白细胞介素12 (interleukin 12，IL-12)是一种在先天性和适应性免疫应答中具有多效效应的细胞因子(Watford et al, 2003)。IL-12蛋白是由P35亚基和P40亚基通过二硫键共价连接形成的异源二聚体(Jones et al, 2011)，主要由抗原呈递细胞(antigen-presenting cells, APC)和吞噬细胞产生(Vignali et al, 2012)。Toll样受体(toll-like receptor, TLR)识别病原相关分子模式介导IL-12的产生和释放。在树突状细胞中，病原体通过结合TLR刺激树突状细胞产生初始的IL-12。而在巨噬细胞中，IL-12的产生必须有干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)等辅助细胞因子的参与(Gee et al, 2009)。研究表明，P35亚基和P40亚基在同一细胞中表达，才能产生具有生物学活性的IL-12异源二聚体(Schoenhaut et al, 1992)。在缺乏P35亚基时，P40亚基以单体或同二聚体的形式分泌，并与IL-12受体结合，从而抑制IL-12的活性。P35亚基不能单独分泌到胞外，只能在与P40亚基结合后才能共同分泌，由于P35亚基的mRNA表达量较低，被认为是IL-12异源二聚体形成的限制因素(Gillessen et al, 1995)。前期研究表明，CD4⁺ T细胞与APCs结合后，IL-12作为主要细胞因子，诱导CD4⁺ T细胞向Th1细胞分化(Manetti et al, 1993)，而IL-10能够抑制Th1细胞分化(Hsieh et al, 1993)。综上所述，IL-12协调先天性免疫和适应性免疫，参与了宿主和病原体之间的相互作用，在清除细胞内病原体中具有重要作用(Prochazkova et al, 2012)。

当脊椎动物受到病原体感染时，吞噬细胞分泌的IL-12作用于T细胞等免疫细胞，促使其产生IFN-γ、TNF-α和TNF-β等细胞因子，增强免疫能力(Kobayashi et al, 1989)。鱼类作为原始的脊椎动物，有着和哺乳动物相似的免疫系统，Yoshiura等(2003)在对红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)基因组的分析中，首次发现了组成IL-12的p35和p40。之后，在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、鲤鱼(Cyprinus carpio)、鲈鱼(Dicentrarchus labrax)、斑马鱼(Danio rerio)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中成功克隆出p35a和p35b两种p35基因亚型，p40a、p40b和p40c三种p40基因亚型(Huising et al, 2006; Nascimento et al, 2007)。前期研究发现，病毒感染，细菌注射、脂多糖(LPS)或刀豆蛋白A刺激后(Huising et al, 2006; Nascimento et al, 2007; Arts et al, 2010)，硬骨鱼的p35和p40的mRNA表达模式与哺乳动物类似，这表明IL-12在硬骨鱼免疫应答中作为哺乳动物的直系同源基因发挥相似的作用(Øvergård et al, 2012)，但不同亚型间的表达有明显差异。在鱼类疫苗研究中发现，石斑鱼重组IL-12作为靶向疫苗的佐剂可以激活免疫应答，如：刺激外周血白细胞增殖、诱导tnf-α基因表达(Tsai et al, 2014)；高体(Seriola dumerili)重组IL-12与诺卡氏菌(Nocardia seriolae)福尔马林灭活疫苗共同注射，与单独注射诺卡氏菌福尔马林灭活疫苗相比，Th1型免疫应答增加，提高了高体对诺卡氏菌的免疫率(Matsumoto et al, 2017)。因此，重组IL-12能够作为疫苗佐剂延长疫苗对鱼类感染病原体的保护作用。

半滑舌鳎是我国重要的海水养殖鱼类(Song, 2016)，工厂化高密度养殖程度较高，以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)为主的细菌病在其养殖过程中造成了较高的死亡率，迫切需要开展免疫防控技术研究，提高半滑舌鳎对哈维氏弧菌病的抗病力。本课题组已完成半滑舌鳎全基因组测序(Chen et al, 2014)，前期利用全基因组选择技术筛选出对哈维氏弧菌病抗病力高的亲鱼(Liu et al, 2018)；克隆与分析了dctn5、sta5bl、rspo2l、pkcα、plgR等多个与哈维氏弧菌病相关的免疫基因(Li et al, 2020; Wang et al, 2019; Wei et al, 2018a、2018b、2019)。本研究克隆半滑舌鳎p35a和p40c的编码序列，并分析p35a、p40c及相关免疫基因(ifn-γ和il-10)在半滑舌鳎哈维氏弧菌感染过程中的表达模式。同时，利用半滑舌鳎淋巴细胞过表达p35a和p40c，并进行LPS刺激，探究半滑舌鳎IL-12参与免疫应答的可能调控途径，以期为研制半滑舌鳎哈维氏弧菌病的疫苗佐剂奠定理论基础。

本实验所用半滑舌鳎均来自明波水产养殖公司(山东莱州)。随机取3条健康的半滑舌鳎成鱼，麻醉后分别取胃、肠、脾脏、肝脏、心脏、肾脏、性腺、鳃、脑和肌肉，分装至冻存管后迅速在液氮中冷冻，取出后，保存于–80℃超低温冰箱。哈维氏弧菌感染实验使用40条健康半滑舌鳎，体长为(41.0±2.7) cm，体重为(438.4±53.0) g，具体实验方案参照之前操作步骤(Wei et al, 2018b)，腹腔注射的哈维氏弧菌浓度为1×10⁴ CFU/mL，注射剂量为4 μL/g。分别在注射后的6、16、48、72和96 h进行样品采集，每个时间点分别随机选取5条鱼，将鱼麻醉，采集肝脏、肾脏、脾脏、肠4个免疫相关组织，采集的样品用锡纸包裹后迅速放入液氮中，之后保存于–80℃超低温冰箱。

采用Trizol法提取半滑舌鳎各组织中的RNA，采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，之后使用极微量分光光度计检测RNA的浓度与纯度，从而获得符合实验要求的RNA。使用cDNA反转录试剂盒(TaKaRa)，按照说明书进行cDNA的合成。

根据已发表的半滑舌鳎全基因组序列获得p35a和p40c的预测序列，根据序列使用Primer Premier 5.0软件设计引物(表 1)，以免疫组织的cDNA为模板进行PCR扩增验证编码区序列，PCR反应体系：LaTaq酶(TaKaRa) 0.5 μL，dNTP 8 μL，10×buffer 5 μL，灭菌去离子水33.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL；反应程序：94℃ 1 min，36个循环(98℃ 12 s，65℃ 30 s，72℃ 2 min)，72℃ 10 min。之后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，切下单一条带的PCR产物，使用胶回收试剂盒(Vazyme)进行回收纯化，将纯化后的PCR产物连接到pEASY-T1 (TIANGEN)载体，按照说明书进行后续基因克隆实验，最后挑取阳性克隆交由华大基因科技有限公司进行测序。

表 1(Tab.1)

表 1 实验所用的引物 Tab.1 Primers used in the experiments 引物Primer 序列Sequence (5′~3′) 用途Utilization p35a-F GCCATGGCTGATATCGGATCCATGAACACACTTCGATTGTACCCG CDS fragment PCR p35a-R GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCGGCTTCCTGTGCTCTCCTGAGG CDS fragment PCR p40c-F GCCATGGCTGATATCGGATCCATGACTGCGACTCAGTGGATGG CDS fragment PCR p40c-R GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCGGGATCCTCTTTTCCTTCTGTTTC CDS fragment PCR p35a-qF ACACTTCGATTGTACCCGTCA qRT-PCR p35a-qR CTCCGTCTGACTCTTCACCAC qRT-PCR p40c-qF TGGGCCCTGAATGCACTAAA qRT-PCR p40c-qR AGACGATCGTGGGGATACCA qRT-PCR β-actin-qF GCTGTGCTGTCCCTGTA qRT-PCR β-actin-qR GAGTAGCCACGCTCTGTC qRT-PCR il-10-qF GTCCGGCTGAAGAAGCTC qRT-PCR il-10-qR GAAAGAGTCCTCGATGCTG qRT-PCR ifn-γ-qF CTTGTCAGGTCTTGACCCTG qRT-PCR ifn-γ-qR GTAACAGCAGGTTTTGGATGG qRT-PCR tnf-α-qF GCTCACCTCAAGAAGAAGAC qRT-PCR tnf-α-qR CCATTCCACCGAGTTGGTC qRT-PCR tnf-β-qF GAAATGCAGCCCAGCCAC qRT-PCR tnf-β-qR CAAATGGATGGCCGCTTG qRT-PCR

表 1 实验所用的引物 Tab.1 Primers used in the experiments

测序后的结果使用DNAMAN和SnapGene进行比对和分析，得到所克隆的半滑舌鳎的p35a和p40c的编码序列，根据编码区序列使用ExPASy (http://web.expasy.org/compute_pi/)预测蛋白分子量及等电点；利用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)预测蛋白质结构域；使用PyMOL预测IL-12的蛋白质三维结构模型；多序列比对和进化树构建所需的氨基酸序列均来源于Ensemble和NCBI数据库；通过MEGA 7.0，使用邻接法(neighbor joining, NJ)构建系统进化树(bootstrap＝1000)。

选取各组织中1 μg的RNA，利用Prime Script RT reagent试剂盒(TaKaRa, 日本)反转录生成cDNA。通过p35a-qF/R和p40c-qF/R引物(表 1)，利用Quantinova SYBR Green PCR试剂盒(QiaQen)进行RT-qPCR，反应体系为20 μL，分别包含1 μL cDNA、10 μL SYBR Green PCR Master Mix (2×)、2 μL ROX Reference Dye、0.7 μmol/L的上游和下游引物以及5.6 μL无菌水。反应在ABI StepOnePlus_Real-Time PCR System (Applied Biosystems, 美国)上进行，反应程序：95℃ 2 min；95℃ 5 s, 60℃ 10 s，共40个循环；95℃ 15 s, 60℃ 1 min, +1℃/min, 95℃ 15 s。使用β-actin作为内参(β-actin-qF/R) (表 1)。每个反应体系重复3次。使用2^–ΔΔCt方法分析p35a、p40c及其相关基因在半滑舌鳎各组织、哈维氏弧菌感染的免疫组织及细胞样品中的表达水平。使用SPSS软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，设定P < 0.05为差异显著。

使用ClonExpress Ⅱ One Step cloning kit-C112 (Vazyme)对pHAGE载体和p35a、p40c的编码区序列分别进行重组，得到pHAGE-p35a和pHAGE-p40c重组载体。将重组后的产物转入感受态细胞中，挑选单克隆进行PCR鉴定。对鉴定出的阳性菌落进行测序，以确保载体构建的准确性。筛选准确的单细胞克隆菌株进行培养，使用EndoFree mini plasmid kit Ⅱ (TIANGEN)，获得半滑舌鳎的p35a和p40c过表达载体。

将健康的半滑舌鳎放于18℃~20℃高双抗消毒海水(1000 μg/mL链霉素，1000 IU/mL青霉素)中暂养12~24 h后，在实验前将鱼放入75%酒精中浸泡1~2 min，于超净工作台中，用注射器抽取半滑舌鳎血液，使用含有抗凝剂的PBS重悬细胞，过40 μm细胞筛，再用PBS漂洗3遍，收集沉淀。之后，用5% FBS-DMEM/ F12培养液充分悬浮并均匀接种于T25培养瓶中，进行细胞计数，调整细胞密度至约2×10⁶个/mL，在24℃培养箱中启动原代培养。24 h后，将细胞所用培养液更换为DMEM/F12，分别添加10%胎牛血清(FBS)、100 μg/mL链霉素、100 IU/mL青霉素、40 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF和40 ng/mL IGF-I。使用Lipo2000 (Invitrogen)进行细胞转染，每孔添加2.5 µg质粒(对照组添加空质粒)，按说明书进行后续操作。分别用不同浓度的LPS (0、1、10 mg/L)进行处理，在24 h收集细胞置于–80℃冰箱中，留待后续检测。

完成了半滑舌鳎p35a和p40c基因编码区序列的克隆，其中，p35a的ORF为651 bp，编码216个氨基酸，预测蛋白质的分子量为24.11 kDa，理论等电点(pI)为7.49 (图 1)；p40c的ORF为984 bp，编码327个氨基酸，预测蛋白质的分子量为37.78 kDa，pI为6.57(图 2)。将p35a和p40c的cDNA比对基因组DNA，显示p35a和p40c都包含7个外显子。

图 1(Fig. 1)

图 1 半滑舌鳎p35a基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列 Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of p35a gene in C. semilaevis 方框内为起始密码子、终止密码子。图 2同 The box contains start codon and stop codon. The same as in Fig. 2

图 1(Fig. 1)

图 2 半滑舌鳎p40c基因核苷酸序列及推测的氨基酸序列 Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of p40c gene in C. semilaevis

通过SMART进行保守结构分析。结果显示，P35a蛋白中存在1个IL-12蛋白结构域；P40c存在3个蛋白结构域，分别为免疫球蛋白结构域(IG)、IL-12p40_c结构域和Ⅰ类细胞因子受体结构域(d1f42a3)。其中，P40c还具有1个信号肽(图 3)。使用PyMOL同源建模半滑舌鳎P35a和P40c的蛋白质三级结构，结果显示，半滑舌鳎的P35a蛋白含有较多的α-螺旋，为P35典型四螺旋拓扑结构；半滑舌鳎P40c蛋白则含有较多的β折叠；P35a蛋白和P40c蛋白以类似于配体和受体结合的方式，共价结合形成异源二聚体(图 4)。

图 1(Fig. 1)

图 3 半滑舌鳎p35a和p40c的基因结构示意图及蛋白质结构域预测 Fig.3 Gene structure and protein prediction of p35a and p40c in C. semilaevis

图 1(Fig. 1)

图 4 P35a、P40c和IL-12蛋白质的三维结构预测 Fig.4 Three dimensional structure prediction of P35a, P40c and IL-12 protein A: P35a; B: P40c; C: IL-12

系统进化树结果显示，P35与P40均聚为4支，其中，P35分为鱼的P35a、P35b，鸟类的P35和哺乳动物的P35 (图 5A)，P40分别为鱼类的P40a、P40b，P40c以及鸟类和哺乳动物的P40 (图 5B)。半滑舌鳎的P35和P40分别与鱼类的P35a和P40c聚为一支，说明它们在进化关系上更为接近。

图 1(Fig. 1)

图 5 P35a (A)和P40c (B)系统发育树 Fig.5 Phylogenetic analysis of P35a (A) and P40c (B) proteins 氨基酸序列号： P35a：绿河鲀(H3C7F9)；红鳍东方鲀(H2SI85)；青鳉(XP_004075675.1)；三棘刺鱼(G3P753); 剑尾鱼(XP_023207637.1)；罗非鱼(I3J6P0) P35b：绿河鲀(Q6UAL9)；青鳉(XP_004079386.2)；三棘刺鱼(G3PKZ2)；剑尾鱼(XP_023190996.1)。 P35：鸭(U3IER1)；火鸡(G1NDR2)；小鼠(P43431)；马(Q9XSQ6)；人(P29459)；猪(Q29053)；牛(P54349)。 P40c：青鳉(H2L9T4)；罗非鱼(I3KA75)；三棘刺鱼(G3NJZ0)；庸鲽(D0QTF8)。 P40b：斑马鱼(A8WH95)；鲤鱼(Q2PCT1)；三棘刺鱼(G3QAY2)；青鳉(H2LA74)；罗非鱼(I3JPN9)。 P40a：斑马鱼(Q6F3Q9)；鲤鱼(Q2PD23)；青鳉(H2LTF6)；罗非鱼(I3KMB3)；海鲈鱼(Q1KX13)；三棘刺鱼(G3Q3E4)。 P40：鸡(Q6X0K9)；鼠(P43432)；人(P29460)；牛(P46282) Amino acid sequence number: P35a: Tetraodon nigroviridis (H3C7F9); Takifugu rubripes (H2SI85); Oryzias latipes (XP_004075675.1); Gasterosteus aculeatus (G3P753); Xiphophorus maculatus (XP_023207637.1); Oreochromis niloticus (I3J6P0). P35b: Tetraodon nigroviridis (Q6UAL9); Oryzias latipes (XP_004079386.2); Gasterosteus aculeatus (G3PKZ2);Xiphophorus maculatus (XP_023190996.1). P35: Anas platyrhynchos (U3IER1); Meleagris gallopavo (G1NDR2); Mus musculus (P43431); Equus caballus (Q9XSQ6); Homo sapiens (P29459); Susscrofa domestica (Q29053); Bos taurus (P54349). P40c: Oryzias latipes (H2L9T4); Oreochromis niloticus (I3KA75); Gasterosteus aculeatus (G3NJZ0);Hippoglossus hippoglossus (D0QTF8). P40b: Danio rerio (A8WH95); Cyprinus carpio (Q2PCT1); Gasterosteus aculeatus (G3QAY2); Oryzias latipes (H2LA74); Oreochromis niloticus (I3JPN9). P40a: Danio rerio (Q6F3Q9); Cyprinus carpio (Q2PD23); Oryzias latipes (H2LTF6); Oreochromis niloticus (I3KMB3); Dicentrarchus labrax (Q1KX13); Gasterosteus aculeatus (G3Q3E4). P40: Gallus gallus (Q6X0K9); Mus musculus (P43432); Homo sapiens (P29460); Bos taurus (P46282)

半滑舌鳎P35a和P40c蛋白序列与其他物种蛋白序列的比对分析结果见表 2 (所用物种氨基酸序列同系统进化树所用氨基酸序列一致)。P35a蛋白与红鳍东方鲀的P35a蛋白相似性最高，为52.04%。P40c蛋白与三棘刺鱼(Gasterosteus aculeatus)的P40c蛋白的序列相似性最高，为48.67%。

表 2(Tab.2)

表 2 半滑舌鳎P35a和P40c蛋白序列与其他物种蛋白序列的相似性 Tab.2 Similarity of P35a and P40C protein sequences between C. semilaevis and other species 基因 Gene 物种 Species 蛋白质序列的相似性 Alignment of protein sequence similarity/% p35a 红鳍东方鲀T. rubripes 52.04 绿河鲀T. nigroviridis 48.11 青鳉O. latipes 43.41 三棘刺鱼G. aculeatus 42.51 剑尾鱼X. maculatus 45.68 罗非鱼O. niloticus 48.81 p40c 青鳉O. latipes 41.90 罗非鱼O. niloticus 48.66 三棘刺鱼G. aculeatus 48.67 庸鲽H. hippoglossus 46.84

表 2 半滑舌鳎P35a和P40c蛋白序列与其他物种蛋白序列的相似性 Tab.2 Similarity of P35a and P40C protein sequences between C. semilaevis and other species

p35a和p40c在半滑舌鳎不同组织的表达显示，p35a基因在鳃、心、脑和卵巢等组织表达水平较高，在其他组织中也有一定程度表达；p40c基因在肝中表达水平最高，在脾和鳃中有较高表达，在心脏、精巢和胃中也有一定程度的表达，而在肾和肌肉中几乎不表达(图 6)。

图 1(Fig. 1)

图 6 p35a(A)和p40c(B)基因在半滑舌鳎中的组织表达模式 Fig.6 Tissue expression analysis of p35a and p40c in C. semilaevis 数据用3个独立个体的平均值±标准误表示(n=3)。不同字母间表示差异显著(P < 0.05) Data were the Mean±SE of three independent individuals (n=3). Different letters represent significant difference (P < 0.05)

哈维氏弧菌感染后，p35a和p40c在脾、肝、肾和肠中均有显著性表达差异。在脾脏和肝脏中的表达模式相似。在脾中，p40c在6 h显著升高，之后表达逐渐降低；p35a在48 h显著升高，之后表达逐渐降低。在肝中，p40c同样在6 h显著升高；但p35a在72 h才显著升高。在肾和肠中，p35a和p40c则呈现出与之不同的表达模式。在肠中，p40c率先在6 h上调，之后持续上调到48 h表达最高，维持高表达到72 h，之后在96 h与p35a一起下调。p35a在6 h升高，中间表达量降低，于48 h表达最高，之后表达量逐渐下降；p40c在48 h显著升高，之后逐渐降低(图 7)。

图 1(Fig. 1)

图 7 p35a和p40c mRNA在哈维氏弧菌感染后的半滑舌鳎免疫组织中的表达模式 Fig.7 Expression patterns of p35a and p40c mRNA in C. semilaevis immune tissues after V. harveyi infection 字母的大小写标注仅用来区分不同基因间的显著性，不同字母间表示差异显著(P < 0.05)。下同 The case labeling of letters is only used to distinguish the significance between different genes, and the difference with different letters was significant (P < 0.05). The same as below

哈维氏弧菌注射后，ifn-γ在脾脏和肠道中的表达模式相似，ifn-γ表达在6 h开始升高，在16 h达到最高，之后表达逐渐下降。il-10在脾中，16 h表达开始上调，在ifn-γ开始下降后的第48小时达到最高，之后表达逐渐下降；在肠中差异情况较小。ifn-γ和il-10在肾脏和肝脏中的表达模式相似，ifn-γ和il-10均在6 h显著上调，之后在脾中表达逐渐降低；il-10会在肝中的16 h维持一定的高表达，直到48 h才和ifn-γ一起逐渐下降(图 8)。

图 1(Fig. 1)

图 8 ifn-γ和il-10在哈维氏弧菌感染后的半滑舌鳎免疫组织中的表达模式 Fig.8 Expression patterns of ifn-γ and il-10 mRNA in C. semilaevis immune tissues after V. harveyi infection

转染空载体的对照组p35a和p40c基因表达量较低，且在不同浓度的LPS刺激后，表达量没有显著差异。转染pHAGE-p35a和pHAGE-p40c载体的实验组，p35a和p40c基因表达量显著高于对照组(图 9)。

图 1(Fig. 1)

图 9 细胞过表达实验中p35a和p40c基因的表达模式 Fig.9 Expression patterns of p35a and p40c genes in cell overexpression assay 对照组(C)：转染空载体；实验组(P)：p35a和p40c共转，均用0、1、10 ng/L的LPS进行刺激。组别命名为C0、C1、C10、P0、P1和P10。下同 Control group (C): Transfected with empty vector; Experimental group (P): Co-transfected with p35a and p40c. Stimulated with 0, 1, 10 ng/L LPS. The groups were named as C0, C1, C10, P0, P1, and P10. The same as below

对照组tnf-α表达量在不同浓度的LPS刺激下，随着LPS浓度的增加，表达量呈上升趋势。实验组在转染p35a和p40c的过表达载体后，tnf-α的表达量上升幅度显著高于对照组。tnf-β、ifn-γ和il-10基因的表达量在对照组和实验组中均没有显著变化(图 10)。

图 1(Fig. 1)

图 10 LPS刺激半滑舌鳎过表达p35a和p40c淋巴细胞的相关基因表达模式 Fig.10 Gene expression patterns of over-expressed p35a and p40c lymphocytes stimulated by LPS in C. semilaevis

本研究获得了半滑舌鳎p35亚基和p40亚基基因的编码序列，进化树分析表明它们分别属于鱼类p35a和p40c亚型。结构域预测显示，p35a和p40c基因都含有典型的IL-12家族结构域，且都不含跨膜结构域。p40c还含有p40亚基都具有的免疫球蛋白结构域(IG)和Ⅰ类细胞因子受体结构域(d1f42a3)。前期研究报道，与p40c具有相似结构域的造血细胞因子受体家族成员IL-6受体(IL-6Rα)，可以通过蛋白质水解或选择性剪接的方式以可溶性形式(缺乏跨膜结构域)从细胞中释放，然后可溶性IL-6R和IL-6在溶液中结合成复合物，介导下游信号通路的调控(Collison et al, 2012; Vignali et al, 2012)。因此，可以把IL-12理解成p35细胞因子与p40可溶性细胞因子受体共价结合形成的复合物。组织表达结果显示，p35a主要在鳃、脑、心和卵巢中具有较高表达，p40c主要在肝、鳃、心脏和精巢中有较高表达。p35a和p40c均在鳃中高表达，可能是因为鳃是病原体首先侵入鱼体的器官。

本研究分析了半滑舌鳎p35a和p40c在哈维氏弧菌感染后的时空表达特征。免疫器官中的p35a和p40c及相关基因(ifn-γ和il-10)存在时空表达差异性。在脾和肝中，p35a和p40c不在同一时间高表达，但p35亚基也不会以单体形式存在于细胞中(D'Andrea et al, 1992)。目前，已在草鱼(Ctenopharyngodon idella)、大西洋鲑(Salmo salar)等硬骨鱼中发现了p35a亚基和p40c亚基的多个亚型(Pandit et al, 2015; Wang et al, 2014b)，表明半滑舌鳎中可能还具有p40亚基的其他亚型。p40亚基的同源二聚体可以通过结合IL-12受体来抑制IL-12的产生(Heinzel et al, 1997)，但结合ifn-γ在脾和肝中的表达模式，p40c亚基更可能是与p35亚基的其他亚型形成IL-12在免疫器官中发挥调控作用。因此，推测在半滑舌鳎中存在多个p35亚基和p40亚基的亚型。在肠中，p35a和p40c的表达趋势一致，表明半滑舌鳎IL-12的p35a/p40c亚型在应对哈维氏弧菌感染时可能在肠中发挥相应作用。而在肾中，由于表达量变化不明显以及其组织表达量低，还需要进一步探究p35a和p40c在肾脏中是否响应哈维氏弧菌感染。上述结果表明，IL-12的不同亚型可能在不同的免疫器官中发挥不同的免疫功能。

在哈维氏弧菌感染实验中，还检测了ifn-γ和il-10在半滑舌鳎不同免疫组织中的表达模式。在脾中，呈现出典型的IL-12调控模式(Wang et al, 2014a)，p40c在6 h升高后，与其他亚型的p35亚基产生IL-12，从而诱导ifn-γ在16 h显著升高；il-10在48 h急剧升高，抑制IL-12的产生，从而使p35a和p40c在48 h之后的表达逐渐降低。在肠中，ifn-γ在IL-12表达升高前高表达，之后下降，并没有因p35a表达量升高而维持在一个较高水平，这暗示ifn-γ在肠中可能主要发挥激活IL-12细胞因子产生的功能(Zhang et al, 2008)。而il-10作为Th2免疫应答的主要细胞因子，其表达均在IL-12高表达后被抑制，表达模式和发挥的功能较为单一，这可能是由于Th0细胞向Th1细胞或Th2细胞的分化途径相对较为保守(Collison et al, 2012)。作为与IL-12相关的细胞因子，ifn-γ发挥功能呈现出时空多样性，侧面佐证了IL-12可能在不同器官中对相关的免疫应答具有差异调控作用，这表明IL-12的调控方式可能较为复杂。到目前为止，IL-12受体在鱼类中还未确定，哺乳动物的IL-12受体由亚基1和亚基2构成。由于鱼类基因组复制事件，免疫基因(细胞因子和细胞因子受体)通常以2个拷贝的形式存在(Husain et al, 2012)。IL-12配体和受体亚单位的多样性组合，进一步证明鱼类IL-12调控系统的复杂性。因此，IL-12细胞因子在鱼类中通过多种同源基因的扩增，共享配体和受体中的亚基，可能组成了一个极其复杂的内部调节网络来微调它们的免疫反应。

在LPS刺激半滑舌鳎淋巴细胞实验中，tnf-α的表达量响应了LPS刺激，p35a和p40c表达量变化对LPS刺激的响应不显著。可能因为p35a/p40c亚型不是体外培养的淋巴细胞中主要响应LPS的免疫蛋白。在之前的研究中，虹鳟不同亚型的IL-12分别针对不同的刺激源(病毒、细菌和寄生虫)展现出不同的表达模式。其中，p35/p40c亚型针对病毒和寄生虫感染，表达明显上调，而针对细菌感染，表达上调不显著(Wang et al, 2014b)。在过表达p35a和p40c后，实验组tnf-α的表达量响应LPS刺激的上升幅度明显高于对照组，表明IL-12的p35a/p40c亚型能够通过诱导tnf-α基因的表达，参与半滑舌鳎淋巴细胞响应LPS刺激，提升机体的免疫应答水平。

综上所述，IL-12是半滑舌鳎响应哈维氏弧菌病，参与免疫调控并提升免疫应答水平的重要细胞因子。因此，可以使用重组的IL-12作为半滑舌鳎的哈维氏弧菌疫苗的佐剂之一，但由于半滑舌鳎IL-12参与的免疫应答非常复杂，需进一步研究半滑舌鳎IL-12的所有组成亚基，探究不同组成的IL-12的结构特征和免疫调控模式，从而提高半滑舌鳎的IL-12作为疫苗佐剂所增强的免疫效果。