2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室 山东 青岛 266071;
3. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室 山东 青岛 266071;
4. 江苏海洋大学 江苏省海洋生物资源与环境重点实验室/江苏省海洋生物技术重点实验室 江苏 连云港 222005
2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao, Shandong 266071, China;
3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao, Shandong 266071, China;
4. Bioresources and Environment/Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Jiangsu Ocean University, Lianyungang, Jiangsu 222005, China
近年来，随着养殖技术的快速发展及市场需求的增加，高密度集约化养殖已成为主流养殖模式，水体中残饵和排泄物使得氨氮超标成为一种常态化的环境问题(Zhang et al, 2018)。水体中氨氮以非离子氨(NH3)和铵离子(NH4+)形式存在的氮，二者动态平衡，受水质的温度、盐度和pH等参数影响可相互转换(周平, 2013; 蔡真珍等, 2015)。氮主要是以NH3形式经鳃组织进入甲壳动物机体(Roumieh et al, 2013)。氨氮中毒会导致甲壳动物免疫低下、生长迟缓，同时伴随炎症反应和氧化应激等(Koo et al, 2005; Chen et al, 1995; Cheng et al, 2002)。研究发现，由于环境胁迫因子改变诱导的生理效应可能经氧化还原途径实现(Romano et al, 2007)，当机体受到氨氮胁迫且超出自身调节阈值时，抗氧化系统被破坏，机体清除活性自由基(reactive oxygen species, ROS)能力下降，脂质过氧化产物增加，导致机体氧化损伤(Reinehr et al, 2007)。
目前，关于水产动物氨氮转运代谢机制的研究已有一定基础，主要通过以下代谢途径减少生物体内氨氮的积累，从而降低毒性：(1)通过谷氨酰胺合成途径，如斑节对虾(Penaeus monodon) (周发林等, 2016)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) (熊大林等, 2019)等可通过谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)等合成谷氨酰胺实现机体内氨的转运；(2)通过氨基酸代谢途径，如大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris) (杨洋等, 2019)、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus) (Chew et al, 2001)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)(孟振等, 2020)等通过相关转氨脱氢酶将氨转化为自由氨基酸储存；(3)通过鸟氨酸循环途径，如中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis) (李少飞等, 2014)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) (刘胜男等, 2015)等通过鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)结合精氨酸酶(arginase)等形成尿素；(4)通过嘌呤核苷酸分解途径，如挪威海螯虾(Nephrops norvegicus) (Bernasconi et al, 2011)等可经黄嘌呤氧化还原酶(xanthine oxidoreductase, XOD)等形成尿酸。
锦绣龙虾隶属于十足目(Decapoda)、腹胚亚目(Pleocyemata)、龙虾科(Palinuroidea)、龙虾属(Panulirus) (梁华芳等, 2012)。锦绣龙虾(Panulirus ornatus)作为我国主要龙虾养殖品种之一，经济价值高，但其人工繁育尚未突破，主要依靠捕捞野生苗种(Liu et al, 2016; 梁华芳等, 2012)，利用适温的地下海水进行陆基工厂化流水养殖和循环水集约化养殖。高密度的养殖条件下，氨氮已成为影响虾类正常生理代谢的重要环境因素之一。氨氮胁迫下，甲壳动物解毒代谢机制方面的研究主要集中在谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶、谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase, GOT)等(赵海涛, 2006; Qiu et al, 2018; Geng et al, 2020)。本研究侧重于锦绣龙虾的解毒代谢途径在氨氮胁迫下的响应机制，测定了氨氮胁迫下锦绣龙虾鳃及肝胰腺组中代谢关键酶GS、GDH、GOT、XOD活性和GDH、GOT基因mRNA表达量、抗氧化酶总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化(SOD)活性及过氧化脂质(LPO)含量，旨在为锦绣龙虾氨解毒代谢机制的深入研究提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用锦绣龙虾购于海南省琼海市永贺生物科技有限责任公司，平均体长为(15.6±0.2) cm，平均体重为(187.0±0.5) g，暂养于黑色PVC桶中，实验用水为过滤净化后的天然海水，盐度为32.57，水温为23.7℃，pH为8.14，每日07:00更换砂滤海水，连续充气，10 d后开始正式实验。
1.2 实验方法 1.2.1 实验设计实验浓度设置参考Chen (1988)和钟硕良等(1997)测定海水养殖池塘底层水的氨氮浓度(0~46 mg/L和0.01~29.3 mg/L)、Zhao(2020)关于氨氮对虾类生理免疫影响的汇总以及预实验结果，选用NH4Cl (分析纯，RG≥99.5%)配置不同实验组的氨氮浓度，分别为对照组(0.24±0.07) mg/L、低浓度组(1.04±0.08) mg/L、中浓度组(9.75±0.21) mg/L和高浓度组(19.87±0.46) mg/L。采用奈氏试剂法测定各实验组实际氨氮浓度。每组3个平行，每天07:00和17:00按照对应浓度梯度进行全换水，实验期间不投饵。
1.2.2 样品采集和处理在胁迫0、6、12、24和48 h时，从每组的每个平行中随机挑选3尾龙虾，快速解剖取得鳃、肝胰腺组织，分别称取0.2 g，剪碎后加入1∶9的预冷生理盐水，超声波冰浴破碎，4℃低温4000 r/min离心20 min，取上清液，置于–80℃冰箱保存，用于酶活测定。剩余组织放于1.5 mL EP管投入液氮中储存，用于基因mRNA表达量分析。
1.2.3 氧化酶与氨氮代谢相关酶活性测定按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书测定T-AOC、SOD、GS、GDH、GOT、XOD酶活力和LPO含量。
1.3 基因mRNA的表达分析 1.3.1 引物设计根据锦绣龙虾目的基因cDNA序列，利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计qRT-PCR引物，上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，其序列见表 1。
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表 1 本研究所用引物 Tab.1 Primers used in this study |
使用总RNA提取试剂盒提取处理后组织RNA，核酸定量仪检测RNA浓度，1.5%非变性琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。
1.3.3 cDNA第一链的合成组织RNA经过RNA-free的DNA酶消化后，使用HiScript®Ⅱ Q RT superMix for qPCR(+g DNA wiper)试剂盒进行反转录合成cDNA第一链，–20℃保存备用。
1.3.4 荧光定量PCR扩增按照ChamQTM SYBR® Color qPCR master mix说明书进行PCR扩增。反应体积10 μL：5.0 μL SYBR color qPCR master mix (2×)，4.0 μL cDNA，0.2 μL Rox reference dyeⅡ (50×)，上下游引物各0.4 μL (10 μmol/L)，将上述试剂在1.5 mL离心管内混匀后，分装入96孔PCR板中。反应程序：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。每个样品3个重复，加样完成后瞬时离心，收集液体在管底，在ABI 7500 Fast荧光定量PCR仪进行扩增，使用2–ΔΔCt法计算目的基因GDH、GOT的相对表达量。
1.4 数据分析所有分析采用SPSS 18.0.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，使用OriginPro 2016软件作图。
2 结果与分析 2.1 氨氮胁迫对锦绣龙虾氨氮代谢相关酶活性的影响 2.1.1 对锦绣龙虾鳃和肝胰腺GS活性的影响如图 1所示，对照组谷氨酰胺合成酶(GS)活性变化不显著(P > 0.05)，各时间低、中浓度组鳃和肝胰腺GS活力点均显著高于对照组(P < 0.05)，高浓度组GS活力在48 h受到显著抑制(P < 0.05)。不同浓度组鳃组织GS活性呈先升高后降低的变化趋势，除24 h高浓度组与对照组无显著差异外(P > 0.05)，其他时间点均有显著差异(P < 0.05)。不同浓度组肝胰腺GS活力均在12 h达到最大值，随后低浓度组无明显变化趋势，中、高浓度组呈下降趋势。
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图 1 锦绣龙虾不同组织谷氨酰胺合成酶活性随氨氮胁迫时间的变化 Fig.1 Change of GS activity in different P. ornatus tissues after acute ammonia stress A：鳃；B：肝胰腺。不同字母表示不同组之间差异显著(P < 0.05)。下同 A: Gill; B: Hepatopancreas. Different letters indicate significant difference in different groups (P < 0.05). The same as below |
如图 2所示，随着胁迫时间的延长，中、高浓度组鳃和肝胰腺中的谷氨酸脱氢酶(GDH)活力呈先升高后降低的变化趋势。中浓度组鳃GDH活力在12 h达到最大值且显著高于其他组(P < 0.05)，高浓度组在48 h时显著低于对照组(P < 0.05)。中、高浓度组肝胰腺GDH活力最大值分别出现在6 h和12 h，与对照组相比具有显著差异(P < 0.05)。
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图 2 锦绣龙虾不同组织谷氨酸脱氢酶活性随氨氮胁迫时间的变化 Fig.2 Change of GDH activity in different P. ornatus tissues after acute ammonia stress A：鳃；B：肝胰腺 A: Gill; B: Hepatopancreas |
如图 3所示，低浓度组鳃谷草转氨酶(GOT)活力在6~ 48 h变化规律不明显，但与对照组均有显著差异(P < 0.05)。中浓度组呈先升高后下降的趋势，高浓度组出现先降低后升高再降低的波浪式变化，最大值均出现在12 h且显著高于对照组(P < 0.05)。48 h高浓度组鳃GOT活力受到显著抑制(P < 0.05)。中浓度组肝胰腺GOT活力出现先升高后降低再升高的波浪式变化，高浓度组呈先升高后下降的变化趋势。
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图 3 锦绣龙虾不同组织GOT活性随氨氮胁迫时间的变化 Fig.3 Change of GOT activity in different P. ornatus tissues after acute ammonia stress A：鳃；B：肝胰腺 A: Gill; B: Hepatopancreas |
如图 4所示，随着胁迫时间的延长，各浓度组鳃黄嘌呤氧化酶(XOD)活力呈先上升后下降的变化趋势，中、高浓度组XOD活力显著升高，分别在12、24 h均达到最大值且显著高于对照组(P < 0.05)。低、中浓度组各时间点肝胰腺XOD活力均显著高于对照组(P < 0.05)。而高浓度组6~24 h均显著高于对照组(P < 0.05)，48 h肝胰腺XOD活力受到显著抑制(P < 0.05)。
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图 4 锦绣龙虾不同组织黄嘌呤氧化酶活性随氨氮胁迫时间的变化 Fig.4 Change of XOD activity in different P. ornatus tissues after acute ammonia stress A：鳃；B：肝胰腺 A: Gill; B: Hepatopancreas |
如图 5所示，各浓度组鳃和肝胰腺谷氨酸脱氢酶(GDH)基因相对达量表现出明显的时效性。低、中浓度组鳃组织GDH相对表达量呈现先上升后下降再上升的变化趋势，除6 h外，各时间点均显著高于对照组(P < 0.05)。而高浓度组鳃组织GDH相对表达量则呈先上升后下降的趋势。不同浓度组肝胰腺GDH相对表达量均呈先上升后下降的变化趋势，除48 h外，各时间点均与对照组有显著差异(P < 0.05)。
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图 5 锦绣龙虾不同组织GDH基因相对表达量随氨氮胁迫时间的变化 Fig.5 Relative gene expression of GDH in different P. ornatus tissues after acute ammonia stress A：鳃；B：肝胰腺 A: Gill; B: Hepatopancreas |
如图 6所示，低、中浓度组鳃谷草转氨酶(GOT)基因的相对表达量呈先升高后降低再升高的波浪式变化，高浓度组则出现先升高后下降的变化趋势，除6 h外，其余各时间点鳃GOT相对表达量均显著高于对照组(P < 0.05)。随着胁迫时间的延长，中、高浓度组肝胰腺GOT相对表达量最大值均出现在12 h，与对照组相比具有显著差异(P < 0.05)，除48 h外，各时间点均与对照组有显著差异(P < 0.05)。
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图 6 锦绣龙虾不同组织GOT基因相对表达量随氨氮胁迫时间的变化 Fig.6 Relative gene expression of GOT in different P. ornatus tissues after acute ammonia stress A：鳃；B：肝胰腺 A: Gill; B: Hepatopancreas |
如图 7所示，随着胁迫时间的延长，低浓度组鳃T-AOC活力呈持续升高的趋势，而中、高浓度组均呈先升高后下降的变化趋势，最大值均出现在12 h且显著高于对照组(P < 0.05)。中、高浓度组肝胰腺T-AOC活性最大值分别出现在12 h和6 h，与对照组相比差异显著(P < 0.05)。低、中浓度组48 h T-AOC活性仍显著高于对照组(P < 0.05)，高浓度组则被显著抑制(P < 0.05)。
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图 7 锦绣龙虾不同组织T-AOC活性随氨氮胁迫时间的变化 Fig.7 Change of T-AOC activity in different P. ornatus tissues after acute ammonia stress A：鳃；B：肝胰腺 A: Gill; B: Hepatopancreas |
如图 8所示，在胁迫过程中，各浓度组SOD活性随胁迫时间的延长均呈先上升后下降的趋势。低、中浓度组鳃SOD活性最高值均出现在12 h，高浓度组则在6 h，且均显著高于对照组(P < 0.05)。低、中浓度组肝胰腺SOD活性最大值均出现在12 h，与对照组相比有显著差异(P < 0.05)。高浓度组SOD活性在48 h被显著抑制(P < 0.05)。
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图 8 锦绣龙虾不同组织SOD活性随氨氮胁迫时间的变化 Fig.8 Change of SOD activity in different P. ornatus tissues after acute ammonia stress A：鳃；B：肝胰腺 A: Gill; B: Hepatopancreas |
锦绣龙虾肝胰腺中脂质过氧化物(LPO)含量明显高于鳃组织(图 9)。低、中浓度组鳃和肝胰腺LPO含量逐步提升，高浓度组呈先升高后下降的变化趋势，不同浓度组在48 h均与对照组有显著差异(P < 0.05)。
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图 9 锦绣龙虾不同组织脂质过氧化物含量随氨氮胁迫时间的变化 Fig.9 Change of LPO content in different P. ornatus tissues after acute ammonia stress A：鳃；B：肝胰腺 A: Gill; B: Hepatopancreas |
研究表明，当水体环境中氨氮含量发生改变时，水生生物排泄方式也会发生变化，尿素排泄量增加(Chen et al, 1995)。在浓度为25 mmol/L氨氮胁迫下，砂栖胡鲶(Clarias magur)谷氨酰胺和尿素含量显著增加，认为其在高氨水平下可诱导鸟氨酸–尿素循环将氨解毒为谷氨酰胺和进一步转化为尿素排泄来缓解氨氮毒性(Bodhisattwa et al, 2018)。金鱼(Carassius auratus)在浓度为3.6 mmol/L的高氨水平下，脑中谷氨酰胺增加4倍(Wilkie et al, 2015)。本研究结果显示，氨氮胁迫下，低、中浓度组GS酶活在氨氮胁迫12 h内急速升高，随后在24 h显著下降，为了降低氨氮在体内的积累，机体可能通过主动运输或者被动扩散的方式消除多余的氨氮，同时启动解毒代谢机制，表明锦绣龙虾具有一定的氨氮耐受能力。但48 h时，高浓度组GS酶活受到抑制，长时间氨氮胁迫使机体调节能力越来越弱，龙虾体内会出现过多的自由基而抑制相关酶活力，相关研究还见于中华乌塘鳢(Bostrichthys sinensis) (Anderson et al, 2002)、三疣梭子蟹(刘胜男等, 2015)等。氨氮胁迫组GDH活力的显著上调与周发林等(2016)的实验结果基本一致，表明在氨氮胁迫下将氨合成中性、无毒的谷氨酰胺是锦绣龙虾重要的氨代谢途径。随着胁迫时间的延长，锦绣龙虾体内氨氮逐渐积累，其排泄方式发生改变，6 h后GOT表达量显著上调，推测是其催化转氨反应生成天门冬氨酸参与尿素形成的缘故。虽然然而尿素形成十分消耗能量，甲壳动物的主要排氨途径仍是合成谷氨酰胺，GOT表达量再次下调。氨氮胁迫下，各浓度组XOD活性显著高于对照组，并表现出一定的剂量效应，24 h后，XOD活性显著下调，可能是胁迫前期产生的尿酸使XOD活性受到抑制。不同处理组48 h XOD活性具有显著差异，在肝胰腺组织中尤为明显。高浓度组XOD活性呈逐渐下降状态，且显著低于对照组。可能是由于水体中氨氮浓度过大，肝细胞遭到破坏的缘故。张克俭(1993)发现，当氨氮浓度高于10.44 mg/L时，中国明对虾肝胰腺中的吸收细胞部分转化为分泌细胞，并逐渐解体，解体后的细胞碎片及大量的溶酶体等结构堆积于肝管部位。推测氨氮胁迫下锦绣龙虾会通过嘌呤核苷酸分解代谢途径将氨转化为尿酸。
GDH是一种需借助辅酶实现谷氨酸生物合成的线粒体酶，作为动物获得能量腺嘌呤核苷三磷酸(adenosinetriphosphate, ATP)的重要途径，GDH催化反应连接着三羧酸循环与谷氨酸，在氨氮代谢过程中发挥重要作用(王秋菊等, 2011)。GOT作为转氨反应的高效催化剂，主要通过辅酶在磷酸吡哆胺(pyrodoxamine photophate, PMP)和磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)之间的相互转换实现氨基的转运(严明等, 2004)。本研究发现，氨氮胁迫下各浓度组与对照组目的基因表达量具有明显差异，高浓度组与低、中组相比，GDH和GOT基因的相对表达量后期下降明显，可能是由于长时间高浓度的胁迫打破了体内平衡，导致锦绣龙虾组织细胞受到损伤。研究结果显示，各处理组GOT和GDH基因表达量与酶活性的变化趋势有部分不同，考虑从基因表达到蛋白合成是一个复杂的修饰加工过程，蛋白活化会受到磷酸化等不定因素的影响，酶的活性也会受活性位点识别及激活因子浓度等多方面的影响，因此，表现出基因表达量与酶活性不一致的现象。这也说明基因的mRNA丰度与翻译产物的表达量不一定具有线性关系(Martin et al, 2008)。
3.2 氨氮胁迫对锦绣龙虾抗氧化系统的影响当机体受到胁迫时，体内ROS含量迅速增加，未被抗氧化系统及时清除的ROS逐渐积累，促使细胞膜脂质过氧化物形成，从而造成氧化损伤(段亚飞等, 2014; Sun et al, 2011)。本研究中，氨氮胁迫初期，锦绣龙虾体内抗氧化酶活力显著升高。强俊等(2011)认为，抗氧化酶活力提升可视为生物体对ROS的适应，从而减轻脂质过氧化损伤。由于毒性效应，低、中浓度组T-AOC、SOD活性于胁迫12 h内呈短暂升高趋势，但随胁迫时间延长，6 h后逐渐受到抑制，高浓度组T-AOC、SOD活性在12 h后呈显著下降趋势。原因可能与氨氮胁迫过程中有毒物质(如LPO)积累量超过机体的耐受上限有关。胁迫初期，较低浓度的氨氮对机体抗氧化酶具有诱导作用，这种诱导作用是由于ROS增加引起的机体代偿。一定时间后，由于歧化反应产生超出了其承受量的H2O2，导致其活力受到抑制(王贞杰等, 2017)。洪美玲等(2007)认为，随着氨氮胁迫时间的延长氨氮的增益效应消失，导致机体抗氧化酶活性下降，与任海等(2014)报道的氨氮胁迫对脊尾白虾抗氧化系统酶活力的影响以及强俊等(2011)报道的氨氮与密度胁迫对罗非鱼幼鱼肝脏抗氧化指标的联合影响结果相似。结合本研究高浓度组鳃和肝胰腺T-AOC和SOD活力在48 h时显著低于对照组，也说明较高浓度的氨氮胁迫对机体产生了一定程度的毒害作用。
LPO作为脂质过氧化反应产生的细胞毒性物质，其含量一定程度反映机体脂质过氧化水平和细胞损伤程度，同时间接反映生物体内ROS含量(何吉祥等, 2016)。本研究发现，不同浓度氨氮胁迫后，肝胰腺LPO含量明显大于鳃组织，可能由于肝胰腺是锦绣龙虾主要的代谢组织。胁迫前期生物体内抗氧化系统被激活，但LPO含量仍在显著上升，说明机体仍然处于脂质过氧化状态。各浓度组鳃和肝胰腺LPO含量均有不同程度的升高，推测由于水中氨氮浓度的升高，导致脂质过氧化作用增强，也进一步提示氨氮胁迫下LPO积累可能是氨氮对锦绣龙虾产生毒害作用的主要原因之一。
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