凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是我国非常重要的水产经济动物，自引入我国以来，养殖规模不断扩大，创造了巨大的经济价值。但养殖过程中出现的亚硝酸盐成为了制约凡纳滨对虾产业发展的重要因素。亚硝酸盐是养殖水体中常见的化学物质。氨氮在亚硝化作用下变为亚硝酸盐，之后通过硝化作用转变为硝酸盐。但硝化作用与亚硝化作用一般无法达到平衡，因此，亚硝酸盐容易在水体中积蓄。亚硝酸盐可导致虾类生长和发育异常，病菌易感性增加(Tseng et al, 2004; 臧维玲等, 1996; Mallasen et al, 2006)，并会造成一定程度的组织损伤。一定浓度的亚硝酸盐可使血淋巴与氧结合能力降低(Chen et al, 1995)，最终导致虾窒息死亡。彭自然等(2004)研究发现，凡纳滨对虾在含有亚硝酸盐的水体中养殖14 d后，其生长和发育受到了明显抑制。胡义波等(2005)研究发现，凡纳滨对虾经亚硝酸盐胁迫后体内血细胞减少，细胞超微结构受到明显影响。吴中华等(1999)研究发现，亚硝酸盐慢性胁迫条件下，中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)各个组织均受到不同程度的影响，其中肝胰腺组织病变较为严重。Cheng等(2000)研究发现，斑节对虾(Penaeus monodon)经亚硝酸盐胁迫后，肝胰腺和中肠中亚硝酸盐积累较多。Zhang等(2015)研究发现，在经氨氮和亚硝酸盐联合胁迫24 h后，罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)血淋巴中活性氧升高，抗氧化酶活性受到影响。葛红星等(2014)研究发现，凡纳滨对虾在不同浓度亚硝酸盐水体中暴露20 d后，对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的易感性提高。总体而言，一定浓度的亚硝酸盐可对凡纳滨对虾的免疫功能和生长造成较明显的阻遏作用。近年来，关于亚硝酸盐的研究主要集中于亚硝酸盐对虾类的急性毒性影响，主要研究短期亚硝酸盐胁迫后虾体内抗氧化酶活性、氧化损伤以及对病菌易感性的变化，而较少有针对亚硝酸盐对凡纳滨对虾亚急性毒性的研究。本实验研究凡纳滨对虾在5个不同亚硝酸盐浓度的水体中养殖40 d后体内部分免疫相关酶活性、免疫和生长相关基因表达变化情况，以期为亚硝酸盐亚急性胁迫对凡纳滨对虾的影响提供参考依据。

实验用虾取自上海申漕特种水产有限公司，挑选健康、体长为(7.45±0.21) cm、体质量为(4.75±0.51) g的凡纳滨对虾暂养于水泥池中。

凡纳滨对虾暂养1周后开始实验。通过预实验得知，凡纳滨对虾96 h半致死浓度(96h-LC₅₀)约为30 mg/L，取该浓度的20%为最高浓度并按等对数间距设置5个亚硝酸盐浓度，分别为0.50、0.90、1.70、3.20和6.00 mg/L。每个处理设3组平行，每个平行放30尾虾。对照组亚硝酸盐浓度约为0.05 mg/L。实验在卤虫池中进行，水体体积为100 L，每日换水1/2。每日利用分光光度计测得水体中亚硝酸盐浓度，并使用10 g/L NaNO₂溶液控制水体中的亚硝酸盐浓度。

实验期间，温度控制在26℃~27℃，盐度为5，总氨氮≤0.5 mg/L，非离子氨≤0.02 mg/L，pH控制在7.8±0.2，24 h曝气。每日投喂3次人工饲料(鱼粉23%、酵母粉4%、大豆磷脂4%、豆粕20%、花生粕7.4%等)，每日投喂量为虾体质量的11%~16%。每日记录虾的死亡状况。养殖实验进行40 d后(取样前停饲24 h)，每个平行取3尾虾的肝胰腺放入离心管中，存放于–80℃冰箱，用于酶活测定和RNA提取。另外，使用1 mL注射器在第2腹肢基部抽取凡纳滨对虾的血淋巴，并放入离心管中。血淋巴存于4℃冰箱，放置24 h后离心取上清液，放置于–80℃冰箱，用于酶活测定。

通过以下公式计算得到不同浓度感染组的死亡率(MR)、体质量增长率(WGR)和体长增长率(LGR)。

式中，N₀为初始数量；D_T为实验结束时死亡数量；W₀和W_T分别为初始平均体质量和实验结束时平均体质量；L₀和L_T分别为初始平均体长和实验结束时平均体长。

采用超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、丙二醛(MDA)、谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)试剂盒(南京建成生物工程有限公司)测定凡纳滨对虾肝胰腺和血清的生理生化指标。

使用RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒(DP451)(北京天根生化科技有限公司)提取肝胰腺组织RNA。采用核酸蛋白测定仪测定的RNA样品的OD_{260 nm}和OD_{280 nm}值，确定其浓度，并计算二者比值以确定RNA的纯度。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。

按照PrimeScript^™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书(TaKaRa)将之前所提取的总RNA进行反转录，得到的cDNA存放于–20℃冰箱中。根据NCBI数据库中凡纳滨对虾mn-sod (DQ005531)、cat (AY518322)、hsp70 (AY645906)等基因的保守区域和β-actin基因的序列设计特异性引物(表 1)。

表 1(Tab.1)

表 1 实验中所用引物序列 Tab.1 Sequences of the primers in this study 引物Primer 序列Sequences (5′~3′) mn-sod F CTGGTTCCGTTGCTTGGC mn-sod R CGCTCATTCACGTTCTCCC cat F TCAGCGTTTGGTGGAGAA cat R GCCTGGCTCATCTTTATC hsp70 F AGGAGACCGCTGAGGCTTAC hsp70 R AGCACATTCAGACCCGAGAT trx F TTAACGAGGCTGGAAACA trx R AACGACATCGCTCATAGA tgase F TTAACGAGGCTGGAAACA tgase R AACGACATCGCTCATAGA trypsin F ACGGTCATCCTCTCCAAG trypsin R GTCCTCAATGTCGCTCTG chitinase F GGTCTCTACGCTCATCCTCTC chitinase R TCATCCACTACGGTCCATTCC ctsb F CCTCTGTGGTTTTGGATGTA ctsb R GATGCTGTATGCTTTGCCTC β-actin F GCCCATCTACGAGGGATA β-actin R GGTGGTCGTGAAGGTGTAG

表 1 实验中所用引物序列 Tab.1 Sequences of the primers in this study

使用ABI PRISM^® 7900 Sequence Detection System仪器，根据SYBR^® Green Real-time PCR Master Mix试剂盒说明书，对各组实验样品的目的基因和β-actin基因cDNA进行定量测定。ABI PRISM^® 7900 Sequence Detection System的具体反应程序设置为：94℃预变性30 s，94℃变性5 s，60℃退火25 s，72℃延伸30 s，共40个循环。最后根据熔解曲线分析PCR产物质量。采用2^–∆∆Ct计算法对各组样品测得的基因数据进行定量分析。

所有数据使用平均值±标准差(Mean±SD)表示。采用SPSS 17.0和Excel 2010分析数据，使用Duncan´s multiple range test检验统计差异，P < 0.05为差异显著。

由表 2可知，凡纳滨对虾死亡率随亚硝酸盐浓度的增加而升高。各浓度组死亡率均显著高于对照组(P < 0.05)，6.00 mg/L浓度组死亡率为最高(P < 0.05)。

表 2(Tab.2)

表 2 不同浓度亚硝酸盐对凡纳滨对虾死亡率和生长的影响 Tab.2 Effect of different concentrations of nitrite on growth performance and mortality rate of L. vannamei 浓度 Concentration /(mg/L) 死亡率 MR/% 体质量增长率 WGR/% 体长增长率 LGR/% 0.05 1.67±2.82a 34.43±0.63a 8.21±0.14a 0.50 26.54±4.60b 25.33±4.71ab 6.32±0.11b 0.90 33.33±3.62b 30.46±6.31a 6.15±2.83b 1.70 63.00±3.73c 20.13±6.22ab 5.42±2.12b 3.20 51.67±2.78c 26.42±1.44ab 7.05±1.40ab 6.00 75.00±1.82d 13.23±1.61b 5.21±0.33b

表 2 不同浓度亚硝酸盐对凡纳滨对虾死亡率和生长的影响 Tab.2 Effect of different concentrations of nitrite on growth performance and mortality rate of L. vannamei

凡纳滨对虾体质量增长率和体长增长率总体上随亚硝酸盐浓度的增加呈降低的趋势。6.00 mg/L浓度组体质量增长率和体长增长率为最低，并显著低于对照组(P < 0.05)，其他浓度组体长增长率和体质量增长率组间无显著差异(P > 0.05)。

除0.50 mg/L浓度组外，其他浓度组血清中SOD和CAT活性均高于对照组，其中，SOD和CAT活性分别在3.20和0.90 mg/L浓度组达到最高并显著高于对照组(P < 0.05)(图 1a、图 1b)。除0.50 mg/L浓度组外，其他浓度组肝胰腺SOD活性均高于对照组，0.90 mg/L浓度组SOD活性为最高(P < 0.05)(图 1c)。如图 1d所示，0.50、0.90和1.70 mg/L浓度组肝胰腺CAT活性显著高于对照组(P < 0.05)。3.20和6.00 mg/L浓度组CAT活性显著低于对照组，且各组间存在显著差异(P < 0.05)(图 1d)。

图 1(Fig. 1)

图 1 不同浓度亚硝酸盐对凡纳滨对虾抗氧化酶活性和MDA含量的影响 Fig.1 Effects of different concentrations of nitrite on antioxidant enzyme activity and MDA content of L. vannamei 不同字母代表存在显著差异(P < 0.05)，下同。 Different letters indicate significant difference (P < 0.05). The same as below.

血清中AKP和ACP活性随亚硝酸盐浓度的增加总体呈升高的趋势，而在肝胰腺中则呈波动变化。3.20 mg/L浓度组血清AKP和ACP活性达到最高(P < 0.05)(图 1e、图 1f)。而肝胰腺中ACP和AKP活性在0.90 mg/L浓度组为最高(P < 0.05)(图 1g、图 1h)。

MDA含量总体呈波动变化，其中，3.20 mg/L浓度组血清MDA含量显著高于对照组(P < 0.05)，其他浓度组与对照组无显著差异(P > 0.05)(图 1i)。除0.50 mg/L浓度组，其他浓度组肝胰腺MDA含量均高于对照组，其中，0.90、1.70和6.00 mg/L浓度组显著高于对照组(P < 0.05) (图 1j)。

除0.50 mg/L浓度组外，其他浓度组GPT活性均显著高于对照组(P < 0.05)。各浓度组GPT活性无显著差异(P > 0.05)(图 2a)。3.20和6.00 mg/L浓度组GOT活性显著高于其他浓度组(P < 0.05)，其他浓度组间无显著差异(P > 0.05)(图 2b)。

图 1(Fig. 1)

图 2 不同浓度亚硝酸盐对凡纳滨对虾GOT和GPT酶活性的影响 Fig.2 Activity changes of GOT and GPT of L. vannamei after being challenged by different concentrations of nitrite

除0.50 mg/L浓度组外，其他浓度组mn-sod和hsp70基因表达量显著高于对照组(P < 0.05)。mn-sod和hsp70基因表达量分别在6.00和3.20 mg/L浓度组达到最高(P < 0.05)(图 3a、图 3b)。cat、trx和tgase基因均随亚硝酸盐浓度的增加呈降低的趋势，各浓度组基因表达量均显著低于对照组(P < 0.05)(图 3c~图 3e)。

图 1(Fig. 1)

图 3 不同浓度亚硝酸盐对凡纳滨对虾肝胰腺中免疫相关基因表达的影响 Fig.3 Changes of expression of immune-related genes in hepatopancreas of L. vannamei after being challenged by different concentrations of nitrite

trypsin和chitinase基因表达量随亚硝酸盐浓度的增加总体呈先降低后升高的趋势。各浓度组的trypsin基因表达量均显著低于对照组(P < 0.05)，且各浓度组无显著差异(P > 0.05)。6.00 mg/L浓度组的chitinase基因表达量升高，并显著高于其他浓度组(P < 0.05)(图 4a、图 4b)。

图 1(Fig. 1)

图 4 不同浓度亚硝酸盐对凡纳滨对虾肝胰腺中生长相关基因表达的影响 Fig.4 Changes of expression of growth-related genes in hepatopancreas of L. vannamei after being challenged by different concentrations of nitrite

ctsb基因表达量随亚硝酸盐浓度的增加呈波动变化，0.50 mg/L浓度组达到最低并显著低于对照组(P < 0.05)。0.90和6.00 mg/L浓度组显著高于对照组(P < 0.05)。1.70和3.20 mg/L浓度组与对照组无显著差异(P > 0.05)(图 4c)。

甲壳动物在受到pH、重金属等环境因子胁迫时，会发生生理功能紊乱和免疫功能下降(汪蕾等, 2016; Lyu et al, 2014; 周萌等, 2015)，异物入侵会造成虾的氧化损伤(Kultz, 2005)并最终导致细胞功能出现障碍，而抗氧化酶可帮助机体消除多余的自由基，从而使机体免受氧化损伤。SOD和CAT是凡纳滨对虾体内2种重要的抗氧化酶，可协同清除自由基(洪美玲等, 2007)。Zhang等(2015)对罗氏沼虾进行了氨氮和亚硝酸盐的联合急性胁迫实验，当氨氮浓度为0 mg/L时，随亚硝酸盐浓度的升高，罗氏沼虾血清中SOD活性先降低后升高。葛红星等(2014)研究了不同浓度亚硝酸盐(2、4、6和10 mg/L)急性胁迫对凡纳滨对虾免疫相关酶活性的影响，其中6和10 mg/L浓度组对各时间段的抗氧化酶活性有明显的抑制作用，而其他浓度组不明显。本研究中，除0.50 mg/L浓度组外，其他浓度组SOD活性均显著升高，其中0.90和1.70 mg/L浓度组CAT活性显著升高，较高浓度组(3.20和6.00 mg/L) CAT活性有一定程度的下降。这与上述研究结果不一致，原因可能是当亚硝酸盐浓度较低时出现“毒性兴奋效应”，而较高浓度的亚硝酸盐则超出抗氧化酶的正常调节范围。MDA是脂质氧化过程中的产物(Liu et al, 2011)，其含量可反映机体所受的氧化损伤程度。本研究肝胰腺中各浓度组MDA含量升高时，SOD活性也相应升高，说明机体中的抗氧化酶活性会随MDA含量的变化发生改变，以便及时帮助机体清除自由基。ACP和AKP是2种水解酶，在去磷酸化过程中起重要作用，且可参与机体解毒过程(何海琪等, 1992)。沈敏等(2019)研究发现，高盐胁迫可使凡纳滨对虾体内的ACP活性显著升高，而当盐度高于45后，ACP活性降低。彭军辉等(2018)研究发现，ACP和AKP活性随氨氮胁迫时间的增加先升高后降低。本研究中，AKP与ACP活性总体呈升高的趋势，未受到明显抑制，原因可能是AKP和ACP仍在进行解毒作用且亚硝酸盐浓度没有超出ACP和AKP的正常调节范围。此外，GOT和GPT活性可反映机体肝组织健康状态和功能，肝胰腺功能与免疫、代谢等能力息息相关，当对虾处于健康状态时，血清中只有少量的转氨酶；当虾肝组织受损时，肝细胞会向血淋巴中释放大量转氨酶(许宏庆等, 2006)。本研究中，除0.50 mg/L浓度组外，其他浓度组中的转氨酶活性均显著高于对照组，说明肝胰腺功能可能受到明显影响。

肝胰腺是凡纳滨对虾重要的消化器官，具有代谢、消化和免疫等重要功能(蒋昊, 2009)，因此，肝胰腺是对虾受到环境胁迫后的重要研究对象。Wang等(2009)研究发现，pH胁迫对凡纳滨对虾肝胰腺mn-sod基因的表达有诱导作用。本研究中，除0.50 mg/L浓度组外，其他浓度组肝胰腺mn-sod基因表达量均显著升高，与Wang等(2009)的结果相似，表明在亚硝酸盐胁迫40 d后，肝胰腺中的SOD可能仍在发挥作用，且随亚硝酸盐浓度的增加，mn-sod基因表达量升高以增强抗氧化能力。Zheng等(2016)研究发现，日本对虾(Marsupenaeus japonicus)肝胰腺中cat基因表达量在高浓度亚硝酸盐(20 mg/L)的影响下，短时间会明显升高，但随时间的增加，cat基因表达量逐渐降低。本研究中，cat基因表达量随亚硝酸盐浓度的增加显著降低，原因可能是长时间的亚硝酸盐胁迫会对cat基因表达产生抑制作用，从而减少CAT的产生。值得注意的是，CAT酶量减少，但部分浓度组活性仍较高，造成该结果的原因有待研究。本研究中，mn-sod基因表达量明显升高，而cat基因则相反，表明凡纳滨对虾在SOD活性方面对亚硝酸盐胁迫有较强适应性。

硫氧还蛋白(TRX)是具有氧化还原活性的蛋白质，属于过氧化酶(PRX)家族。PRX广泛存在于各种哺乳动物、植物和无脊椎动物中，具有多种生理功能，具有抗氧化、抗高温等功能(Radyuk et al, 2003)。在无脊椎动物中，PRX通过消除机体内H₂O₂来参与体内抗氧化反应。郭慧等(2017)研究发现，亚硝酸盐胁迫能显著抑制凡纳滨对虾肝胰腺中trx基因的表达。本研究各浓度组的trx基因表达量均显著降低。说明在长时间的亚硝酸盐胁迫下，肝胰腺中的TRX在抗亚硝酸盐胁迫过程中被不断消耗，且基因表达受到抑制。

谷氨酰胺转移酶(TGASE)在对虾免疫功能中具有重要作用。Fagutao等(2012)研究发现，将日本对虾tgase基因沉默后，虾体内的血细胞数量显著降低，同时抗菌肽和溶菌酶的基因表达显著降低，细菌总数升高；Yao等(2019)研究发现，凡纳滨对虾血蓝蛋白可与TGASE直接相互作用并调节其表达。以上研究表明，TGASE参与对虾凝血过程。虾类受到异物入侵时，血细胞会释放TGASE并形成血浆蛋白(Maningas et al, 2008)。卢芷程(2018)则发现，溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)可在短期内诱导tgase基因的表达，而随时间延长，tgase基因表达量持续降低。说明长时间的环境胁迫会导致tgase基因表达受到抑制。这与本研究结果基本一致，推测凡纳滨对虾的凝血功能可能受到一定程度的影响。

热休克蛋白(HSPs)作为一种分子伴侣，可对各种外界刺激造成的细胞损伤进行自我修复，并在虾类的应激反应和先天免疫系统中发挥重要作用(雷爱莹等, 2008)。当虾类机体内自由基达到一定数量并超出机体消除自由基的能力后，热休克蛋白基因会被诱导表达。董学兴(2019)研究发现，短期氨氮胁迫可诱导罗氏沼虾hsp70基因大量表达。本研究中，除0.50 mg/L浓度组外，其他浓度组hsp70基因表达量均显著高于对照组，表明凡纳滨对虾体内自由基与抗氧化酶系统可能失衡，热休克蛋白基因被诱导表达并参与机体修复。综上所述，凡纳滨对虾总体上生理和免疫功能均受到抑制，但在SOD活性方面表现出较强的适应性。

此外，本研究发现，亚硝酸盐会显著抑制凡纳滨对虾的生长。随着亚硝酸盐浓度的增加，体质量增长率和体长增长率均呈降低的趋势，与肖威等(2020)的结果一致。本研究检测的4种生长相关基因均与凡纳滨对虾的生长发育有非常密切的关系，其中，组织蛋白酶B (CTSB)在脊椎动物中研究较多，它参与多种生理功能，如食物消化、免疫和蜕皮等过程(Wang et al, 2008; Stephen et al, 2012)。几丁质酶又被称为壳多糖，是甲壳动物在蜕皮过程中最重要的酶之一。吕黎等(2011)报道，几丁质酶在免疫方面起到一定作用。胰蛋白酶则具有消化食物和水解蛋白质的功能。本研究中，各亚硝酸盐浓度组胰蛋白酶基因和几丁质酶基因均显著降低，表明凡纳滨对虾的消化功能受到了抑制。虾类在遭受外界病原体或异物侵袭时，体内的能量代谢会发生变化。由于外界环境的恶化，体内稳态失衡，细胞产生应激反应，包括DNA和蛋白质损伤修复、细胞周期停滞或凋亡，并从细胞的生长状态转型至细胞的修复状态(Kultz, 2005)。这些过程会消耗大量能量，从而影响虾的生长。本研究中，各浓度组胰蛋白酶基因和几丁质酶基因表达量显著降低，可能与凡纳滨对虾体内大量能量参与免疫调控及维持渗透压平衡有关。李忠帅等(2021)研究发现，亚硝酸盐可在凡纳滨对虾体内迅速积累并加快其能量代谢，进一步说明亚硝酸盐抑制凡纳滨对虾生长的机制。郭慧等(2017)研究发现，亚硝酸盐可显著诱导ctsb基因的表达，之前郭慧等(2013)研究发现，CTSB可能参与细胞凋亡。本研究中，ctsb基因表达无明显规律，可能因为该基因功能较复杂，未来需要作进一步的研究。

在亚硝酸盐浓度分别为0.50、0.90、1.70、3.20和6.00 mg/L，盐度为5的水体中养殖40 d后，凡纳滨对虾各浓度组死亡率显著升高，生长性能和免疫功能受到阻遏，但在SOD活性方面表现出较强的适应性。各浓度组生长相关酶基因表达量显著降低，凡纳滨对虾消化功能受到抑制。此外，当亚硝酸盐浓度大于0.9 mg/L时，凡纳滨对虾肝胰腺功能可能受到明显影响。在盐度为5条件下，为保证凡纳滨对虾的健康养殖，亚硝酸盐浓度应控制在0.50 mg/L以下。