原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)作为鱼类生殖细胞系的祖先，在胚胎发育的早期阶段从体细胞中分化出来(宋卉等, 2004)。在组织学上，PGCs呈现体积大、圆形或椭圆形、具有一个大且明亮的圆形细胞核、细胞质为嗜酸性等生物学特征(游秀容, 2012)。在胚胎发育过程中，PGCs按照特定的迁移路线到达生殖嵴的位置，与周围体细胞共同发育形成原始性腺，即未分化的性腺。在硬骨鱼类中，雌雄异体型是最常见的性腺分化类型，具有双向分化潜力的未分化性腺直接发育为卵巢或精巢，此后性别保持终身不变(杨阳, 2018)。

鱼类作为低等脊椎动物，具有多种性别决定方式，主要为基因型性别决定、环境型性别决定和基因–环境相互作用型性别决定(Strüssmann et al, 2002)。随着分子生物技术的快速发展，鱼类性别决定基因或相关基因也被不断鉴定，主要有Dmrt1、Sox9、Foxl2、Amh以及芳香化酶基因等(李云航等, 2011; 路畅等, 2014; 文爱韵等, 2008)。性别相关基因又可进一步分为精巢分化相关基因和卵巢分化相关基因。其中，性腺芳香化酶基因cyp19a1a通常在卵巢分化过程中呈高表达，因为cyp19a1a编码的性腺芳香化酶可将雄激素转化为雌激素，从而促进卵巢分化(Kishida et al, 2001; Kobayashi et al, 2010; Tang et al, 2010; Si et al, 2016)。而其旁系同源基因cyp11b则属于精巢分化相关基因，cyp11b编码的11β-羟化酶可促进雄激素的合成，从而阻碍卵巢的分化，导致精巢分化(Blázquez et al, 2009; Driscoll et al, 2020)。

花鲈(Lateolabrax maculatus)又称中国花鲈，俗称海鲈、七星鲈、鲈板、寨花等(温海深等, 2019)，隶属鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、花鲈属(Lateolabrax) (成庆泰等, 1987)。与大多数硬骨鱼类的性腺分化方式相同，花鲈为雌雄异体型，当体长达到60 cm左右时性腺成熟，雄性一般2~3龄性成熟，而雌性3~4龄性成熟(韩枫, 2016; 温海深等, 2019)。孙帼英等(1994)对长江口及浙江沿海的花鲈卵巢发育等繁殖生物学进行了研究。迟美丽(2015)对花鲈精巢发育周期进行了组织学鉴定，并测定了繁殖周期内相关基因的表达情况。韩枫(2016)对花鲈亲鱼性腺系数周年变化及性腺成熟度分期做了详细分析。目前，国内学者对花鲈早期性腺的形成及分化方面的研究尚未见报道。因此，本研究以花鲈的仔稚鱼和幼鱼为研究对象，自受精卵孵化之日起，对花鲈性腺的发生、发育及分化进行追踪，以确定原始性腺发生及性别分化时间；并测定了性别相关基因cyp11b和cyp19a1a在性别分化初期的精巢和卵巢中的表达情况，旨在丰富花鲈的繁殖生理学资料，也为其性别调控技术的研究提供科学依据。

2019年10—11月在山东省东营市利津县双瀛水产苗种有限责任公司，对来自黄渤海的花鲈亲鱼群体进行人工催产及人工授精，获取同批次受精卵，受精卵孵化后的花鲈仔稚鱼培育参考温海深等(2019)的方法进行。培养条件：水温为15℃~20℃，盐度为28~30，pH为7.5~8.0，溶解氧 > 5.0 mg/L，总氨氮 < 1.0 mg/L。

自初孵仔鱼开始，每隔10 d左右取样1次，每次随机选取20尾鱼。取样时，先用适量MS-222 (200 mg/L)麻醉，测量全长及体长。当全长 < 2 cm时，全鱼固定于波恩氏液中；当全长为2~10 cm时，取含性腺的躯干部分固定；当全长 > 10 cm，性腺可以单独剥离时，取其中一部分性腺用波恩氏液固定，另一部分置于液氮中快速冷冻，‒80℃保存，用于RNA提取。

含性腺的组织经波恩氏液固定24 h后，经70%~ 100%梯度乙醇脱水(70%乙醇40 min，80%乙醇40 min，95%乙醇35 min×2，100%乙醇25 min×2)，二甲苯透明(1/2乙醇+1/2二甲苯混合液15 min，二甲苯15 min×2)，浸蜡(石蜡20 min×3)，石蜡包埋，然后连续切片为5~ 7 μm的组织片，经苏木精–伊红(HE)染色，中性树脂封片后镜检观察。

使用Trizol法提取性腺总RNA，并利用核酸测定仪(OSTC, 中国)检测提取后的OD值及RNA浓度。同时进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测RNA的完整性。将RNA浓度调至500 ng/µL，使用反转录试剂盒[HiScript^® Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)] (诺唯赞, 中国)反转录为cDNA，反应体系和反应条件：(1)去除基因组DNA：总RNA 1 µL，4× gDNA wiper Mix 4 μL, RNase-free ddH₂O加至16 µL，在42℃反应2 min；(2)反转录：上述反应产物16 μL，5×HiScript Ⅲ qRT SuperMix 4 μL，37℃反应15 min后，85℃反应5 s。

cyp11b (MN685653)和cyp19a1a (MN685656)基因序列来源于NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。利用Primer Premier 5软件设计引物，并由华大基因Oligo合成，所用引物序列见表 1。使用ChamQ^TM SYBR^®qPCR Master Mix (High ROX Premixed)试剂盒(诺唯赞, 中国)，StepOnePlus^TM Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, 美国)进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR)，20 μL反应体系：2 µL cDNA，10 µL ChamQ^TM SYBR Color qPCR Master Mix，上下游引物各0.4 µL，7.2 µL ddH₂O。qPCR扩增反应条件：95℃预变性30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。RT-qPCR实验均包括4个生物学重复和3个技术学重复。以18S作为花鲈内参基因(Wang et al, 2018)，使用2^‒ΔΔCt方法进行数据计算，采用SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，当P < 0.05时为差异显著。

表 1(Tab.1)

表 1 qPCR特异性引物 Tab.1 Specific primer sequences for qPCR 引物 Primers 核苷酸序列 Nucleotide sequences (5′~3′) cyp11b Forward: CCATGTGATCTACGGGGAGC Reverse: TGATCGTGCCTTTCAGCAGT cyp19a1a Forward: AACGAATGCTTGCGATAC Reverse: CCTCCTGCTGATGCTCTA 18S Forward: GGGTCCGAAGCGTTTACT Reverse: TCACCTCTAGCGGCACAA

表 1 qPCR特异性引物 Tab.1 Specific primer sequences for qPCR

取样期间，随着天数的增加，花鲈全长呈平稳增长趋势。在180 dph (days post hatching)，花鲈平均全长为(12.28±1.30) cm，此前性腺处于未分化状态，自此性腺开始出现组织学分化(图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 花鲈全长与孵化后天数之间的关系 Fig.1 The relationship between total length and the days post hatching of spotted sea bass

30 dph，仔鱼平均全长为(1.28±0.10) cm。如图 2A所示，PGCs迁移到中肾管前端的腹腔膜周围。PGCs呈圆形或椭圆形，直径处于(6.48~7.26) μm之间，具有一个大且明亮的圆形细胞核，被苏木精浓染成紫色，而细胞质呈嗜弱酸性，着色较浅。

图 1(Fig. 1)

图 2 花鲈原始性腺和未分化性腺的发育 Fig.2 The development of primitive and undifferentiated gonads in spotted sea bass A：30 dph的原始生殖细胞；B~E分别为55、80、125和180 dph的原始性腺；A~C：纵向切片；D~E：横向切片GC：生殖细胞；In：肠；MD：中肾管；PG：原始性腺；PGC：原始生殖细胞 A: Primitive germ cells at 30 dph; B~E: Primitive gonads at 55, 80, 125, and 180 dph, respectively; A~C: Longitudinal section of gonad; D~E: Transverse section of gonad GC: Germ cell; In: Intestines; MD: Mesonephric duct; PG: Primitive gonad; PGC: Primitive germ cell

55 dph，稚鱼平均全长为(2.45±0.19) cm。此时观察到PGCs已迁入生殖嵴中，并且一对原始性腺已经形成，呈对称分布，从腹腔后侧的肠系膜出发向前延伸。原始生殖细胞在原始性腺中排列较稀疏，周围有丰富的结缔组织(图 2B)。

80 dph，幼鱼平均全长为(4.33±0.34) cm。牵引性腺一端的系膜变长，另一端持续向腹部延伸，体积明显增大，呈梨形，其中生殖细胞数量显著增加(图 2C)。

125 dph，幼鱼平均全长为(6.83±0.49) cm。性腺继续生长，横切面平均长度为(100.45±9.20) μm，宽度为(38.90±4.15) μm (图 2D)。

180 dph，幼鱼平均全长为(12.28±1.30) cm，原始性腺横切面平均长度增长至(187.36±19.18) μm，宽度为(49.02±4.32) μm (图 2E)。此时伴随着有丝分裂的不断进行，性原细胞逐渐被体细胞包绕形成生殖细胞囊，散布在整个性腺中。

195 dph，花鲈幼鱼平均全长为(14.54±1.54) cm，在靠近背部的区域出现裂缝状的输精管，表明在解剖学上精巢已经开始分化，此时为Ⅰ期精巢。Ⅰ期精巢的横切面为三角形，通过系膜与鳔组织相连，并且周围结缔组织丰富；在靠近腹部的边缘区域观察到数个精原细胞(图 3A)。当精巢发育至205 dph时，靠近腹部的区域已被隔膜分割成很多小叶状结构，但排列较稀松(图 3B)。215 dph，精巢继续发育，伴随着精原细胞强烈的有丝分裂，精小叶的排列变得紧密，形状不规则。精小叶由一圈精原细胞囊构成，每个生殖细胞囊周围都由1个或多个着色很深的sertoli前体细胞围绕；精小叶中间形成一个空腔即小叶腔，待精子成熟后可将其排出体外。精原细胞呈圆形或椭圆形，细胞核大而圆，占整个胞体体积的4/5，并且有一个着色很深的核仁，相反细胞质不易着色(图 3C)。

205 dph，花鲈幼鱼平均全长为(15.86±0.94) cm。如图 3D~E所示，此时在性腺中部出现一条较整齐的细长条裂缝，将来发育为卵巢腔，这标志着组织学上卵巢的分化。Ⅰ期卵巢的横切面呈弯曲的梨形，靠近背部丰富的结缔组织和血管组织，卵原细胞分散的排列在性腺中。此时，仅凭大小和形态上的区别不能将卵原细胞和精原细胞区分开。

215 dph，幼鱼平均全长为(17.20±1.28) cm。在卵巢中，随着性腺的分化，卵巢腔逐渐向外围延伸形成完整的腔体结构，此时产卵板开始形成，逐渐向卵巢腔内延伸，产卵板外侧分布着卵原细胞。卵原细胞形态同精原细胞一样呈圆形或椭圆形，胞质较少，着色浅，大而圆的细胞核呈嗜碱性着色较深(图 3F)。

图 1(Fig. 1)

图 3 花鲈精巢和卵巢的早期分化 Fig.3 Differentiation of the testis and ovary in spotted sea bass A~C分别为195、205和215 dph的精巢；D、E：205 dph的卵巢(E为D的放大图)；F：215 dph的卵巢BV：血管；CT：结缔组织；ED：输精管；LC：小叶腔；OC：卵巢腔；OG：卵原细胞；OL：产卵板；SC：体细胞；SG：精原细胞 A~C: Testis at 195, 205, and 215 dph, respectively; D, E: Ovary at 205 dph (E is an enlarged view of D); F: Ovary at 215 dph BV: Blood vessel; CT: Connective tissue; ED: Efferent duct; LC: Lobular cavity; OC: Ovarian cavity; OG: Oogonia; OL: Ovigerous lamellae; SC: Somatic cell; SG: Spermatogonia

18月龄花鲈幼鱼性腺发育到Ⅱ期。Ⅱ期精巢在解剖镜下观察到与Ⅰ期精巢组织结构相似，但血管组织增多。此阶段管腔内的生殖细胞主要包括精原细胞和初级精母细胞，与精原细胞相比，初级精母细胞体积明显缩小，但细胞核的嗜碱性增强(图 4A~B)。

Ⅱ期卵巢与Ⅰ期卵巢相比，产卵板变宽变长，呈大小不一的细长板状紧密排列在卵巢腔四周。此阶段仍有少量的卵原细胞，但大部分已停止有丝分裂，进入初级卵母细胞的小生长期阶段，此时的卵母细胞体积明显大于卵原细胞，核膜清晰，胞质增多且呈强嗜碱性，被染成深紫色，而细胞核则不易被染色，但核内有数个染成蓝紫色的核仁(图 4C~D)。

图 1(Fig. 1)

图 4 花鲈Ⅱ期精巢和卵巢 Fig.4 Development of the testis and ovary in spotted sea bass A、B：Ⅱ期精巢；C、D：Ⅱ期卵巢；B和D分别为A和C的放大图BV：血管；ED：输精小管；LC：小叶腔；N：细胞核；NC：核仁；OC：卵巢腔；OG：卵原细胞；OL：产卵板；POO：初级卵母细胞；PSC：初级精母细胞；SC：体细胞；SL：精小叶；SG：精原细胞 A, B: Stage Ⅱ testis; C, D: Stage Ⅱ ovary; B and D are enlarged pictures of A and C, respectively BV: Blood vessel; ED: Efferent duct; LC: Lobular cavity; N: Nucleus; NC: Nucleolus; OC: Ovarian cavity; OG: Oogonia; OL: Ovigerous lamellae; POO: Primary oocyte; PSC: Primary spermatocyte; SC: Somatic cell; SL: Seminiferous lobules; SG: Spermatogonia

利用RT-qPCR技术测定了花鲈芳香化酶基因cyp11b和cyp19a1a在性别分化初期幼鱼Ⅰ期精巢和卵巢以及18月龄幼鱼Ⅱ期精巢和卵巢中的相对表达水平，结果如图 5所示。

在性别分化初期幼鱼的Ⅰ期性腺中，cyp11b在精巢中的表达量显著高于卵巢。随着性腺的发育，在18月龄幼鱼Ⅱ期精巢中，cyp11b的表达量显著高于同时期的卵巢及Ⅰ期精巢(图 5A)。相反，cyp19a1a在性别分化初期幼鱼的Ⅰ期卵巢中的表达量显著高于同时期精巢，在Ⅱ期卵巢中的表达量高于同时期的精巢，但明显低于Ⅰ期卵巢(图 5B)。

PGCs作为鱼类生殖细胞系的祖先，在胚胎发育的早期阶段就已经形成(宋卉等, 2004)，然后按照特定的迁移路线到达生殖嵴的位置，与周围体细胞共同发育形成原始性腺。在不同鱼类中，原始性腺发生的时间各不相同。红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)于12 dph观察到一对原始性腺的形成(胡鹏等, 2015)；大黄鱼(Larimichthys crocea)于20 dph观察到由系膜悬挂在腹膜上皮上的原始性腺(游秀容, 2012)；牙鲆(Paralichthys olivaceus)的原始性腺于22 dph形成于肾脏腹腔后方(杨阳, 2018)；许氏平鲉(Sebastes schlegelii)的原始性腺于25 dpb (day post birth)起逐渐发育(王孝杰等, 2019)。在花鲈中，30 dph首次在性腺原基区域观察到PGCs的出现，55 dph观察到线形原始性腺已经形成，因此，推测30 dph前是花鲈胚后PGCs迁移至生殖嵴的关键时期，原始性腺发生在30~55 dph之间。

图 1(Fig. 1)

图 5 cyp11b和cyp19a1a在性别分化初期(Ⅰ期)及Ⅱ期精巢和卵巢中的相对表达水平 Fig.5 Relative expression levels of cyp11b and cyp19a1a in early sexual differentiation (stageⅠ) and stage Ⅱ testis and ovary 雄鱼1~4和雌鱼1~4分别代表性别分化初期(Ⅰ期)的4尾雄鱼个体和4尾雌鱼个体的性腺组织。 不同的字母表示差异显著(P < 0.05) Males 1~4 and females 1~4 represent the ovary and testis of 4 males and 4 females at the early stage of sexual differentiation (stageⅠ) respectively. Different letters indicated significant difference (P < 0.05)

在硬骨鱼类中，雌雄异体型是最常见的性腺分化类型，大多数雌雄异体的鱼类未分化性腺将直接分化为卵巢或精巢(Devlin et al, 2002)。鱼类的性腺分化包括解剖学分化和细胞学分化2个方面，解剖学分化是指卵巢腔、输精管和血管的形成等组织形态的变化，细胞学分化的标志为生殖细胞开始进入减数分裂(宋卉等, 2004)。一般解剖学分化早于细胞学分化(党广成等, 2011; 杨阳, 2018)。不同鱼类的性腺分化时间存在较大差异，即使是同一物种，雌性和雄性的性腺分化时间也不同。在许氏平鲉中，35 dpb时卵巢腔开始形成，68 dpb时输精管开始形成(王孝杰等, 2019)。大黄鱼卵巢的解剖学分化开始于55日龄，精巢的解剖学分化开始于95日龄(游秀容, 2012)。在圆斑星鲽(Verasper variegatus)中，60日龄的雌鱼性腺开始出现卵巢腔，而同时期的雄鱼没有明显的性腺分化特征(杨珍珍等, 2020; 张乐乐, 2018)。在斑石鲷(Oplegnathus punctatus)中，120日龄观察到输精管原基的出现，150日龄观察到卵巢腔的出现(赵玉柱等, 2020)。花鲈幼鱼在180 dph时，性腺还处于未分化状态(图 2E)，随后在195 dph时观察到输精管的出现，表明精巢在解剖学上开始分化，于207 dph观察到卵巢腔的形成，表明卵巢解剖学分化已经开始，在此阶段雌雄性腺均未出现细胞学分化的标志。这说明与大多数鱼类一样(杨阳, 2018; 游秀容, 2012; 张乐乐, 2018)，花鲈性腺的解剖学分化要早于细胞学分化。

在鱼类性别决定和分化过程中，性类固醇激素发挥重要作用。芳香化酶基因属于细胞色素P450超家族的成员，这种复合酶可将雄激素转化为雌激素，而雌激素是促进卵巢分化的重要因子(Simpson et al, 2002)。在鱼类中，存在性腺芳香化酶和脑芳香化酶2种类型，分别由cyp19a1a和cyp19a1b编码(Kishida et al, 2001)。cyp19a1a基因在脊椎动物中以高度保守的方式在性别决定的早期表现出性别二态性，在雌性性腺中呈现高表达，这使得该基因成为性别决定和卵巢分化的关键因子(王金等, 2014; Driscoll et al, 2020)。cyp19a1a在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus) (Ijiri et al, 2008)、齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti) (Yan et al, 2019)、茅耙丽鱼(Pelvicachromis pulcher) (Driscoll et al, 2020)等多种鱼类卵巢中的表达量显著高于精巢，都表明其在卵巢发育中发挥更重要作用，而其在精巢中也存在低表达，是因为通过芳构化产生的低水平雌激素对精子形成是必要的(Schulz et al, 2010)。细胞色素P450家族的另一个成员11β-羟化酶基因(cyp11b)是催化11-酮基睾酮(11-KT)合成所必需的，而11-KT是硬骨鱼类内源性的雄激素，对阻碍卵巢分化并导致精巢的分化及维持有重要作用(王婷茹, 2013; Driscoll et al, 2020)。在尼罗罗非鱼(Ijiri et al, 2008; 康恺等, 2020)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss) (Vizziano et al, 2007)、日本鳗鲡(Anguilla japonica) (Jianga et al, 1996)等多种硬骨鱼的精巢分化早期阶段cyp11b都被检测到高表达。更重要的是，在与花鲈进化关系很近的欧洲鲈中，cyp19a1a和cyp11b的表达差异可在组织学水平性别分化迹象前1个月检测到，它们分别与未来的雌雄表型有明显的相关性，因此，它们可作为组织学上未分化欧洲鲈表型性别预测的早期分子标记(Blázquez et al, 2009)。本研究表明，在花鲈性别分化初期(Ⅰ期)以及性腺发育到Ⅱ期的雌鱼和雄鱼中，cyp11b在Ⅰ期和Ⅱ期精巢中的表达都显著高于卵巢，相反，cyp19a1a在Ⅰ期和Ⅱ期卵巢中的表达都显著高于精巢，与在其他硬骨鱼中的表达趋势一致。结果说明，在性腺分化及维持期间，cyp11b在精巢中扮演更重要的角色，而cyp19a1a主要是在卵巢中发挥作用。由于目前在花鲈中尚缺乏性别相关的遗传分子标记，所以不能确定在组织学上的性别分化标志出现之前，cyp19a1a和cyp11b的表达趋势是否可以预测未来卵巢和精巢的分化。但是，根据欧洲鲈的研究结论，结合本研究结果，有理由推测，在花鲈性腺分化的第1个组织学特征明显之前，cyp19a1a和cyp11b在性腺中的差异表达或许可能成为预测未来分化成卵巢和精巢的分子依据。