近年来，我国海水池塘养殖产业发展迅速，养殖规模逐渐扩大，产量日益增长(农业农村部渔业渔政管理局等, 2020)，同时，近岸海水富营养化问题也引起人们普遍关注(陆尚明等, 2020)，陆源N、P过量排放被认为是造成海水富营养化的主要原因(施沁璇等, 2021)。虾、蟹养殖池塘中放养菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)、缢蛏(Sinonovacula constricta)等埋栖型滩涂贝类的多营养层次综合养殖(IMTA)可获得较好的经济和生态效益(Chang et al, 2020)。其中，贝类不仅能通过自身滤水作用净化水质(董世鹏等, 2020)，其扰动作用还可以使沉积物颗粒混合，改变沉积物/水界面物质交换(杜永芬等, 2004)，改善沉积物微生物群落结构(Lukwambe et al, 2018)。

本研究以人工构建的菲律宾蛤仔养殖池塘为研究对象，采用稳定同位素示踪方法，通过沉积物泥浆培养实验和氮稳定同位素检测，以期深入揭示菲律宾蛤仔对养殖池塘沉积物/水界面发生的反硝化(Denitrification)和厌氧氨氧化作用(Anaerobic ammonia oxidation)的影响。研究结果将有助于全面了解海水池塘IMTA系统氮素营养的迁移转化过程，并为海水养殖尾水的生物净化处理技术研发提供参考数据。

本研究在山东省日照市东港区涛雒镇的日照开航水产有限公司(35°19′18″N; 119°24′40″E)进行。实验池塘总面积约0.4 hm²，池塘内修建长为60 m、顶宽为1.5 m、水深为0.5 m的贝台10个，贝台之间由深沟相隔，沟底水深为1.0~1.2 m。2020年4月初，实验池塘中的9个贝台放养规格为4000~6000粒/kg的菲律宾蛤仔，设有贝区，另一个贝台不放养任何贝类，作为对照区域(无贝区)。

分别于9、10、11、12月选择有贝区的6个贝台，于各贝台中心点处采用玻璃采泥器采集沉积物表层(10 cm)样品，分别编号为B1、B2、B3、B4、B5、B6。现场将样品B1与B2、B3与B4，B5与B6进行两两混合，得到3份有贝区样品，另外，选择无贝区中心点和两端点处采集无贝区样品共3份，分别编号C1、C2和C3。沉积物样品收集间隙水后，现场进行泥浆培养实验。

温度采用YSI多参数便携式水质检测仪进行检测，亚硝酸盐(NO₂^–)、硅酸盐(SiO₄^2–-Si)、氨氮(NH₄⁺-N)、硝酸盐(NO₃^–)和总磷(TP)等理化参数指标采用营养盐自动分析仪(Skalar SAN^plus Analyzer，荷兰)检测，叶绿素a浓度的测量参照《叶绿素的测定(分光光度法) SL88-1994》的方法。

每个月有贝区和无贝区沉积物样品均分别取60 g置于250 mL烧杯里，加100 mL池塘沉积物上覆水，采用无菌玻璃棒搅拌使其形成匀浆形式，后在厌氧条件下，使用He吹30 min。取36个12 mL顶空进样瓶(Labco Exetainer, Lampeter, 英国)，分为E_ctrl、E_amox和E_denit 3个实验组，每组24个。其中，E_ctrl为控制组，添加¹⁵NH₄⁺ (99%¹⁵N)，用于判断体系中是否达到厌氧状态，以及本底的¹⁴NO₃是否已经消耗完。E_amox为验证组，添加¹⁵NH₄⁺ (99%¹⁵N)+¹⁴NO₃^–，用于确定厌氧氨氧化的存在。E_denit为计算组，添加¹⁵NO₃^– (99.19%¹⁵N)，用于计算反硝化反应速率及厌氧氨氧化反应速率(表 1)。分别取4 mL泥浆样品加入顶空进样瓶，采用He吹30 min，以便排尽瓶中空气。所有顶空进样瓶先在避光条件下旋转培养5 d(180 r/min)，使其充分达到厌氧状态，并消耗尽沉积物本底中的¹⁴NO₃^–。各实验组分别加入¹⁵NO₃^–、¹⁵NH₄⁺、¹⁵NH₄⁺、¹⁴NO₃^–标准溶液并使最终浓度达到100 μmol/L，在添加¹⁵N标记物后的第0、3、6、9小时，每个实验组分别取3个平行样品，加入200 μL的ZnCl₂溶液(7 mol/L)终止反应，共取得36个样品，样品均于4℃低温保存以测定²⁹N₂、³⁰N₂含量(张满平, 2017)。根据公式(1)和公式(2)分别计算厌氧氨氧化和反硝化速率(Thamdrup et al, 2002; Dalsgaard et al, 2002)。

表 1(Tab.1)

表 1 15N泥浆培养试验分组 Tab.1 15N slurry incubation experiment groups 实验组 Groups 同位素药品 Isotope medicine 添加同位素 Tracer added 最终浓度 Final concentration/(μmol/L) 测定相 Isotopes measured E_ctrl 15N NH4Cl 15NH4+ 100 29N2, 30N2 E_amox 15N NH4Cl+14N NO3– 15NH4++14NO3– 100+100 29N2, 30N2 E_denit 15N NO3– 15NO3– 100 29N2, 30N2

表 1 15N泥浆培养试验分组 Tab.1 15N slurry incubation experiment groups

式中，A_total为厌氧氨氧化速率[μmol/(kg·h)]；D_total为反硝化速率[μmol/(kg·h)]；F_N为实验组E_denit中¹⁵NO₃^–占总NO₃^–的百分比；P₂₉和P₃₀分别是实验组E_denit中²⁹N₂和³⁰N₂的生成速率[μmol/(kg·h)]。

泥浆培养终止后，离心进样瓶，取1 mL顶空气体至He (99.999%)吹扫后的Labco真空采样瓶中，置于GasBenchⅡ样品盘中，使用稳定同位素质谱仪(GasBenchⅡ－253plus, 美国)测定²⁹N₂、³⁰N₂的生成量。

采用Microsoft Excel 2016软件进行数据整理和计算，采用SPSS 25.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，P < 0.05为显著差异，P < 0.01为极显著差异。

沉积物间隙水理化指标分析结果见表 2。从表 2可以看出，整个养殖期间，有贝区和无贝区间隙水理化指标存在明显差异。其中，有贝区叶绿素a、NO₂^–、SiO₃^2–-Si和NO₃^–含量在各月均低于无贝区。有贝区的NH₄⁺-N、NO₂^–、NO₃^–和SiO₄^2–-Si含量在养殖期间总体呈逐渐下降的趋势。有贝区TP含量在10月有所下降，11月最高，12月又降至最低水平，而无贝区TP含量在养殖过程中趋于稳定。

表 2(Tab.2)

表 2 沉积物间隙水理化指标 Tab.2 Physicochemical parameters of porewater at sampling sites 月 Month 样品 Samples 温度 Temperature /℃ 叶绿素a Chl-a /(mg/L) 亚硝酸盐 NO2– /(μg/L) 硅酸盐 SiO42–-Si /(μg/L) 氨氮 NH4+-N /(mg/L) 硝酸盐 NO3– /(μg/L) 总磷 TP /(μg/L) 9月Sep. YB 23.9 1.6 49.7 2 134.6 3.2 455.8 8.8 WB 24.1 1.9 60.2 3 203.1 2.6 600.5 10.1 10月Oct. YB 16.8 1.5 17.0 1 965.0 3.0 173.4 5.4 WB 16.9 2.4 79.3 3 005.4 3.1 197.7 10.3 11月Nov. YB 8.8 0.3 15.0 784.5 2.9 127.3 13.1 WB 8.7 0.6 24.9 2 071.9 3.6 315.6 11.0 12月Dec. YB 8.1 0.2 12.3 366.7 1.9 32.3 1.3 WB 7.9 0.3 28.3 1 772.4 2.3 314.0 10.3 注：YB为有贝区，WB为无贝区 Note: YB represents area with clams, and WB represents area without clams

表 2 沉积物间隙水理化指标 Tab.2 Physicochemical parameters of porewater at sampling sites

有贝区²⁹N₂、³⁰N₂生成量见图 1。从图 1可以看出，E_ctrl实验组4个月中²⁹N₂和³⁰N₂均未累积，表明达到厌氧条件且没有发生硝化、反硝化的耦合反应，沉积物本底中的¹⁴NO₃^–完全消耗完。

图 1(Fig. 1)

图 1 有贝区(YB)与无贝区(WB)样品的29N2、30N2生成量 Fig.1 The amount of 29N2 and 30N2 in samples obtained in the area with (YB) or without (WB) clams

E_amox处理组中，9月，²⁹N₂、³⁰N₂均未累积，表明达到厌氧条件且不存在厌氧氨氧化反应；10月，³⁰N₂有所累积，表明达到所需厌氧条件，²⁹N₂有所累积，表明存在厌氧氨氧化反应；11月，²⁹N₂检测到累积，表明存在厌氧氨氧化反应；12月，²⁹N₂、³⁰N₂均未累积，表明达到厌氧条件且不存在厌氧氨氧化反应。

E_denit处理组中，9月，²⁹N₂未累积，而³⁰N₂生成速率逐渐上升，表明不存在厌氧氨氧化反应但存在反硝化反应，经计算可知，反硝化速率为0.005 8 μmol/(kg·h)；10月，²⁹N₂和³⁰N₂均有累积且³⁰N₂生成速率大于²⁹N₂，表明存在厌氧氨氧化和反硝化反应，且反硝化速率大于厌氧氨氧化速率，经计算可知，反硝化速率为0.003 9 μmol/(kg·h)，厌氧氨氧化反应为0.000 92 μmol/(kg·h)；11月，²⁹N₂有所累积，表明存在厌氧氨氧化反应，经计算可知，厌氧氨氧化反应速率为0.000 93 μmol/(kg·h)，而³⁰N₂有所累积，表明存在反硝化反应，经计算可知，反硝化反应速率为0.003 9 μmol/(kg·h)；12月，²⁹N₂未累积而³⁰N₂逐渐累积，表明仅存在反硝化反应，经计算可知，反硝化反应速率为0.002 8 μmol/(kg·h)。

无贝区²⁹N₂、³⁰N₂生成量见图 1。从图 1可以看出，E_ctrl处理组中，4个月样品的²⁹N₂和³⁰N₂均未积累，表明达到厌氧条件且样品本底中的¹⁴NO₃^–完全消耗完，无贝区没有发生硝化、反硝化的耦合反应。E_amox处理组中，9—12月样品的²⁹N₂和³⁰N₂均未累积，表明达到厌氧条件，但不存在厌氧氨氧化反应；E_denit处理组中，9月，²⁹N₂未累积而³⁰N₂逐渐累积，表明不存在厌氧氨氧化反应，但存在反硝化反应，经计算可知，反硝化反应速率为0.004 8 μmol/(kg·h)；10月，³⁰N₂逐渐累积而²⁹N₂未累积，表明存在反硝化反应但没有厌氧氨氧化反应，经计算可知，反硝化速率为0.002 1 μmol/(kg·h)；11月，²⁹N₂未检测到累积，³⁰N₂有所累计，表明不存在厌氧氨氧化反应，仅存在反硝化反应，经计算可知，反硝化反应速率为0.001 9μmol/(kg·h)；12月，²⁹N₂未累积而³⁰N₂有所累计，表明不存在厌氧氨氧化反应而仅存在反硝化反应，经计算可知，反硝化反应速率为0.001 4 μmol/(kg·h)。

有贝区沉积物厌氧氨氧化反应速率、反硝化反应速率与间隙水理化参数相关性分析结果见表 3。从表 3可以看出，整个养殖过程中，池塘沉积物/水界面的反硝化反应速率与间隙水温度、NO₂^–、NH₄⁺-N、NO₃^–含量相比具有极显著差异(P < 0.01)，与叶绿素a浓度、TP含量相比呈显著相关(P < 0.05)。厌氧氨氧化反应速率与NH₄⁺-N含量相比具有极显著差异(P < 0.01)，与TP、NO₂^–含量相比存在显著差异(P < 0.05)，与温度、叶绿素a浓度、NO₃^–含量相比无显著差异(P > 0.05)。

表 3(Tab.3)

表 3 沉积物的氮循环反应速率与环境因子相关性分析 Tab.3 Correlation analysis between nitrogen cycling reaction rates of sediment and environmental factors 项目 Items 温度 Temperature/℃ 叶绿素a Chl-a /(mg/L) 亚硝酸盐 NO2– /(μg/L) 氨氮 NH4+-N /(mg/L) 硝酸盐 NO3– /(μg/L) 总磷 TP/(μg/L) D A D A D A D A D A D A 有贝区 Area with clams 0.9** –0.3 0.6* 0.1 0.9** –0.5* 0.8** 0.9** 0.9** –0.3 0.5* 0.5* 无贝区 Area without clams 0.9** — 0.5* — 0.4 — –0.2 — 0.9** — –0.5* — 注：D：反硝化反应速率；A：厌氧氨氧化反应速率；*表示显著差异(P < 0.05)；**表示极显著差异(P < 0.01) Note: D: Denitrification rates; A: Anammox rates; * indicates a significant correlation at the P < 0.05 level; ** indicates a significant correlation at the P < 0.01 level

表 3 沉积物的氮循环反应速率与环境因子相关性分析 Tab.3 Correlation analysis between nitrogen cycling reaction rates of sediment and environmental factors

无贝区沉积物反硝化反应速率与间隙水理化参数相关性分析结果见表 3。从表 3可以看出，无贝区沉积物/水界面的反硝化反应速率与间隙水温度、NO₃^–含量相比具有极显著差异(P < 0.01)，与叶绿素a、TP含量相比显著差异(P < 0.05)，与NO₂^–、NH₄⁺-N含量相比差异不显著(P > 0.05)。

水生态系统的沉积物/水界面氮循环过程主要包括硝化(Nitrification)、反硝化、厌氧氨氧化等。硝化是硝化细菌在有氧条件下将铵盐(NH₄⁺)转化为NO₂^–和NO₃^–的过程，能有效去除有机物(程海华等, 2016)。反硝化作用是反硝化细菌在厌氧条件下，将NO₃^–还原生成N₂O和N₂的过程，而厌氧氨氧化则是厌氧氨氧化细菌在厌氧条件下，将NO₂^–和NH₄⁺转化为N₂的过程。目前，关于水生态系统氮循环过程的研究主要以硝化和反硝化反应为主，涉及海洋(张日钊等, 2020)、陆地河流(叶萌, 2017)、湖泊(江海洋, 2017)、水库(黄亚琦, 2020)、稻田(Dien et al, 2019)等生态系统，长期以来，反硝化过程一直被认为是水生态系统氮迁出的唯一途径。据Tanaka等(2004)和Middleburg等(1996)对海洋沉积物氮迁出的研究结果显示，反硝化可去除海洋中67%~80%的含氮化合物，而其他一些关于河口海湾区氮迁出的研究表明，反硝化可清除20%~60%的陆源氮负荷(Barnes et al, 1999)。自Mulder等(1995)首次在生物脱氮流化床反应器中发现，厌氧氨氧化反应以来，它作为氮迁出的全新途径颠覆了人们对氮循环的传统认识，成为环境科学等领域的研究热点。

Thamdrup等(2002)最早报道了自然生态系统中的厌氧氨氧化反应，并认为波罗的海—北海过渡带沉积物氮迁出中高达67%是由厌氧氨氧化反应完成的。此后，在其他大陆边缘的海底沉积物(Fernandes et al, 2016)、河口区域沉积物(Meyer et al, 2005)以及缺氧海水区域(Kuypers et al, 2003)等海洋生态系统中发现厌氧氨氧化反应的报道大量增多，海洋生态系统沉积物依靠厌氧氨氧化菌驱动氮迁出的途径也很快被人们接受(Fernandes et al, 2016)。近年来，我国科学家在湿地生态系统水陆交错带(Zhu et al, 2013)、水稻田土壤(Zhu et al, 2011)和淡水鱼养殖池塘(Shen et al, 2016)等陆地水生态系统中也陆续发现了厌氧氨氧化反应参与沉积物氮迁出的过程，但有关海水养殖池溏系统中是否存在厌氧氨氧化反应尚未见报道。本研究发现，菲律宾蛤仔养殖池塘有贝区沉积物/水界面存在厌氧氨氧化反应，进一步丰富了人们对水生态系统氮循环的认识，这可能是由于放养菲律宾蛤仔导致其周边间隙水含氧量下降，同时，菲律宾蛤仔能直接排泄NH₄⁺(邓可, 2011)，为厌氧氨氧化反应提供了反应底物。厌氧氨氧化反应不稳定，受环境因素影响较多(王刚, 2017)。本研究中，有贝区也仅在10月和11月这一贝类生长较快的时期出现厌氧氨氧化反应，而且反应速率明显低于反硝化反应。

稻虾综合养殖池塘相关研究发现，由于进水口的富营养化，使稻虾净水机制中养分含量高，导致反硝化反应速率增加(Dien et al, 2019)。本研究中，有贝区样品的反硝化速率高于无贝区，可能由于贝类的代谢导致贝类沉积物中有机质含量增高，同时，贝类的代谢活动导致有机质的增加，沉积物中微生物的代谢导致溶解氧(DO)含量的下降，为反硝化反应提供更多有利环境。在有贝区与无贝区反硝化速率的检测中发现，9月反硝化反应速率达到最大值，可能是因为9月菲律宾蛤仔养殖池塘中温度较其他采样时间温度高。李瑶(2017)研究表明，温度越高反硝化反应速率越大，温度的增加可促进反硝化反应活动，另外，本研究发现，9月NO₃^–浓度最高，大量的NO₃^–含量可为反硝化反应提供反应底物，促进反硝化反应的发生。

此外，由于菲律宾蛤仔在沉积物中扰动的灌溉作用，使含氧的上覆水进入沉积物中，促使沉积物中间隙水的O₂含量增加，促进硝化反应，为反硝化反应提供更多反应底物(NO₂^–、NO₃^–)。同时，O₂含量的增加会抑制反硝化反应，而这又与沉积物中含氮有机物的含量有关，含量较高时，有机质的氧分解会迅速耗尽沉积物中间隙水的DO，形成厌氧环境，虽然，有利于反硝化反应的发生，但也可能因为硝化反应的终止而失去反应底物。另外，反硝化反应和厌氧氨氧化反应在进行时会共同利用亚硝氮(朱泽沅等, 2016)，因此，在反应过程中也存在耦合现象。

本研究发现，有贝区、无贝区沉积物反硝化反应速率与温度具有极显著性相关(P < 0.01)，温度高则反硝化反应速率大，这与李瑶(2017)研究结果相一致。有贝区厌氧氨氧化反应速率与NH₄⁺呈现出极显著性相关(P < 0.01)，这可能是由于NH₄⁺-N作为厌氧氨氧化反应发生的底物，NH₄⁺-N浓度的增加可促使厌氧氨氧化反应的进行。有贝区与无贝区反硝化反应速率与叶绿素a浓度均表现出显著性相关(P < 0.05)，叶绿素a浓度高则表示水体中存在大量藻类，藻类可为反硝化菌提供底物(赵峰等, 2021)，促进反硝化细菌的增加，因此，可能会导致池塘沉积物反硝化速率有所增加。P是水体中初级生产力因子，在沉积物中会与Fe³⁺结合形成Fe结合P，菲律宾蛤仔的生物扰动可能会促进上覆水中的DO进入沉积物，把更多的Fe²⁺氧化成Fe³⁺而结合固定更多的P；厌氧环境则有利于P的析出，因为在缺少其他氧化还原物质时，Fe³⁺会被用于氧化有机质的电子受体，从而解脱结合的P。在菲律宾蛤仔养殖池塘中，TP浓度是厌氧氨氧化反应以及反硝化反应的影响因素之一。此外，本研究中，有贝区反硝化反应对NH₄⁺-N、NO₃^–、NO₂^–浓度以及无贝区与NO₃^–浓度均表现出相关性。虽然NH₄⁺-N与反硝化反应存在正相关看似不合理，这可能由于硝化反应的发生为反硝化反应提供了NO₃^–和NO₂^–底物，使这一现象存在。厌氧氨氧化反应和NO₂^–和NH₄⁺-N浓度具有相关性，符合厌氧氨氧化反应的反应过程。

综上所述，海水池塘中养殖菲律宾蛤仔对于沉积物/水界面的氮循环过程产生了明显影响，本研究结果不仅丰富了水生态系统氮循环理论，也为开展海水养殖尾水生物净化工作提供了新思路。