国家二级保护动物塔里木裂腹鱼(Schizothorax biddulphi)属鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、裂腹鱼亚科(Schizothpracinae)、裂腹鱼属(Schizothorax)，俗称“尖嘴鱼”，是我国的特有物种(王德忠, 1998)。有关塔里木裂腹鱼的报道主要集中在其地理分布(张人铭等, 2007)、形态特征(杨天燕等, 2018)、繁殖特性(魏杰等, 2011)、线粒体基因组DNA结构分析(杨天燕等, 2011)、遗传标记开发(Luo et al, 2012)及遗传多样性(海萨等, 2016)等方面。
鱼类组织细胞培养起步于20世纪60年代。最早的研究开始于海水鱼类组织细胞培养，并建立蓝仿石鲈(Haemulon sciurus)尾鳍细胞系(CF-1)(Clew et al, 1961)；但公认的第1个鱼类永久性细胞系是虹鳟(Oncorhynchus mykiss)生殖腺细胞系(RTG-2)(Wolf et al, 1962)。之后建立了胖头 
盐碱度水平是影响硬骨鱼类生存、繁殖、发育、生长和生理功能的最重要环境因素之一，会由于自然因素或人为因素而发生变化，从而对养殖鱼类造成渗透调节胁迫，影响其正常生长(Resley et al, 2006)。水体中盐碱度水平对鱼类的存活有显著影响，盐碱度过高或过低都会使鱼类的存活率显著的降低(Yao et al, 2010)。鱼类细胞系是进行病毒学、环境毒理学、分子遗传学、基因功能分析、细胞遗传学与种质保存等研究的材料和模型(周广舟等, 2011)。草鱼鳍细胞系可用于研究草鱼源维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)对宿主细胞的毒性及致死机制(刘明珠等, 2019)；异育银鲫(Carassius auratus gibelio)尾鳍细胞(GiCF)可用于辛硫磷对GiCF毒性研究(赵燕楠等, 2020)；泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)鳍细胞系用于研究铜、锌对泥鳅鳍细胞DNA损伤及金属硫蛋白表达的影响(姜姗等, 2020)。
本研究建立了塔里木裂腹鱼尾鳍组织细胞系，测定了盐度(NaCl)和碱度(NaHCO3)对其增殖的影响。本研究旨在为合理开发和利用塔里木裂腹鱼遗传资源以及建立和保护其种质资源提供一定的科学依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验用塔里木裂腹鱼于2019年9月取自新疆克孜勒河，饲养在新疆建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室。取其中1条健康雌塔里木裂腹鱼，体重为21.37 g，全长为15.46 cm。
DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640、M199培养基购自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；磷酸缓冲液(PBS)、青霉素–链霉素双抗、二甲基亚砜(DMSO)购自Solarbio公司；台盼蓝和0.25%胰酶购自Biotopped公司；MS-222购自渔夫宝公司；基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。
1.2 实验方法 1.2.1 原代培养与传代培养取健康塔里木裂腹鱼，加入0.1 μL/g的MS-222麻醉剂麻醉后，剪取上尾鳍。用75%的酒精对尾鳍进行消毒，置于超净台中。取4个培养皿，其中，1个加入75%的酒精，3个加入添加含500 IU/mL青霉素、500 μg/mL链霉素、12.5 μg/mL两性霉素B的PBS。尾鳍放入酒精中30 s，然后依次在另外3个培养皿中浸泡，之后将其放入2 mL无菌离心管中，并用无菌眼科剪将其剪成大约1~2 mm3的组织碎块，向其中加入500 μL的DME/F12培养液，将组织碎块移到25 mm2培养瓶中，正相放入25℃、5%的CO2培养箱中，观察细胞贴壁情况。4 h后反相放置，培养2 h后，向其中加入1 mL DME/F12培养液(含20% FBS、500 IU/mL青霉素、500 μg/mL链霉素、12.5 μg/mL两性霉素B)，正相放入25℃、5%的CO2培养箱中继续培养，12 h后加入9 mL培养液，继续正相放置培养。每天用倒置荧光显微镜(AMG EVOS F1)观察组织块迁移情况。
原代培养过程中，更换培养液的时间为2~4 d。当组织碎块周围迁出细胞，细胞浓度达106 cells/mL时，按1∶2的比例进行传代。直到第5代后，青霉素、链霉素的浓度降低到200 IU/mL和200 μg/mL，FBS浓度也降低到15%。到第8代后，使用含10% FBS和1% P/S的DME/F12培养液。
1.2.2 细胞生长曲线将一定浓度的细胞接种到24孔细胞培养板，分成8组，每组6孔，连续7 d常规培养，用血球计数板进行计数，每天记1组，分析数据并绘制细胞生长曲线。细胞生长曲线的纵坐标为每天计数的细胞平均个数，时间为横坐标。根据下面公式计算细胞的群体倍增时间：
| $ T=t \times \lg / \lg \left(N_{t} / N_{0}\right) $ |
式中，Nt为时间t后的细胞数，N0接种细胞数(Nicholas, 1991)。
1.2.3 最佳培养基检测DME/F12、M199、L-15、MEM、RPMI-1640共5种不同培养基维持细胞生长的能力。每种培养基中均补充10% FBS和1% P/S。分别将一定浓度的细胞接种在不同的培养基中，在25℃、5%的CO2条件下培养96 h，在5个时间点，即0、24、48、72及96 h利用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞的生长曲线。
1.2.4 最适培养温度检测20℃、25℃、30℃和37℃不同温度对细胞生长的影响。所用培养液为含10% FBS和1% P/S的DME/F12培养液。在25℃、5%的CO2条件下培养96 h，在5个时间点即0、24、48、72及96 h利用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞的生长曲线。
1.2.5 最适血清浓度确定最适合的培养液及温度后，其他条件一致，设置不同FBS浓度(0、5%、10%和20%)，在25℃、5%的CO2条件下培养，在5个时间点，即0、24、48、72及96 h利用血球计数板进行细胞计数，绘制细胞生长曲线。
1.2.6 细胞冻存与复苏配制10% DMSO、20% FBS、70% DME/F-12的细胞冻存液，细胞浓度为2×106 cells/mL，倒入冷冻管，液氮冻存。按细胞∶培养液=1∶5比例加入培养液使细胞悬浮，复苏培养。
1.2.7 细胞污染鉴定选用观察法与PCR法检测细胞是否被细菌、真菌、支原体污染。所用引物见表 1。
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表 1 通用引物序列 Tab.1 Universal primer sequence |
利用动物组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取塔里木裂腹鱼尾鳍细胞的基因组DNA。通过PCR扩增提取DNA。根据塔里木裂腹鱼16S rRNA设计引物，扩增引物为16SF和16SR (表 1)。配制50 μL反应体系：25 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各2.5 μL，5 μL模板DNA，15 μL的灭菌超纯水。PCR反应条件：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，56.8℃退火30 s，72℃延伸40 s，循环35次；72℃延伸10 min。扩增反应结束后，取1 μL PCR产物在核酸蛋白检测仪上检测DNA的浓度；取8 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。PCR产物测序，比较获得序列与已发表序列的一致率。
1.2.9 盐碱度对塔里木裂腹鱼细胞系增殖数量的影响NaCl盐度设置1、2、4、6、8、10共6个梯度。称取NaCl加入DME/F12培养液溶解，溶解后再用0.22 μm过滤筛过滤。
NaHCO3碱度设置2、3、4、5、6、7、8、10 g/L共8个梯度。称取NaHCO3加入DME/F12培养液溶解，溶解后再用0.22 μm过滤筛过滤。
细胞铺板：将第10代对数生长期BICF1用含10%胎牛血清DME/F12培养液调整密度为1×104 cells/mL的细胞悬液，铺置于96孔细胞培养板上，每种材料铺6孔。每孔加入100 μL细胞悬液，25℃、5% CO2培养箱培养12 h后，按分组分别加入不同浓度盐和碱，各孔20 μL，继续培养24、48、72 h。之后将每个液体孔加入20 μL MTT后继续培养4 h，小心吸出各孔内液体，然后，每孔加入150 μL DMSO。摇床培养20 min，酶联免疫检测仪490 nm波长下测定各孔的OD值。通过计算，得出细胞相对增殖率：
相对增殖率=OD实验组/OD空白对照组×100%。
使用SPSS 20软件包对数据进行统计学分析，数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示，P < 0.05为差异具有显著性。多组间比较用方差分析，两组间比较采用T检验。α=0.05为检验水准。
2 结果 2.1 塔里木裂腹鱼尾鳍细胞原代培养与传代培养观察塔里木裂腹鱼尾鳍细胞生长状态。3 d后，细胞贴壁且组织块周围逐渐有细胞迁出；7 d后，细胞正常迁出；13 d后，细胞铺满细胞瓶70%；18 d后，细胞出现悬浮现象(图 1)；19 d后，进行原瓶传代。细胞浓度到106 cells/mL时，进行1∶2传代，此后每隔2~4 d传代1次。细胞悬浮生长，成功传至45代。
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图 1 塔里木裂腹鱼尾鳍细胞原代培养的不同阶段 Fig.1 Different stages of primary culture of tail fin cells of S. biddulphi |
塔里木裂腹鱼尾鳍细胞系第10代细胞的生长曲线呈“S”型，0~1 d为潜伏期，1~4 d为指数生长期，4~5 d为平台期，5 d之后为衰退期(图 2)。第10代塔里木裂腹鱼尾鳍细胞的群体倍增时间为28.11 h，细胞分裂旺盛。
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图 2 塔里木裂腹鱼尾鳍细胞生长曲线 Fig.2 The growth curve of tail fin cells of S. biddulphi 标有不同字母者表示组间差异显著(P < 0.05)。下同。 Means with different letters are significantly different (P < 0.05). The same as below. |
塔里木裂腹鱼尾鳍细胞在DME/F12、M199、L-15、MEM、RPMI-1640不同培养基中维持细胞生长的能力如图 3所示，在这些培养基中均能生长，但在DME/F12培养基中细胞生长最好。因此，DME/F12为最佳培养基(P < 0.05)。
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图 3 塔里木裂腹鱼尾鳍细胞最佳培养基 Fig.3 Optimum medium of tail fin cells of S. biddulphi 小写字母表示同一时间下BICF1多重比较。下同。 Indicated with lowercase letters for BICF1 multiple comparisons at the same time. The same as below. |
塔里木裂腹鱼尾鳍细胞在30℃生长最慢，25℃生长最快，20℃生长较快，在20℃~25℃范围内，皆能良性生长(图 4)，生长的最适温度为25℃(P < 0.05)。
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图 4 塔里木裂腹鱼尾鳍细胞最适培养温度 Fig.4 Optimum culture temperature of tail fin tissue cell of S. biddulphi |
塔里木裂腹鱼尾鳍细胞在未加血清的培养基中生长明显低于添加血清的细胞生长，随着血清浓度5%、10%、20%依次增大，细胞生长依次加快，当FBS浓度为20%时，塔里木裂腹鱼尾鳍细胞生长明显最快(P < 0.05)(图 5)。
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图 5 塔里木裂腹鱼尾鳍细胞最适血清浓度 Fig.5 Optimum serum concentration of tail fin tissue cells of S. biddulphi |
对塔里木裂腹鱼第6代尾鳍细胞系进行液氮冷冻，保存40、90及180 d后复苏，经台盼蓝染色并计数统计，40 d存活率为(91.49±0.69)%，90 d存活率为(88.41±0.80)%，180 d存活率为(87.85±0.66)%，90和180 d存活率差异不显著(P > 0.05)(表 2)。细胞具有活性，且复苏后增殖速度快(图 6)，可正常传代(图 7)。
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表 2 冻存后复苏存活率 Tab.2 Survival rate of recovery after freezing |
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图 6 MTT法测定复苏细胞增殖 Fig.6 Determination of the resuscitated cells by MTT method |
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图 7 塔里木裂腹鱼尾鳍细胞复苏培养 Fig.7 The resuscitation culture of tail fin of S. biddulphi |
塔里木裂腹鱼尾鳍细胞中提取细菌、真菌和支原体，经过PCR法鉴定细菌、真菌、支原体污染，样品均无与阳性对照组一致的条带，样品中无细菌、真菌、支原体，塔里木裂腹鱼尾鳍细胞未被污染。
2.8 塔里木裂腹鱼尾鳍细胞来源鉴定用基因组DNA试剂盒提取塔里木裂腹鱼尾鳍细胞DNA，经PCR扩增，在琼脂糖凝胶中电泳检测，PCR产物目的条带大小符合16S rRNA的大小。经测序后的序列片段与数据库中的GenBank进行Blast比对。塔里木裂腹鱼尾鳍细胞同源性与GenBank中发布的来源于塔里木裂腹鱼线粒体基因(JQ844133.1)的序列达到100%；证明尾鳍细胞来自于塔里木裂腹鱼。
2.9 MTT法检测各组盐碱度的细胞增殖数量 2.9.1 盐度对塔里木裂腹鱼尾鳍细胞增殖数量的影响在盐度一定的情况下，BICF1的增殖数量随时间延长而下降，盐度对BICF1的相对增殖数量的抑制可随时间延长而增强。BICF1增殖数量在盐度为1、2、4、6时呈上升趋势，在盐度为6、8、10呈下降趋势，盐度为6时，BICF1增殖数量最高。BICF1增殖数量随盐度增加呈先升高后下降的趋势(表 3和图 8)。
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表 3 盐度对BICF1增殖的影响(Mean±SD) Tab.3 Effects of salinity on BICF1 cell proliferation |
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图 8 不同浓度NaCl/NaHCO3对BICFI细胞增殖数量的影响 Fig.8 Effects of different concentrations of NaCl/NaHCO3 on the number of proliferation of BICFI cells |
在碱度一定时，BICF1的增殖数量随时间(24、48、72 h)延长而下降，碱度对BICF1的相对增殖数量的抑制随时间延长而增强。在同一时间点上，BICF1增殖数量在碱度2、3、4、5、6 g/L时呈上升趋势，在碱度为6、7、8、10 g/L时呈下降趋势，碱度为6 g/L时，BICF1增殖数量最高。BICF1增殖数量随NaHCO3碱度增加呈先升高后下降的趋势(表 4和图 8)。
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表 4 NaHCO3碱度对BICF1增殖的影响 Tab.4 Effect of NaHCO3 alkalinity on BICF1 cell proliferation (Mean±SD) |
本研究以塔里木裂腹鱼尾鳍组织为材料，采用组织块移植法成功进行了塔里木裂腹鱼尾鳍组织细胞原代培养，命名为BICFI。BICFI在10% FBS的DME/F12培养液中生长良好。细胞培养常用的培养液有L-15、MEM和M199，但不同的鱼类对环境要求不尽相同，因此，不同鱼类的最适培养基亦不同。青鱼(Mylopharyngodon piceus)尾鳍细胞系(BC-Fin)的最佳培养液为L-15(张雪萍等, 2016)；麦穗鱼(Pseudorasbora parva)鳍细胞系的最佳培养液为MEM(杨坤等, 2013)；匙吻鲟(Polyodon spathula)鳍细胞系(PF-Fin)的最佳培养液为M199(肖艺等, 2010)；红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)鳍细胞系的最佳培养液为DMEM/F12(王缙云等, 2018)，本研究中筛选了DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640和M199培养基，得出DME/F12为最佳培养液。鱼类组织细胞生长温度范围和哺乳类组织细胞比较，范围比较广。BICFI在20℃~25℃均能正常生长。研究表明，牙鲆(Paralichthys olivaceus)与鲈(Perca fluviatilis)鳍细胞系为广温性(童裳亮等, 1997)，本研究与已报道的鱼类细胞的温度适应范围是一致的(Wang et al, 2010)，这与鱼类是变温动物有很大关系。在0、5%、10%、20%的FBS中生长时，未加FBS的生长速度明显低于添加FBS的生长速度，在FBS为20%时生长最快，FBS浓度对细胞生长有明显的影响，与已报道的研究相似(王缙云等, 2018)。本研究测定的第10代BICF1生长曲线呈“S”型生长曲线，1 d为指数生长期。红鳍东方鲀鳍细胞系在2~4 d为指数生长期，4~5 d为平稳期(王缙云等, 2018)，5 d之后为衰退期。与红鳍东方鲀鳍细胞相比，BICF1进入指数生长期更快。
本研究塔里木裂腹鱼BICF1呈悬浮生长。贴壁培养型的细胞，细胞膜表面含有大量黏附因子。这些黏附因子可激活不同的信号通路调节贴壁细胞的活性和增殖，如整合素(integrins)活化黏着斑激酶(focal adhesion kinase)激活信号通路抑制细胞内源性的凋亡(Zhong et al, 2012; Hofmann et al, 2007)。悬浮培养的细胞一般为淋巴细胞等血液系统来源的细胞，细胞体积小，缺乏粘附分子的表达(姬广超等, 2020; 徐伟等, 2020)。在塔里木裂腹鱼BICF1染色体的制备中发现，用0.075 mol/L的KCl低渗时间达90 min。有研究报道，棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀)×鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus♂) F1染色体制备中低渗时间为25 min (刘莉等, 2016)；鲤(Procypris rabaudi)染色体标本的制备中低渗的时间控制在35 min (耿波等, 2003)；黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)染色体标本的制备中低渗的时间控制在40 min (宋立民等, 2010)；灰海马(Hippocampus erectus)染色体标本的制备中低渗的时间为50 min (刘鑫等, 2020)；报道的研究中低渗的时间在25~50 min。因此，推测塔里木裂腹鱼BICF1细胞膜不易破裂，与BICF1细胞膜的坚韧程度有关。用物理方法进行贴壁型细胞的悬浮驯化时，使细胞发生失巢凋亡(anoikis)(王朋朋等, 2021)，无血清与生物反应器驯化使贴壁细胞产生失巢凋亡的拮抗。目前，MDCK(吴培培等, 2016)、BHK-21(赵彩红等, 2019)、Hi5-SF(马伟等, 2017)、PK15(刘天伦等, 2019)等被驯化。塔里木裂腹鱼BICF1培养中可能产生类似于失巢凋亡的调节。塔里木裂腹鱼肾细胞呈悬浮生长的状态，可能与其体积和细胞膜表面粘附分子的表达及细胞膜坚韧程度有关，可能与类似于失巢凋亡的调节有关，具体原因有待于进一步研究。
细胞来源的鉴定通常采用16S rRNA、12S rRNA和Cytb等基因片段，本研究选择16S rRNA进行鉴定，BICF1序列分析结果与塔里木裂腹鱼基因序列一致性为100%，证明细胞系来自于塔里木裂腹鱼。
塔里木裂腹鱼曾是新疆博斯腾湖主要经济鱼类，由于开荒造田，农田盐碱水大量排入湖水，盐碱度逐年升高(刘立彭, 1983)。水体中盐碱度水平对鱼类存活有显著影响，盐碱度过高或过低都会显著降低鱼类的存活率(张雅芝等, 2009; 秦志清等, 2010)。在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)盐碱度的耐受性研究中发现，盐度为20时，仅少数个体能存活96 h；NaHCO3碱度为12 g/L时，96 h全部死亡(赵丽慧等, 2014)；对缢蛏(Sinonovacula constricta)急性低盐胁迫，并检测当盐度由2到0时，其存活率随盐度的下降而降低(李智等, 2020)；当碳酸盐碱度为0~44.58 mmol/L、pH为9.0~10.0时，随着碳酸盐碱度浓度的上升，缢蛏的存活率明显下降(叶博等, 2019)。本研究中，盐度为1~6时，BICF1增殖数量上升；盐度为6~10时，BICF1增殖数量下降；盐度为6时，BICF1增殖数量最高。NaHCO3碱度为2~6 g/L时，BICF1增殖数量上升；碱度为6~10 g/L时，BICF1增殖数量下降；碱度为6 g/L时，BICF1增殖最高。本研究中，盐碱度过高或过低都会使塔里木裂腹鱼尾鳍细胞的存活率降低。红鲫(Carassius auratus red)鳍细胞系被建立被用于抗药性和抗病性的研究，细胞系可用于毒性筛选和病毒分离的材料(Xiao et al, 2018)。草鱼鳍细胞系用于研究草鱼源维氏气单胞菌对宿主细胞的毒性致死机制(刘明珠等, 2019)；异育银鲫(Carassius auratus gibelio)尾鳍细胞(GiCF)用于辛硫磷对GiCF毒性研究，表明GiCF可作为农药的细胞毒性研究材料(赵燕楠等, 2020)。本研究中，塔里木裂腹鱼尾鳍细胞系可作为研究盐碱度对塔里木裂腹鱼的影响的材料，可为其选择育种和功能基因研究提供良好的载体。
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