微卫星又称简单序列重复(simple sequence repeats, SSRs)，广泛分布于真核、原核生物以及病毒中，是由1~6 bp碱基为单元重复串联而成的DNA序列。根据核心序列的排列差异，又分为完整型和不完整型(Morgante et al, 2001)。其中，完整型指重复序列中不存在其他碱基或重复序列的情况，不完整型指重复序列中存在错配情况。目前，对微卫星的研究主要集中于完整型(郑燕等, 2012)，因其具有多态性高、共显性遗传等特点，目前被广泛应用于遗传图谱构建(Shen et al, 2007; Xia et al, 2010)、遗传多样性分析和种质资源保护(Narasimhamoorthy et al, 2008)等研究中。

斑点叉尾(Ictalurus punctatus)，又名沟鲶，是一种原产于北美洲的大型淡水鱼类。由湖北省水产科学院在1984年引入我国后进行驯养，于1987年成功解决人工繁育的难题，成为我国重要的淡水经济鱼类之一(向建国等, 2004)。另外，较强的繁殖能力使其能形成庞杂的品系和群体，成为基因组学研究有代表性的生物群体和实验材料(张涛等, 2019)。

近年来，由于远离原产地多年、亲本数量有限等原因，无可避免地对国内的斑点叉尾群体进行近亲繁殖育种，造成了一定程度的遗传漂变和种质退化等问题。因此，斑点叉尾种质资源的保护越来越受到关注。目前，已有随机扩增长度多态性DNA(RAPD)标记(Liu et al, 1998、1999)、扩增片段长度多态性(AFLP)标记(Mickett et al, 2003; Simmons et al, 2006)和表达序列微卫星(EST-SSR)标记(赫崇波等, 2008)等多种分子标记技术应用于斑点叉尾遗传育种和种质资源方面的研究，而关于斑点叉尾全基因组微卫星分布规律的研究尚未见报道。本研究对斑点叉尾29条染色体上微卫星序列的数量、频率、密度等分布情况进行统计分析，旨在为进一步系统地进行斑点叉尾全基因组微卫星引物的开发、遗传多样性和遗传育种等研究提供基础资料。

斑点叉尾全基因组数据从NCBI Genome数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Ictalurus+punctatus)下载，登录号为GCA_004006655.3，以FASTA格式文件保存，共包含29条染色体，总大小为11 036 941 bp。

利用微卫星搜索软件MISA (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)对斑点叉尾全基因组中完整型微卫星序列进行搜索和统计。本研究统计标准设置为MISA默认参数，经过前期的大量研究可知，以此标准搜索全基因组微卫星得出的结果最优(徐杰杰等, 2020)，即单碱基重复序列最小拷贝数设置为10，二碱基重复序列最小拷贝数设置为6，三、四、五、六碱基重复序列最小拷贝数设置为5。考虑碱基互补配对原则和碱基排列顺序的差异，对可聚为同一类型的微卫星进行兼并统计。

2.1 斑点叉尾全基因组微卫星总体分布特征

从斑点叉尾全基因组中共筛选出510 256个完整型微卫星，总长度为11 036 941 bp，占全基因组DNA序列总长度的1.45%。在斑点叉尾29条染色体中，出现微卫星数量最多的是2号染色体，占微卫星总数的4.96%，其次是3号染色体和1号染色体，分别占4.72%和4.64%。29号染色体在所有染色体中所含微卫星数量最少，仅占2.27%。线性回归分析表明，斑点叉尾微卫星数量和其所在的染色体长度具有显著相关性(SPSS, r=0.98, P < 0.01)，微卫星频率与染色体长度也具有显著相关性(SPSS, r=–0.67, P < 0.01) (图 1、图 2)。

图 1(Fig. 1)

图 1 斑点叉尾各染色体微卫星数量分布 Fig.1 Distribution of SSRs number in each chromosome of I. punctatus

图 1(Fig. 1)

图 2 斑点叉尾各染色体微卫星频率分布 Fig.2 Distribution of SSRs frequency in each chromosome of I. punctatus

2.2 斑点叉尾29条染色体不同重复类型微卫星分布特征

通过统计分析可知，斑点叉尾全基因组1~6碱基重复类型中，含量最高的是单碱基重复类型，其后依次是二碱基和三碱基。在斑点叉尾各染色体碱基重复序列中，除27号和29号染色体二碱基数量大于单碱基外，其余27条染色体均是单碱基微卫星数量最多，其他依次是二碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复类型(表 1、图 3)。

表 1(Tab.1)

表 1 斑点叉尾各染色体上各种类型微卫星数量分布情况 Tab.1 Distribution of different types of SSRs in each chromosome of I. punctatus 染色体 Chromosome 单碱基 Mono- nucleotide 二碱基 Di- nucleotide 三碱基 Tri- nucleotide 四碱基 Tetra- nucleotide 五碱基 Penta- nucleotide 六碱基 Hexa- nucleotide 总数 Total number 占比 Proportion /% 丰度 Abundance /(ind./Mb) chr1 10 706 9314 2026 1541 90 8 23 685 4.64 631.43 chr2 10 765 10 510 2210 1670 113 16 25 284 4.96 678.63 chr3 11 153 9133 1966 1708 106 8 24 074 4.72 671.46 chr4 9397 8655 1805 1477 94 15 21 443 4.20 619.81 chr5 9870 8857 1884 1503 87 14 22 215 4.35 666.09 chr6 9679 7564 1808 1440 94 7 20 592 4.04 640.71 chr7 9182 7664 1763 1344 78 11 20 042 3.93 645.94 chr8 9192 7383 1738 1506 134 9 19 962 3.91 656.43 chr9 9246 7323 1700 1400 95 5 19 769 3.87 654.32 chr10 9319 6579 1671 1309 81 4 18 963 3.72 652.86 chr11 8191 6362 1506 1216 84 14 17 373 3.40 615.89 chr12 8163 7613 1657 1241 94 8 18 776 3.68 667.10 chr13 8010 6474 1517 1187 89 2 17 279 3.39 630.03 chr14 7540 6573 1438 1167 72 9 16 799 3.29 629.18 chr15 7986 7062 1632 1301 81 8 18 070 3.54 692.71 chr16 8445 6545 1555 1214 67 9 17 835 3.50 686.91 chr17 7701 6527 1534 1209 85 7 17 063 3.34 658.37 chr18 8296 6242 1616 1272 75 6 17 507 3.43 714.20 chr19 6657 6175 1265 1031 70 5 15 203 2.98 630.12 chr20 6985 6069 1424 1140 85 9 15 712 3.08 699.23 chr21 6935 5508 1348 995 72 6 14 864 2.91 708.25 chr22 6194 5538 1237 918 65 3 13 955 2.73 702.17 chr23 6590 5309 1281 1049 71 5 14 305 2.80 725.33 chr24 6139 4763 1259 963 64 5 13 193 2.59 669.60 chr25 6063 4649 1209 956 65 4 12 946 2.54 665.34 chr26 5789 5457 1185 977 73 7 13 488 2.64 706.88 chr27 6132 6198 1174 981 69 4 14 558 2.85 785.03 chr28 6124 5438 1148 931 62 7 13 710 2.69 744.33 chr29 4675 5143 998 723 45 7 11 591 2.27 759.74

表 1 斑点叉尾各染色体上各种类型微卫星数量分布情况 Tab.1 Distribution of different types of SSRs in each chromosome of I. punctatus

图 1(Fig. 1)

图 3 斑点叉尾全基因组微卫星各重复类型占比 Fig.3 Distribution of SSRs repeat types in genomes of I. punctatus

2.3 斑点叉尾全基因组微卫星各重复类别特征

在斑点叉尾全基因组微卫星各重复类型中，同种碱基类型的不同类别分布有很大差异。在单碱基重复类型中，以A碱基重复类别最多，C碱基重复类别最少。二碱基重复类型的4种类别中，数量最多的是AC类别，其次是AG和AT，CG类别的数量最小，仅占二碱基类型的0.14%。三碱基类别中，数量最多的是AAT，其次是AAC和AAG。四碱基重复类型中，以AAAT和AAAC类别数量最多。五碱基中前3种类别分别是ATAAT (394个)、AAAAC (223个)和AAAAT (168个)，分别占五碱基的16.69%、9.45%和7.12%。六碱基各类别数量相对于前5种重复类型数量较少且分布较分散，没有出现明显的优势类别。

2.4 斑点叉尾微卫星各重复类型拷贝数分布特征

斑点叉尾各重复类型微卫星的核心序列拷贝数范围差异很大，最小拷贝为5次，最大拷贝为127次，96.66%的微卫星核心序列拷贝数集中在5~30之间。单碱基重复拷贝数主要集中在10~30次，占单碱基所有微卫星数目的98.30%。二碱基重复拷贝数主要集中在5~30次，占二碱基总数目的93.47%。三碱基重复拷贝数主要集中在5~20次，占三碱基总数目的98.28%。四碱基重复拷贝数主要集中在5~14次，占四碱基总数目的98.59%。五碱基重复拷贝数主要集中在5~12次，占五碱基总数目的96.53%。六碱基重复拷贝数主要集中在5~7次，占六碱基总数目的83.78% (图 4)。

图 1(Fig. 1)

图 4 斑点叉尾全基因组微卫星重复类型重复数分布 Fig.4 Distribution of number of base repetitions SSRs repeat types in I. punctatus genome

3.1 斑点叉尾全基因组微卫星序列分布特征分析

微卫星标记是一种应用广泛的分子标记技术，斑点叉尾是我国重要的水产养殖品种，将微卫星标记技术运用于斑点叉尾的研究中，能很好地为斑点叉尾分子标记辅助育种等方面的研究提供基础资料。本研究分析显示，在斑点叉尾约762 Mb的全基因组序列中，微卫星含量为全基因组的1.45%。与人(Homo sapiens)(3%)(Subramanian et al, 2003)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)(1.8%)(徐杰杰等, 2020)等物种相比，微卫星在斑点叉尾全基因组中分布较少。而与猪(Sus scrofa)(0.85%)(戚文华等, 2014)、大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)(0.64%)(李午佼等, 2014)、林麝(Moschus berezovskii)(0.42%)(卢婷等, 2017)等相比分布较多，其原因可能是不同物种的基因组大小有差异及基因组内的碱基组成和排列方式不同。

在本研究中，染色体DNA序列的长度与染色体上所含有的微卫星数量具有高度相关性(SPSS, r=0.98, P < 0.01)，这与黄杰等(2012)和戚文华等(2013)的研究结果一致。同时也支持了Hancock (1996)的假说：染色体序列越长，微卫星含量越高的趋势。统计各染色体上的各种类型微卫星数量，发现各类型的比例除27号和29号染色体二碱基大于单碱基外，均符合29条染色体整体微卫星分布特征，即单碱基最多，其次是二碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基。这个规律与张琳琳等(2008)对赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的研究结果相似，而与黄杰等(2012)对红原鸡(Gallus gallus)各染色体微卫星分布情况的研究结果相差甚远。高焕等(2005)认为，同一物种的不同染色体上，各种类型的重复序列分布有很大差异。而本研究的结果表明，各种类型的微卫星在各染色体上的分布符合整体规律，这可能和不同物种的不同类型微卫星的特定功能有关系。

表 2(Tab.2)

表 2 斑点叉尾全基因组微卫星数量最多的10种重复拷贝类别 Tab.2 Top 10 repeated copy categories of microsatellites in genomes of I. punctatus 重复类别 Motif 数量 Counts 长度 Length /bp 占比 Percentage /% 平均长度 Average length /bp 丰度 Abundance /(ind./Mb) 密度 Density /(bp/Mb) A 215 753 2 958 299 93.35 13.71 283.14 3882.25 AC 123 484 3 065 578 62.80 24.83 162.05 4023.04 AG 39 884 1 025 944 20.28 25.72 52.34 1346.37 AT 32 978 1 490 536 16.77 45.20 43.28 1956.07 AAT 25 903 839 853 58.14 32.42 33.99 1102.16 AAAT 15 598 415 802 44.10 26.66 20.47 545.67 C 15 371 219 430 6.65 14.28 20.17 287.96 AAC 7320 151 989 16.43 20.76 9.61 199.46 AAAC 4908 123 278 13.88 25.12 6.44 161.78 AAG 3076 67 944 6.90 22.09 4.04 89.16 注：占比表示该类别在各自重复类型微卫星中的占比 Note: The percentage represents the proportion of different types of SSRs

表 2 斑点叉尾全基因组微卫星数量最多的10种重复拷贝类别 Tab.2 Top 10 repeated copy categories of microsatellites in genomes of I. punctatus

斑点叉尾全基因组微卫星中占比例最高的是单碱基类型，其次是二碱基类型，这与猪(戚文华等, 2014)、林麝(卢婷等, 2017)等哺乳动物以及菊黄东方鲀(Takifugu flavidus)(徐杰杰等, 2021)等水生动物的有关研究结果一致；而与一些其他物种的研究结果相异，如大鼠(Rattus norvegicus)(涂飞云等, 2015)、虾虎鱼科(Gobiidae)(白翠翠等, 2016)是以二碱基类型所占比例较高。酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Katti et al, 2001)、德国小蠊(Blattella germanica)(王晨等, 2015)等则以三碱基类型占比例最高。从大部分已公布的物种全基因组微卫星分布特征来看，大多数物种都是单碱基或者二碱基占优势，少部分低等动物则为三碱基或六碱基数目最多。黄杰等(2015)认为高等生物基因组更倾向于单碱基微卫星占优势。虽然以上推论不能概括出所有已公布物种的全基因组微卫星的分布特征，但在对比分析中，仍可以从整体上看到大致的规律。而对于不同物种的全基因组微卫星分布情况具有的差别。可能的原因有2种：1)所用微卫星筛选软件不同，参数设置不同；2)可能与不同生物的基因表达及调控有关，体现了不同物种基因组的特征。

3.2 斑点叉尾各碱基类型微卫星不同类别分布特征分析

不同物种的全基因组中重复序列不仅不同类型分布差异很大，同一类型不同类别也存在很大差异。斑点叉尾全基因组微卫星中的前5种优势碱基类别分别为A、AC、AG、AT和AAT，与同属于鲇形目的黄颡鱼(徐杰杰等, 2020)、花斑无须鲶(Ageneiosus marmoratus)(未发表)及巨(Bagarius yarrelli)(未发表)的前5类优势碱基类别完全一致。由此可以猜测，物种亲缘关系越近，微卫星分布特征越接近。王月月等(2015)对7种家养动物全基因组微卫星分布的研究也得出了同样的结论。这可能说明微卫星序列是随着生物基因组的进化和发展而不断变化的，由于选择压力等缘故，使得亲缘关系相近的物种其微卫星序列分布规律也接近。

单碱基类型微卫星以A类别为主，这与已公布的绝大多数生物的全基因组微卫星单碱基类型特征相符合，如食蟹猴(Macaca fascicularis)(涂飞云等, 2018)、红尾蚺(Boa constricto)(聂虎等, 2017)等。二碱基类型以AC所占比例最高，与大鼠(涂飞云等, 2015)、小鼠(Mus musculus)(童晓玲等, 2006)的二碱基类型的优势类别一致，而与德国小蠊(王晨等, 2015)、红原鸡(黄杰等, 2012)以AT碱基类别占优势的结果并不相同。Bachtrog等(2000)曾用6个黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)群体作为研究对象，得出二碱基重复类型中不同重复类别的微卫星突变率不同的结论，表明在黑腹果蝇基因组微卫星中AC类别相对突变率比AT要大得多。而在斑点叉尾基因组中，与黑腹果蝇不同，二碱基AC类别所占的比例最高。此现象可能由两个原因造成：1)在斑点叉尾全基因组微卫星中，AC类别重复序列的突变率明显低于其他类别，使得这个类别被较完整地保留下来；2) AC类别重复序列容易由其他类别突变而成，且被不断地积累。猜想不同的物种在进化过程中总倾向于选择对自身发展有利的微卫星类别保留下来。对斑点叉尾来说，可能微卫星AC重复类别对其进化和生长过程起着十分重要的作用。因此，无论是以上来源中的哪种途径，都使得AC类别在数量上占据优势地位。另外，CG类别的含量最低，综合已有研究的物种的全基因组微卫星特征来看，二碱基CG类别重复序列的分布在绝大多数物种中都较低。

三碱基类型中，数目最多的是AAT类别，其次是AAC和AAG，这与人的三碱基重复类型的前3种类别是一样的(Subramanian et al, 2003)。研究表明，某些三碱基重复类别可以形成特殊的结构，如发夹结构、三叶草结构和滑链结构等，这些结构非常的灵活，可能导致它们的遗传不稳定性(Pearson et al, 1996)，此外，这些结构对基因的表达也起着十分重要的调控作用(戚文华等, 2016)。研究发现，人类的一些遗传疾病，如脆X综合征、肌强制性营养不良等与基因组中某些三碱基重复序列的增加有关(Schlötterer, 1998; Kovtun et al, 2001)，而斑点叉尾三碱基重复序列的前3种类别与人的一致，因此，斑点叉尾的某些疾病可能也与三碱基重复序列相关(徐杰杰等, 2021)。

四碱基、五碱基的数量较多的前2种类别分别是AAAT、AAAC和ATAAT、AAAAC，六碱基的数量相对于前5种重复类型比较少，数量最多的2种类别是TGACTA和ATAGTC。与前3种碱基类型一样，四碱基、五碱基和六碱基也表现出明显的A/T碱基优势。有研究表明，DNA序列中G/C含量越高，微卫星分布越少。对于这个现象，倪守胜等(2018)通过分析虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)基因组的微卫星分布特征，得出DNA复制滑动机制和重组机制使得A/T重复类型的产生几率更高的结论。Schorderet等(1992)认为，由于基因组中CpG甲基化，胞嘧啶C容易在脱氨基作用下突变为胸腺嘧啶T。这可能是二碱基中CG含量较少、TG (AC类型)含量较多的原因。然而Stallings (1992)的研究则表明，无论是否有CpG甲基化过程，基因组中的CG重复类别都是偏小的，他提出CpG结构是一种有害结构。

3.3 斑点叉尾各碱基类型拷贝数特征分析

斑点叉尾6种重复类型中，除二碱基在10~11拷贝数处有微小变动之外，基本上呈现随重复次数递增、微卫星数量逐渐递减的规律。这个规律与绝大部分物种的全基因组微卫星分布特征相符。Ellegren (2000)认为，在基因座上，微卫星序列的长度会维持在一定的范围内，因为长等位基因倾向于变短，从而抑制了微卫星长度的无限增长。另外，该现象可能和微卫星的突变率增大有关。有研究表明，同种类型的微卫星中拷贝次数多的要比次数少的具有更高的突变率，往往重复序列越长，突变的概率越大(Leopoldino et al, 2003)。因此，微卫星长度越长，其稳定性就越低，越容易发生碱基突变而成为不完整型微卫星或者非微卫星序列，使得重复数越多的完整型微卫星数量越少。长序列表现出更高的多态性，在进行遗传多样性研究时，可适当选择长度较大的微卫星位点作为遗传标记(王月月等, 2015)。

综上所述，本研究使用软件MISA对斑点叉尾全基因组中完整型微卫星进行了搜索并分析，得出斑点叉尾全基因组微卫星的分布特征如下：斑点叉尾的染色体长度越长，所含微卫星的数量越多；各染色体上微卫星数量大致符合单碱基 > 二碱基 > 三碱基 > 四碱基 > 五碱基 > 六碱基的整体分布规律。各类型微卫星均表现出明显的A/T碱基优势。微卫星序列的拷贝数越大，其数量就越少。本研究为斑点叉尾微卫星标记的开发、遗传多样性分析和分子标记育种等提供了数据支持。