鱼类在生长发育过程中，水体中的CaCO₃在耳石上沉积的同时，其他微量元素也被沉积在耳石中，由于它的非细胞性和代谢惰性，一般不会发生分解或重吸收，这种元素的信息可以一直保存下来，成为记录鱼类生活史的元素指纹(elemental fingerprints)(李秀启等, 2017)。目前，在鱼类耳石中已检测出的元素种类有50多种(熊瑛等, 2015)，且主要来源于鱼类生活的水环境和食物(郭弘艺等, 2015; 熊瑛等, 2015)。水环境或食物的元素通过吸收进入血液，再由血液进入内耳淋巴液；最终通过结晶作用将元素沉积在耳石中(Sturrock et al, 2012)。但由于各种元素的性质不同，耳石对不同环境元素的响应有所差别(郭弘艺等, 2015; 熊瑛等, 2015)。锶(Sr²⁺)作为一种硬酸元素，水体环境中和耳石中Sr²⁺的浓度具有显著的正相关性(Walther et al, 2006)。因此，耳石Sr/Ca比分析一直以来被作为鱼类生境重建和种群鉴定的重要技术手段(王玉堃等, 2016; 李孟孟等, 2017a)，并逐步在增殖放流效果评估中得以研究应用(李秀启等, 2017; 司飞等, 2019a)。

目前，增殖放流鱼类标记方法中，挂牌标记和被动整合式雷达标要求鱼苗体长较大且适合小规模标记(Waldman et al, 1990; Navarro et al, 2007; 周辉霞等, 2017)，而分子标记需要清晰的亲本遗传信息(童爱萍等, 2015)。但目前国内鱼类增殖放流的现状是放流的苗种以小规格苗种为主，放流数量较大、放流企业较多且存在鱼苗遗传背景信息不清的情况。而耳石Sr²⁺标记具有成本低、标记方法简便易操作、对苗种无损伤、一旦标记不受外界影响, 可以对小规格苗种进行大规模标记等优点，是鱼类标记放流技术研究的一个新热点问题(司飞等, 2019a)。

与淡水及河口鱼类耳石Sr/Ca比和生境中的Sr/Ca比直接相关不同，海水中的Sr/Ca比不是影响海水鱼类耳石Sr/Ca比的主要因素(Brown et al, 2009)，海水鱼类耳石Sr/Ca比可能受到海水环境中的Sr和Ca的相对浓度、鱼类种类特性、水温、盐度和鱼类生理状态的影响(熊瑛等, 2015)。因此，海水中的Sr²⁺浓度对海水鱼类耳石Sr/Ca比的影响，需分种类加以区别研究。(Liza haematocheila)作为我国增殖放流的重要品种(杨文波等, 2009)和天津市鱼类增殖放流量最大(7347.302万尾)的一个品种，全面、科学地评估其增殖放流效果，是保证放流工作有效开展的基础(罗刚等, 2015)。放流个体标记回捕法作为目前海洋渔业生物增殖放流效果评估的主要方法(刘璐等, 2014)，研究大规模标记小规格苗种的方法是十分有必要的。本研究拟比较不同浓度Sr²⁺浸泡下，的耳石标记效果，并尝试对的耳石进行双环标记，以探讨耳石Sr²⁺标记的可行性和不同放流群体识别的可能性，为大规模耳石Sr²⁺标记放流提供基础数据和技术支撑。

1 材料与方法 1.1 实验用鱼的来源及暂养

实验用鱼为河北省黄骅市宏润水产养殖有限公司繁育的体长为3 cm左右的幼鱼。3000尾幼鱼运回后，暂养于天津兴盛海淡水养殖有限责任公司养殖车间的2个养殖池中，养殖池规格为6.0 m×6.0 m×1.3 m，每个养殖池盛水约为30 m³。暂养期间，每天投喂配合饲料2~3次，日换水量为30%，每周倒池1次。暂养海水为自然海水，盐度为21~23、水温为21℃~22℃、pH为7.83~8.03。

1.2 实验方法

通过向海水中添加SrCl₂·6H₂O将海水中Sr²⁺质量浓度分别提升至50、100、200和400 mg/L，其中Sr²⁺质量浓度为400 mg/L的海水Sr²⁺浓度处于过饱和状态，海水呈乳白色。

将Sr²⁺质量浓度为50、100、200和400 mg/L的海水分别注入50 L的实验水族箱中，作为不同Sr²⁺质量浓度标记组，分别以L5M50、L5M100、L5M200和L5M400表示；同时，将无添加SrCl₂·6H₂O的自然海水单独注入1个50 L的实验水族箱，作为对照组，用L5M0表示。

挑选体长为5 cm左右健康的幼鱼500条，均匀分配到4个标记组和一个对照组，开始实验。整个标记期间，不换水，每天正常投喂2~3次。标记48 h后，分别将每个处理组中全部幼鱼单独转移到一个网箱中进行后期饲养。网箱规格为1.5 m×1.5 m×1.3 m。待幼鱼长至约10 cm左右时，每个处理组随机挑选5尾用于耳石微化学分析。后期饲养期间，养殖用水和养殖管理同暂养，每天观察幼鱼的死亡状况，并记录。

1.3 双环标记实验

实验开始前，海水中Sr²⁺质量浓度经电感耦合等离子质谱仪(ICP MS)测定，为7.9 mg/L。通过向海水中添加SrCl₂·6H₂O将海水中Sr²⁺质量浓度分别提升至100和200 mg/L。

将Sr²⁺质量浓度为200 mg/L的海水注入到2个50 L的实验水族箱中，并随机挑选体长为3 cm左右健康的幼鱼200尾，均分到2个实验水族箱中。幼鱼在Sr²⁺质量浓度为200 mg/L的海水中标记96 h后，将所有标记幼鱼转移到2个网箱中继续暂养。标记幼鱼的暂养网箱规格同1.2，网箱置于养殖池中，网箱为透水网衣，网箱中的海水可与养殖池的海水自由交换。标记幼鱼暂养条件同其他幼鱼暂养一致。暂养30 d后，标志幼鱼长至5 cm左右，开始第2次标记。将Sr²⁺质量浓度为100 mg/L的海水注入2个50 L的实验水族箱中，并随机从第1次标记的幼鱼中挑选体长为5 cm左右健康幼鱼100尾，移入其中一个实验水族箱中进行二次48 h标记；同时挑选体长为5 cm左右未进行标记的健康幼鱼100尾，移入另一个实验水族箱中标记48 h。将200 mg/L的海水标记、双环标记和100 mg/L的海水标记幼鱼分别单独转移到一个网箱中继续暂养。分别用SL3、DL3-5和SL5表示200 mg/L的海水标记、双环标记和100 mg/L的海水标记。整个标记期间，不换水，每天正常投喂2~3次。待幼鱼长至约为10 cm左右时，随机挑选5尾用于耳石微化学分析。

1.4 耳石检测方法 1.4.1 耳石摘取及前处理

利用剪刀、尖头镊等工具将一对矢耳石取出，剔除有机质，分别用去离子水、无水乙醇清洗，置于48孔盒中干燥备用。从一对矢耳石中随机选取一块用于前处理和微化学分析，前处理参照李孟孟等(2017b)的方法。先将耳石用Epofix环氧树脂进行固定包埋，38℃烘干12 h以上。然后，将包埋块用AB胶粘贴于干净的载玻片上，凝固2 h后，使用金刚石磨轮的碾磨机(Discoplan-TS型，Struers公司, 丹麦)切割碾磨。粗磨阶段用500目金刚砂轮碾磨至耳石微露，接着用1200目砂纸精磨至耳石核心暴露，然后用磨抛机(Labo Pol-35, 丹麦Struers公司)装备织布机抛光盘配合抛光液抛光，至耳石表面无明显划痕。最后，将样品放入Milli-Q水中超声清洗5 min后，自然条件下晾干24 h，完全干燥后，使用真空镀膜机(JEE-420, 日本电子株式会社)蒸镀碳膜(36A, 25 s)。

1.4.2 耳石的EPMA分析

耳石的电子探针显微分析(electron probe microanalysis, EPMA)参考司飞等(2019a)和杨健等(2010)的方法，利用X射线电子探针微区分析仪((JXA-8100型EPMA，日本电子株式会社)从耳石核心沿耳石最长径至耳石边缘呈直线进行耳石Sr²⁺元素定量线分析。标准样品使用CaCO₃和SrTiO₃。定量线分析EPMA的参数设定：加速电压为15 kV，电子束电流为2.0×10^–8 A；束斑直径为3 μm，每点驻留时间为15 s；以间距10 μm连续进行打点测定。所有耳石线分析完后，用电子束在耳石矢状面表面扫描进行面分析。其EPMA加速电压和电子束电流分别为15 kV和5.0×10^–7 A，束斑直径为3 μm，像素为6 μm×6 μm，每点驻留时间为30 ms。由于耳石中Sr含量远小于Ca含量，按照国际惯例将Sr/Ca比标准化，即统一用Sr含量/Ca含量×10³表示。

1.5 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)或χ²检验，P < 0.05表示差异显著；利用Excel 2010和SigmaPlot 1.0软件作图。

2 结果与分析 2.1 耳石上Sr²⁺元素的面分布

对50、100、200和400 mg/L浸泡组和对照组Sr²⁺元素在耳石上沉积的面分布进行上机分析。4个标记浓度处理组均出现明显的“高Sr²⁺标记环”(图 1)。

2.2 耳石上Sr²⁺元素线性分析结果

通过定量线分析可知，50、100、200和400 mg/L浸泡组的Sr/Ca比均在距核1100 μm附近出现增高阶段(图 2)。线性分析结果显示，Sr²⁺质量浓度为50~400 mg/L，标记时长为48 h，均被成功标记。

将耳石的Sr/Ca比的变化分成平稳阶段和显著变化阶段，并对其不同阶段的数值进行单因素方差分析，分析结果见表 1。4个不同标记浓度组平稳阶段和对照组耳石的Sr/Ca比未发现显著差异(P > 0.05)。耳石Sr/Ca比显著变化阶段均值与平稳阶段均值的比值变化规律和Sr/Ca比显著变化阶段均值的变化规律一致；其中，L5M50组和L5M100组显著低于L5M200组和L5M400组(P < 0.05)。Sr/Ca峰值(即Ⅲ阶段Sr/Ca比)在4个不同标记浓度组均存在显著差异，Sr/Ca峰值与平稳阶段均值的比值在4个不同标记浓度组也存在显著差异(P < 0.05)，且变化规律一致，其中L5M50组最低，显著低于其他处理组(P < 0.05)；其中，L5M400组最高，显著高于其他处理组(P < 0.05)。L5M50组耳石形成的标记环宽度值最低，显著低于L5M100组和L5M400组(P < 0.05)，但与L5M200组差异不显著(P > 0.05)；L5M400组耳石形成的标记环宽度值最高，显著高于L5M50组和L5M200组(P < 0.05)，但与L5M100组差异不显著(P > 0.05)。

2.3 双环标记耳石上Sr²⁺元素EPMA分析结果

耳石上Sr²⁺元素的面分布结果显示，在Sr²⁺质量浓度为200 mg/L的海水中标记96 h的3 cm 和在Sr²⁺质量浓度为100 mg/L的海水中标记48 h的5 cm 均出现明显的“高Sr²⁺标记环”，双环标记出现层次分明的双“高Sr²⁺标记环”(图 3)。

线性分析结果显示，Sr²⁺质量浓度为200 mg/L，标记时长为96 h，体长为3 cm的的Sr/Ca比均在距核550 μm附近出现增高阶段。体长为5cm的在Sr²⁺质量浓度100 mg/L的海水中标记时长为48 h，Sr/Ca比均在距核1100 μm附近出现增高阶段(图 4)。双环标记组2次峰值出现明显，彼此间几乎没有影响。

将耳石的Sr/Ca比的变化分成平稳阶段和显著变化阶段，并对其不同阶段的数值进行单因素方差分析，分析结果见表 2。无论是平稳阶段Sr/Ca比、显著变化阶段Sr/Ca比、Sr/Ca比峰还是标记环宽度，在同一体长、同一标记浓度和同一标记时间下，对照组和双环标记组耳石Sr/Ca比均未发现显著差异(P > 0.05)。但是2次标记(体长不同、标记浓度不同、标记时间不同)的耳石Sr/Ca比出现显著差异，体长为3 cm的在Sr²⁺质量浓度为200 mg/L的海水中标记96 h，平稳阶段Sr/Ca比、显著变化阶段Sr/Ca比、Sr/Ca比峰值和标记环宽度均显著高于体长为5 cm的在Sr²⁺质量浓度为100 mg/L的海水中标记96 h的值(P < 0.05)。

3 讨论

由于耳石是一种具有新陈代谢惰性的钙化结构(Campana et al, 1985)，沉积在耳石中的生境元素能永久性保存，其可很好地记录鱼类生境的变迁(Elsdon et al, 2008)。因此，耳石微化学分析一直以来均作为一种重要的技术手段，用于鱼类的生境重建和种群鉴定(王玉堃等, 2016; 李孟孟等, 2017a)。随着学者们对大规模小规格鱼类标记方法的探索，耳石Sr²⁺标记技术逐步由标记淡水鱼类(李秀启等, 2017)向标记海水鱼类(张辉等, 2015; 司飞等, 2019a)发展。本研究中，4个标记浓度处理组耳石Sr/Ca比均出现一个显著的上升阶段，耳石EPMA面分析也出现明显的“高Sr²⁺标记环”。这说明通过人为向海水中添加一定浓度Sr²⁺对耳石进行微化学标记是可行的。

耳石中Sr/Ca比波峰随着标记海水中Sr²⁺浓度的增加逐渐增高，说明耳石中的Sr/Ca比与水体中的Sr/Ca比呈正相关关系，这与司飞等(2019a)对牙鲆(Paralichthys olivaceus)的研究结果一致。虽然标记环的宽度也是随着标记海水中Sr²⁺浓度的增加逐渐增高，但是其变化趋势与耳石中的Sr/Ca比波峰有所不同。如果将耳石“高Sr²⁺标记环”中的Sr/Ca比极大值、Sr/Ca比显著变化阶段均值和标记环宽度与标记浓度的比分别作为标记效率的3个指标值，那么随着标记浓度的增加，其标记效率是下降的，尤其是标记环宽度标记效率下降最为明显。结合耳石生境元素在耳石的永久保存性(Elsdon et al, 2008)和EPMA精确定位性(司飞等, 2019b)，依据本研究结果，认为50 mg/L Sr²⁺标记48 h完全可以实现小规格苗种大规模标记的需求。该标记浓度较其他海水鱼类的最低标记浓度高(张辉等, 2015; 司飞等, 2019a)，更低的海水Sr²⁺标记浓度是否同样能够实验的成功标记需要进一步研究。

鱼类的耳石随着鱼类的生长而不断生长(邓维德等, 2010)，随着耳石的总重量不断增加，一些特定环境如Sr²⁺标记在耳石中沉积的特定元素相对含量逐渐下降(Yamada et al, 1979; Schroder et al, 1995)。由于原子吸收光谱法(AAS)和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等检测方法只能检测均一化后的整体耳石样品(司飞等, 2019b)，故非常容易出现Sr²⁺标记随着鱼类生长而消失的假象。与之相比，EPMA可精确分析耳石剖面上不同位置的Sr²⁺含量沉积情况，从而不受标记鱼生长等限制，可避免上述局限，同时也为开展小规格大规模标记提供了可能。在双环标记实验中，耳石Sr²⁺元素面分布结果出现层次分明的双环，且双环标记组耳石线性分析结果与对照组基本一致。这说明通过Sr²⁺标记次数来进行不同放流群体识别是可行的。

外源Sr²⁺在耳石内沉积量响应性变化存在着一定时滞性(邱晨等, 2019)，不同的标记实验其时滞性有所不同(王臣等, 2015; 李秀启等, 2017; 邱晨等, 2019)。本研究中，2次实验间隔时间约为20 d，2次标记环之间层次分明。但双环标记时间是否可以进一步缩短，需要结合时滞现象与耳石结构、Sr²⁺沉积机制及鱼体生长阶段特征等相关性进一步深入研究。

综上所述，耳石Sr²⁺标记技术可实现小规格大规模标记，也可通过多环标记实现不同放流群体的识别，但是多环标记过程中，不同标记时间所需的最短时间间隔需要通过进一步的研究确定。