MITF (microphthalmia-associated transcription factor)即小眼畸形相关转录因子，于放射诱导的突变小鼠中发现(Hertwig, 1942)，突变体的后代会出现小眼畸形、早发性耳聋、皮毛和虹膜色素减退等症状。MITF是动物皮肤、眼睛和羽毛色素中黑色素细胞发育的关键调控因子(Lin et al, 2019)，具有基本–螺旋–环–亮氨酸拉链(basic helix-loop-helix-leucine zipper, bHLHZip)结构，以二聚体的形式与酪氨酸家族启动子Mbox高度结合，通过直接调控dct、tyr、tyrp1、c-kit和bcl2等基因的表达，从而在黑色素细胞的发育、存活、迁移、增殖和分化过程中发挥重要作用(Steingrimsson et al, 2004)。在哺乳动物中，mitf基因的突变或缺失可能会导致动物耳朵、眼睛、毛发、体色等表型发生改变，如鹌鹑(Coturnix)白色羽毛的产生(Minvielle et al, 2010)、马(Equus caballus) (Hauswirth et al, 2019)和犬(Canis lupus familiaris) (Korberg et al, 2014)皮毛白色斑点的出现等。在鱼类中，mitf作为治疗黑色素瘤潜在的靶基因，已在斑马鱼(Danio rerio)中开展了大量研究(Lister et al, 2014)，在青鳉(Oryzias latipes) (Li et al, 2013)、锦鲤(Cyprinus carpio) (Liu et al, 2015)、鲫鱼(Carassius auratus, red var.) (Zhang et al, 2017)等鱼类中也开展了mitfa在胚胎和各个成鱼组织中表达情况的研究，初步探索了mitfa在鱼类体色形成过程中的作用，但其具体的调控机制及与其他体色相关基因的联级作用仍未被阐明。

橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus)，俗称红魔鬼，原产于中南美洲的尼加拉瓜、哥斯达黎加等地，是一种既可食用又可观赏的大型热带鱼类(Barluenga et al, 2010; Kautt et al, 2012)。通常1龄可达性成熟，成熟后的丽鱼体色为橘红色或橘色，生产上常将其作为父本与红头丽鱼(Cichlasoma synspilum)杂交，产生更具观赏性的子一代血鹦鹉鱼(A. citrinellus♂× C. synspilum♀)。橘色双冠丽鱼在发育过程中会出现体色过渡的现象，体色由最初黑色过渡至灰色，灰色再过渡至亮黄色，这一现象称为体色褪黑(蒋燕玲, 2016)，主要是由于色素细胞的形成、增殖、迁移和分化所致。橘色双冠丽鱼含4种色素细胞，包括黑色素细胞、黄色素细胞、红色素细胞和虹彩细胞，其中，红色素细胞和虹彩细胞只在特定部位分布且数量较少，黑色素细胞和黄色素细胞在“黑色–灰色–黄色”3个时期均有分布，孵化后至体色由黑到黄的转变过程中，黑色素细胞数量呈逐渐增加而后又减少的趋势，黄色素细胞数量则呈一直增加趋势(韦敏侠等, 2015)。目前，国内外对鱼类早期体色褪黑这一复杂生物学过程的研究相对较少，其调控机制仍不明确。

鱼类体色的形成和分布主要是由其体表鳞片和皮肤中色素细胞的类型、分布和数量所决定(Shi et al, 2015; Yu et al, 2012)，目前，已在鱼类中鉴定出6种色素细胞，包括黑色素细胞、黄色素细胞、红色素细胞、虹彩细胞、白色素细胞和蓝色素细胞(Volkening et al, 2018)。其中，黑色素细胞分布最为广泛，含有大量的黑色素颗粒，能够吸收特定波长的入射光，使鱼的颜色呈现黑色/灰色(Zhang et al, 2017)。黑色素细胞起源于外胚层神经嵴细胞，由神经嵴细胞经黑素母细胞、黑素干细胞发育成黑色素细胞(Cohen et al, 2016)，黑色素细胞的形成受一系列通路和基因的严格调控(Hou et al, 2008)，其中，MC1R/α-MSH信号通路(Newton et al, 2007)、PI3K/Akt信号通路(Khaled et al, 2002)、MAPK信号通路(Wang et al, 2017)、WNT/ β-catenin信号通路(Yamada et al, 2010)、NO信号通路(Park et al, 2009)为最常见的5条信号通路，mitf作为这5条通路共有的靶向基因，直接关联黑色素细胞发育所必需的多个基因的表达，包括dct、tyr、c-kit和bcl2等，对黑色素细胞存活、迁移、增殖和分化起着关键性作用(Steingrimsson et al, 2004)。本研究拟聚焦黑色素合成关键基因mitf，检测其在橘色双冠丽鱼各组织、胚胎发育各时期和体色褪黑转换期的表达模式，了解其在鱼类体色褪黑调控中的作用规律。

橘色双冠丽鱼取自中国水产科学研究院珠江水产研究所。选取性成熟且体色为橘色的健康双亲进行配对，获取不同发育时期的胚胎，包括受精卵、卵裂期、原肠期、神经期、视泡期、听泡期、心脏形成期、血液循环期等8个时期胚胎(蒋燕玲, 2016)。在体色发育的3个褪色阶段“黑色、灰白、黄色”各取3尾鱼，剥离鳞片、皮肤和尾鳍。同样选取性成熟且体色为淡黄色的橘色双冠丽鱼3尾，分离鳃、脑、肌肉、性腺、眼、肾和心脏7个组织，均用Trizol处理，于–80℃冰箱保存，用于RNA提取和荧光定量分析。

取性成熟橘色双冠丽鱼皮肤、鳞片、尾鳍于Trizol中，按Tissue RNA kit (OMEGA)操作步骤提取总RNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳和Synergy^TM NEO HTS多功能酶标仪检测RNA的完整性、纯度及浓度。利用Prime Script^TMⅡ 1st strand cDNA synthesis kit (TaKaRa)反转录试剂盒合成cDNA第一链，置于–20℃冰箱保存。

根据已知慈鲷科(Cichlidae)鱼类保守序列，利用Primer 5.0软件设计扩增引物mitf-F和mitf-R (表 1)，以cDNA第一链为模板，扩增目的基因片段。25 μL扩增体系：16.75 μL ddH₂O，4 μL dNTP mix，2.5 μL 10×Buffer，0.5 μL模板，上下游引物各0.5 μL，0.25 μL rTaq酶。反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火60 s，72℃延伸60 s，35个循环，72℃后延伸5 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送广州艾基生物有限公司测序。根据测序结果设计mitf 5′race和3′race巢氏引物(表 1)，通过Smarter Race 5′/3′ kit components (TaKaRa)进行5′末端和3′末端序列扩增。扩增后PCR产物进行胶回收、连菌、37℃培养过夜，挑选阳性克隆进行测序。利用软件Vector NTI将mitf 5′端、3′端及其中间序列拼接，从而获得橘色双冠丽鱼完整mitf cDNA序列(图 1和图 2)。

表 1(Tab.1)

表 1 引物序列 Tab.1 Primer sequences 引物名称Primer name 序列Sequence (5′~3′) 用途Purpose mitf-F CAGCAGGTGAGGCAGTATC mitf1、mitf2基因核心片段扩增 mitf-R TCTGTAGGTATCTGGTCAAAGG mitf1-5′-R ACTGGTGGGTCGCTATAAATC mitf1、mitf2基因5′端扩增 mitf1-5′-R1 AAGGTGATGGTGCCGTTGTTGAG mitf2--5′-R GGAAACATCTGGAGACATTGAG mitf-3′-F TTCTTGGTGACTGCCCATCCGAG mitf1、mitf2基因3′端扩增 mitf-3′-F1 CCTCAACAACGGCACCATCACCTT mitf1-RT-F ACGGCAAGAAGAAAACC qRT-PCR mitf1-RT-R TTCTCGCAGTTGGAGCTAAGG mitf2-RT-F ACAGTCATTATCAGGTGC mitf2-RT-R TCTCTTTCTCACAGTTGG β-actin-F TTGTTTCAGCCAGTTCCC 参照基因 β-actin-R AACCAAACCTGCATTCGC Reference gene

表 1 引物序列 Tab.1 Primer sequences

图 1(Fig. 1)

图 1 橘色双冠丽鱼mitf1基因cDNA全长及氨基酸序列 Fig.1 Full-length sequence of cDNA and deduced amino acid sequences of mitf1 in A. citrinellus 方框为起始密码子ATG；*代表终止密码子；灰色阴影区域代表bHLHzip结构域。下同 Grey box is the initiation codon; "*" is the termination codon; Grey shade is bHLHzip domain. The same as below

图 1(Fig. 1)

图 2 橘色双冠丽鱼mitf2基因cDNA全长及氨基酸序列 Fig.2 Full-length sequence of cDNA and deduced amino acid sequences of mitf2 in A.citrinellus

将拼接好的橘色双冠丽鱼mitf基因在NCBI数据库中通过blast功能进行同源性分析，利用ORF finder查找开放阅读框；采用ExPASy ProtParam分析MITF蛋白的理化性质，包括蛋白质分子量、理论等电点、亲水系数等；借助Signal IP 4.1进行信号肽预测；利用TMHMM 2.0查找跨膜结构域；使用NetPhos 3.1工具进行磷酸化位点的查找；通过NetNGlyc 4.0查找糖基化位点，借助InterPro进行氨基酸结构域的分析；使用SOPAMA预测蛋白质二级结构；利用MEGA 7软件构建系统进化树。

通过RNA提取试剂盒提取各胚胎、组织样品RNA，利用琼脂糖凝胶电泳和酶标仪检测其完整性及浓度。取1 ng RNA用EVOM-MLV反转录试剂盒合成cDNA第一链，存于–20℃冰箱待用。根据mitf1、mitf2基因全长设计特异性引物(表 1)，以β-actin为内参基因，采用Real-Time PCR方法在QuantStudio6 Flex仪器上对橘色双冠丽鱼各时期胚胎和不同组织进行荧光定量分析。20 μL反应体系：SYBR Green master mix 10 μL，ddH₂O 8 μL，cDNA 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL。反应条件：50℃ 2 min，95℃ 5 min；95℃变性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环，每个样品3个重复。mitf基因相对表达量的具体计算公式参考蒋燕玲等(2016)。利用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比较。

获得橘色双冠丽鱼mitf基因2个亚型mitf1和mitf2，其中，mitf1 cDNA全长为1816 bp，5′UTR长158 bp，3′UTR长428 bp，开放阅读框(ORF)为1230 bp，共编码409个氨基酸。预测其蛋白质分子量为39.1 kDa，理论等电点为5.23，亲水性系数为–0.603。TMHMM2.0查找发现无跨膜结构。磷酸化位点分析显示，该蛋白包含27个丝氨酸(S)磷酸化位点、9个苏氨酸(T)磷酸化位点、5个酪氨酸(Y)磷酸化位点。使用SOPAMA预测蛋白二级结构，其中，α螺旋结构131个(占37.01%)，β折叠22个(占6.21%)，无规则卷曲结构177个(占50%)，延展链结构24个(占6.78%)。

mitf2的cDNA全长为1638 bp，5′UTR长160 bp，3´UTR长428 bp，ORF为1050 bp，共编码349个氨基酸。预测其蛋白质分子量为38.5 kDa，理论等电点为5.23，亲水系数为–0.645。mitf1和mitf2氨基酸序列比对结果显示(图 3)，mitf1亚型氨基酸序列与mitf2亚型相比，在0~53的位置多53个氨基酸，82~86的位置多5个氨基酸，其余位置完全相同。TMHMM 2.0查找发现无跨膜结构。磷酸化位点分析显示，该蛋白包含27丝氨酸(S)磷酸化位点、9个苏氨酸(T)磷酸化位点、5个酪氨酸(Y)磷酸化位点。使用SOPAMA预测蛋白二级结构(图 4)，其中，α螺旋结构142个(占40.69%)，β折叠14个(占4.01%)，无规则卷曲结构174个(占49.86%)，延展链结构19个(占5.44%)。与mitf1蛋白二级结构相比，除0~53和82~86位置多出氨基酸及个别位点结构不同外，二级结构基本一致。

图 1(Fig. 1)

图 3 橘色双冠丽鱼mitf1、mitf2基因的氨基酸序列比对 Fig.3 Amino acid sequence alignment of mitf1 and mitf2 genes in A. citrinellus

图 1(Fig. 1)

图 4 橘色双冠丽鱼MITF1、MITF2蛋白二级结构预测 Fig.4 Prediction of the secondary structure of MITF1 and MITF2 proteins in A. citrinellus A：MITF1；B：MITF2；h：α螺旋；e：延展链；c：无规则卷曲；t：β折叠；灰色方框为MITF1、MITF2蛋白二级结构的相同部分 A: MITF1; B: MITF2; h: Alpha helix; e: Extended strand; c: Random coil; t: Beta turn; Grey boxed are the consensus of the secondary structure of MITF1 and MITF2 proteins

橘色双冠丽鱼2个亚型mitf1和mitf2的bHLHzip结构氨基酸序列与大多数物种高度一致，表明bHLHzip结构在进化过程中较为保守。利用MegAlign软件分析橘色双冠丽鱼mitf氨基酸序列与其他物种的同源性(表 2)，结果显示，橘色双冠丽鱼mitf1氨基酸序列与斑马拟丽鱼(Maylandia zebra)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)和萨伊蓝六间(Cyphotilapia frontosa)等鱼类同源性最高，分别为90.7%、91.9%和93%，与其他硬骨鱼类如大黄鱼(Larimichthys crocea)、斑鱼(Channa argus)和孔雀鱼(Poecilia reticulata)也有较高的同源性，分别达到了85.6%、87.4%和82.1%，而与人(Homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、鸡(Gallus gallus)和非洲爪蟾(Xenopus laevis)则相对较低，只有60%、60.9%、58.9%和63.1%。橘色双冠丽鱼mitf2氨基酸序列与人、黑猩猩、鸡和非洲爪蟾同源性同源也相对较低，分别为59.8%、60.9%、58.5%和64.4%，而与尼加拉瓜湖始丽鱼(Archocentrus centrarchus)、伯氏朴丽鱼(Haplochromis burtoni)、布氏新亮丽鲷(Neolamprologus brichardi)和盲曹鱼(Lates calcarifer)同源性则相对较高，都达到了90%以上。

表 2(Tab.2)

表 2 mitf1、mitf2氨基酸序列的同源性 Tab.2 GenBank accession number and the identity of mitf1 and mitf2 物种(登录号) Species (Accession No.) mitf1同源性 mitf1 identity /% mitf2同源性 mitf2 identity /% 黑猩猩Pan troglodytes (XP_009444117.2) 60.9 60.9 人Homo sapiens (NP_001171896.1) 60.0 59.8 鼠Mus musculus (NP_032627.1) 60.0 59.3 牛Bos taurus (XP_015314994.1) 60.4 60.3 野猪Sus scrofa (XP_013837338.2) 61.3 60.9 半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis (XP_016891652.1) 60.8 63.2 犬Canis lupus familiaris (AAQ74413.1) 61.0 60.3 非洲爪蟾Xenopus laevis (BBA54891.1) 63.1 64.4 鸡Gallus gallus (BAA25648.1) 58.9 58.5 斑马拟丽鱼Maylandia zebra (XP_024658401.1) 90.7 94.8 尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus (XP_005450213.1) 91.9 94.5 萨伊蓝六间Cyphotilapia frontosa (ABD48780.1) 93.0 95.1 大黄鱼Larimichthys crocea (XP_027138861.1) 85.6 87.1 斑鱼Channa argus (AMA02077.1) 87.4 88.1 孔雀鱼Poecilia reticulata (ABI64148.1) 82.1 83.5 斑马鱼Danio rerio (XP_021332449.1) 68.8 67.8 虹鳟Oncorhynchus mykiss (XP_021425474.1) 77.7 77.9 大马哈鱼Oncorhynchus tshawytscha (XP_024237694.1) 76.3 77.6 尼加拉瓜始丽鱼Archocentrus centrarchus (XP_030584900.1) 98.0 99.4 伯氏朴丽鱼Haplochromis burtoni (XP_014184787.1) 93.0 95.1 布氏新亮丽鲷Neolamprologus brichardi (XP_006784801.1) 91.5 93.7 盲曹鱼Lates calcarifer (XP_018554530.1) 87.8 90.8 大西洋玛丽鱼Poecilia mexicana (XP_014858201.1) 83.1 84.2

表 2 mitf1、mitf2氨基酸序列的同源性 Tab.2 GenBank accession number and the identity of mitf1 and mitf2

以邻接法(Neighbor-joining)构建橘色双冠丽鱼MITF1、MITF2系统进化树(图 5)。进化树分为两大支，哺乳类、鸟类、爬行类聚为一大支，橘色双冠丽鱼与其他慈鲷科、鲑科、鲤科鱼类聚为另一大支。其中，橘色双冠丽鱼MITF1、MITF2和尼加拉瓜湖始丽鱼聚为一小支，与斑马拟丽鱼、布氏新亮丽鲷、伯氏朴丽鱼、萨伊蓝六间、尼罗罗非鱼等鱼类亲缘关系最近；而与人、黑猩猩、小鼠、原鸡、非洲爪蟾等亲缘关系则相对较远。

图 1(Fig. 1)

图 5 MITF1、MITF2蛋白质序列系统进化树 Fig.5 The phylogenetic tree of protein sequences of MITF1 and MITF2

mitf1在8个胚胎发育时期均有不同程度的表达，其中，受精卵时期表达量最高，显著高于其他7个时期(P < 0.05)，随着胚胎的发育，表达量逐渐下降，在神经期和视泡期只有微量表达。胚胎在发育至听泡期时表达量骤然上升(P < 0.05)，随后在心脏形成期和血液循环期又呈现下降趋势(图 6)；mitf2在橘色双冠丽鱼胚胎发育的8个时期也均有表达，在受精卵时期表达量最高，显著高于其他发育时期(P < 0.05)。在卵裂期、原肠期表达量骤然降低，只有微量表达。发育至神经期时表达量升高，直至血液循环期均呈上升趋势，表达量不断增加(图 7)。

图 1(Fig. 1)

图 6 mitf1在胚胎8个发育时期的表达差异分析 Fig.6 Analysis of mitf1 gene expression at eight developmental stages 不同字母代表差异显著(P < 0.05)。下同 Different letters show significant difference (P < 0.05). The same as below

图 1(Fig. 1)

图 7 mitf2在胚胎8个发育时期的表达差异分析 Fig.7 Analysis of mitf 2 gene expression at eight developmental stages

橘色双冠丽鱼在“黑色–灰色–黄色”3个典型的体色过渡时期，在皮肤、鳞片、尾鳍，mitf1、mitf2均有不同程度的表达(图 8和图 9)。其中，在黑色过渡期皮肤中mitf1表达量最高，显著高于灰色和黄色过渡期(P < 0.05)，灰色过渡期表达量略高于黑色过渡期，但无显著差异，整体呈逐渐下降的趋势，在鳞片和尾鳍中，mitf1的表达趋势与在皮肤中基本一致；在皮肤中，mitf2在黑色过渡期表达量最高，随着橘色双冠丽鱼发育，表达量逐渐降低，但无显著差异(P > 0.05)，在鳞片和尾鳍中，mitf2在3个过渡时期的表达量同样呈现下降的趋势，黑色过渡期表达量最高，显著高于灰色过渡期和黄色过渡期(P < 0.05)，灰色过渡期表达量高于黄色过渡期，但无显著差异(P > 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 8 mitf1在不同体色过渡时期的表达差异分析 Fig.8 Analysis of mitf1 gene expression at different periods of color transition A：皮肤；B：鳞片；C：尾鳍 A: Skin; B: Scale; C: Tail fin

图 1(Fig. 1)

图 9 mitf2在不同体色过渡时期的表达差异分析 Fig.9 Analysis of mitf2 gene expression at different periods of color transition A：皮肤；B：鳞片；C：尾鳍 A: Skin; B: Scale; C: Tail fin

通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测mitf1和mitf2在橘色双冠丽鱼不同组织中的表达差异(图 10)。结果显示，mitf1在各个组织中均有表达，眼部表达量最高，显著高于其他6个组织(P < 0.05)，肌肉、肾、心脏、脑表达量也相对较高，性腺和鳃表达量则相对低一些。mitf2在7个组织中也均有表达，眼部表达量同样显著高于其他组织(P < 0.05)，在鳃、脑、性腺、心脏组织中的表达量极低，只有微量的表达，肾和肌肉中的表达量也相对较低(图 11)。

图 1(Fig. 1)

图 10 mitf1在7种组织中的表达差异分析 Fig.10 Analysis of mitf1 gene expression in seven tissues

图 1(Fig. 1)

图 11 mitf2在7种组织中的表达差异分析 Fig.11 Analysis of mitf2 gene expression in seven tissues

通过RACE技术获得橘色双冠丽鱼mitf基因cDNA全长，2个亚型MITF1和MITF2均具有3个结构域：靠近N末端的MITF_TFEB_C_3_N结构域、bHLHZip结构域和一个未知功能结构域(DUF3371)。bHLHZip结构域作为MITF蛋白的功能区域，在进化过程中高度保守，其中，HLHZip区域能够与自身或转录因子TFEB (transcription factor EB)、TFEC、TFE3形成同源或异源二聚体，通过Basic区域与特异的DNA结合行使蛋白功能，特异性DNA指包含5′-CACGTG-3′或5′-TCATGTG-3′结构的DNA序列，即E-box或M-box (Bentley et al, 1994; Hemesath et al, 1994)。在哺乳动物中，受不同启动子调控，mitf编码多个蛋白质异聚体，包括MITF-A、B、C、D、E、H、J、M、MC、CM等(Hershey et al, 2005; Shiohara et al, 2008)，在鱼类中，从斑马鱼、青鳉分离得到mitf的2种亚型mitfa和mitfb (Altschmied et al, 2002)，这2种亚型在功能上发生了分化，mitfa对黑色素细胞的形成、增殖、迁移和分化起着重要的调控作用，而mitfb不参与黑色素细胞的发育，只在眼色素上皮细胞中表达，参与眼调控的发育(Lister et al, 2014)，本研究克隆的mitf1和mitf2为mitf基因2个亚型，均属于mitfa亚型，理化性质分析结果显示，mitf1和mitf2的蛋白质二级结构极为相似，荧光定量结果显示，mitf1和mitf2除了在胚胎期表达量有差异外，在各个组织和各转换时期表达量变化趋势基本一致，因此，推测mitf1和mitf2更多保留了mitfa基因功能，未出现明显基因功能分化。同源比对发现，橘色双冠丽鱼mitf1、mitf2与尼加拉瓜湖始丽鱼、萨伊蓝六间、斑鱼等鱼类具有较高的同源性，与哺乳类、鸟类、爬行类等同源性较低，符合橘色双冠丽鱼传统进化地位。

mitf1和mitf2在橘色双冠丽鱼8个胚胎发育时期均有表达，其中，在受精卵时期表达量最高，显著高于其他发育期(P < 0.05)，表现出明显的时期特异性。研究发现，mitf基因也在其他动物胚胎发育期开始表达，但表达的时期较晚，如非洲爪蟾胚胎在21/22期开始表达(Kumasaka et al, 2010)，鸡(Mochii et al, 1998)和鼠(Mus musculus)(Nakayama et al, 1998)胚胎则在5日龄和9.5日龄开始表达。在青鳉中，mitf基因在胚胎整个发育过程中最早表达于2细胞期(Li et al, 2013a、b)，这与橘色双冠丽鱼表达模式相类似。蒋燕玲等(2016)对橘色双冠丽鱼胚胎组织学观察发现，黑色素细胞在血液循环期才开始出现，而mitf在受精卵时期即出现高表达现象，结合前人报道，推测鱼类发育早期mitf不仅调节黑色素细胞分化和发育，对视网膜色素上皮细胞、破骨细胞和肥大细胞也有不同程度的调控作用(Bauer et al, 2009)。在卵裂期，mitf1、mitf2基因表达量骤减，mitf1随胚胎发育表达量继续降低直至听泡期骤升后又继续下降，而mitf2随胚胎发育表达量逐渐升高直至血液循环期，仍呈现上升趋势，预示mitf基因可能在黑色素细胞的发育过程中扮演着十分重要的角色。

在3个体色过渡时期中，皮肤、鳞片、尾鳍的mitf1和mitf2的表达量均呈逐渐下降的趋势，其中，黑色时期表达量最高，除皮肤的mitf2基因表达量在3个过渡时期无显著差异外，黑色时期鳞片和尾鳍中的表达量显著高于灰色期和黄色期，与mitf下游基因TYR在橘色双冠丽鱼不同褪黑时期逐渐降低的表达模式基本一致(蒋燕玲等, 2016)。这与鱼体表面各种色素细胞的比例与分布也存在对应关系，韦敏侠等(2015)研究发现，橘色双冠丽鱼在黄色时期皮肤中的黄色素细胞和红色素细胞数量和分布比例增多，黑色素细胞相对减少且处于凝集状态。在红鲫鱼发育过程中，mitfa基因也呈现相同的表达趋势，通过组织学观察发现，红鲫鱼黑色素细胞数量随着其发育的进行逐渐减少，体色由灰色逐渐过渡至红色，mitfa表达量随之降低(Zhang et al, 2017)。Liu等(2015)检测了不同品系锦鲤中mitfa基因表达量，发现含有黑色素细胞较多的, 体色偏白或偏黑的锦鲤mitfa表达量较高，而含黑色素细胞较少的，体色呈红白或全黄的锦鲤皮肤的mitfa表达量偏低，表明mitfa表达量与黑色素细胞数量和分布比例呈正相关，印证了mitfa基因对黑色素细胞发育和分布的重要作用，本研究中mitf1和mitf2均属于mitfa，且也在黑色期表达量最高，与此结果相对应。而且黄色时期橘色双冠丽鱼皮肤中可检测到mitfa基因的表达(Liu et al, 2015)，可见其可能还参与调控其他色素细胞形成。

mitf1、mitf2亚型在橘色双冠丽鱼各组织中均有表达，与mitf在青鳉中的表达趋势相类似(Li et al, 2013a、b)，其中，眼部表达量最高且显著高于其他组织，表明mitf基因参与了橘色双冠丽鱼眼的发育调节。在哺乳动物中，大量研究表明，mitf基因的突变可能导致眼畸形的发生，如小鼠眼畸形(Hertwig, 1942)、犬眼睛出现缺陷(Stritzel et al, 2009)、牛眼睛变小(Wiedemar et al, 2014)等均与mitf缺失有着密切关系，mitf基因在哺乳动物眼睛发育中有着不可或缺的作用。脉络膜裂(CF)的闭合是眼睛发育的一个关键步骤，研究显示，mitf基因在颅神经嵴细胞中发挥作用，促进脉络膜裂的闭合，是眼睛正常发育必不可少的调节基因(Michael et al, 2018)。但Lane等(2012)研究发现，在具有mitfb基因突变的斑马鱼或mitfa、mitfb双基因突变的斑马鱼中，其眼部发育正常，与野生型斑马鱼无明显差异，这一结果说明了mitf基因在斑马鱼眼睛发育过程中并非是必要的，这一结论具有颠覆性。因此，mitf基因在动物眼睛发育过程中是否为必需基因值得探讨，但本研究中，mitf1和mitf2均表现为眼部表达量最高，仍然支持其在眼睛发育中起着必不可少的作用。