/mL内，能提高LO₂细胞存活率，其中，浓度为40 μg/mL时，LO₂细胞存活率达到最大值[(126.25±5.63)%]。纯化组分Ⅱ在0~40 μg/mL时，细胞存活率提高，在浓度为20 μg/mL时，细胞存活率达到最大值[(112.84±2.53)%]，浓度 > 40 μg/mL时，细胞存活率开始下降。

2.5.2 H₂O₂诱导LO₂细胞氧化损伤模型的建立

H₂O₂处理后细胞存活率见图 6。与对照组相比，在H₂O₂作用浓度小于60 μmol/L时，LO₂细胞存活率没有显著变化；浓度≥80 μmol/L时，存活率开始下降，开始对细胞具有刺激作用(P < 0.05)，此时，细胞受到一定程度的氧化应激，但还未达到不可逆转的状态。随着H₂O₂浓度的增大，细胞受到刺激的程度加深，对应的细胞存活率越低。因此，选择浓度为80 μmol/L的H₂O₂进行后续实验。

2.5.3 不同纯化组分海地瓜多肽对LO₂细胞氧化损伤的保护作用

不同纯化组分海地瓜多肽对LO₂氧化损伤细胞的保护作用见图 7。经80 μmol/L H₂O₂处理后，细胞存活率显著降低，说明模型构建成功。经浓度为60~300 μg/mL的纯化组分Ⅰ预处理后，细胞存活率显著上升，且在浓度为80 μg/mL时，细胞存活率较损伤组最大提高(20.33±0.41)%。纯化组分Ⅱ在20~50 μg/mL内能显著提高细胞存活率，在浓度为20 μg/mL时，细胞存活率较损伤组最大提高(17.06±1.18)%。说明纯化组分Ⅰ和Ⅱ均对氧化损伤的LO₂细胞具有保护作用。

3 讨论 3.1 双螺杆挤压辅助亚硫酸处理海地瓜对多肽提取率的提升作用

双螺杆挤压技术主要应用于以淀粉和蛋白质为原料的食品加工领域(涂德星等, 2020; 赵贵兴等, 2017)。在辅助制备植物多肽中有一些报道，陈盛楠等(2012)利用双螺杆挤压膨化高温豆粕酶解制备豆粕肽的得率得到明显提高。相关研究表明，亚硫酸钠处理蛋白可使聚集蛋白质解聚，二硫键断裂，从而提高蛋白质溶解度(Tsen, 1969)。将双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理技术用于海地瓜胶原蛋白多肽制备目前尚未见研究报道。本研究通过双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理海地瓜酶解制备多肽，使海地瓜胶原蛋白中的二硫键断裂，多肽提取率为(57.12±0.62)%，较CK组显著提升(7.66±0.35)% (P < 0.05)，游离巯基含量显著提升(105.32±0.01)% (P < 0.05)，蛋白质溶解度显著提升(4.91±0.15)% (P < 0.05)。童静静(2014)利用蛋白酶酶解方法对海地瓜胶原蛋白进行水解，得到的海地瓜多肽提取率为52.63%。陈超(2014)利用胰蛋白酶对海地瓜胶原蛋白进行水解，在最优工艺条件下多肽提取率为(42.66±1.51)%。说明双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理联合酶解技术与普通酶解方法相比，能有效提高海地瓜胶原蛋白的多肽提取率，使海地瓜的使用价值得到提升。

3.2 双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理对海地瓜多肽抗氧化活性的提升作用

近年来，大量研究表明，海参胶原蛋白经酶解后产生的多肽对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基等有清除作用(Zhou et al, 2012)。曹亚兰等(2011)研究表明，挤压预处理技术可提高蛋白酶解产物的抗氧化活性。本研究表明，CK组、双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理组及纯化组分Ⅰ(1000~3000 u)和纯化组分Ⅱ(< 1000 u)的DPPH自由基清除率IC₅₀值分别为25.51、12.72、6.58和9.02 mg/mL；超氧阴离子自由基清除率IC₅₀值分别为25.56、13.51、11.87和8.44 mg/mL，经双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理的海地瓜多肽的抗氧化能力与申彩红(2015)研究结果相似。李真(2015)研究发现，相对分子质量在1000~5000 Da海地瓜多肽对DPPH自由基清除能力较好，而 < 1000 Da的海地瓜清除效果次之，本研究结果与上述一致。但不同分子量范围的海参多肽清除氧自由基的能力存在差异，抗氧化活性与分子量并不是简单的线性关系，多肽的抗氧化性还取决于组成多肽的氨基酸组成和序列。当短肽中能与自由基发生反应的供氢基团充分暴露时，此时才具有较强的抗氧化性(王静等, 2010)。经H₂O₂诱导建立LO₂细胞氧化损伤模型，纯化组分Ⅰ在浓度为80 μg/mL时，LO₂细胞存活率较损伤组显著提高(20.33±0.41)% (P < 0.05)，纯化组分Ⅱ在浓度为20 μg/mL时，LO₂细胞存活率较损伤组显著提高(17.07±1.18)% (P < 0.05)，这表明低分子量的海地瓜多肽具有较强的抗氧化活性，这与王天明等(2014)的研究结果相一致。综上所述，海地瓜胶原蛋白经双螺杆挤压和亚硫酸钠处理后制得的多肽分子量较小，抗氧化能力得到提升，对氧化损伤细胞有较好的保护作用。

4 小结

本研究利用双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理结合酶解技术制备海地瓜多肽，海地瓜胶原蛋白中游离巯基含量、蛋白质溶解度和多肽提取率得到提升。与CK组相比，双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理组及其纯化组分抗氧化能力得到提升。同时，2个纯化组分对氧化损伤的LO₂细胞有较好的保护作用。综上所述，双螺杆挤压辅助亚硫酸钠处理技术能提升海地瓜多肽提取率和抗氧化能力，该方法可为海地瓜多肽的制备新工艺提供新思路。