肌肉生长抑制素(myostatin, mstn)又称GDF-8，为转录生长因子(TGF-β)超家族的成员之一(徐建勇等, 2008)。近年来，关于mstn的研究主要集中于基因克隆(钟其旺, 2007)、表达模式分析及RNA干扰(闫允君等, 2021)等方面。在具有性别二态性鱼类中，有关mstn基因在雌、雄鱼中生长差异表达分析的研究鲜有报道。mstn基因是肌肉生长发育的负调控因子，对成肌细胞的增殖有抑制能力，该基因的缺失可导致骨骼肌质量的增加(Thomas et al, 2000)。在小鼠(Mus musculus)中敲除mstn可使骨骼肌增加2~3倍(Grobet et al, 2003; McPherron et al, 1997)。斑马鱼(Brachydanio rerio)中沉默mstn基因可以导致肌纤维数量、体积增加(Acosta et al, 2005; Amali et al, 2004)；mstn基因敲除的牙鲆(Paralichthys olivaceus)表现为体厚增加和肌纤维数量增加(Kim et al, 2019)。

脊椎动物的肌肉生长分为限定性生长与非限定性生长。在哺乳动物和鸟类中，肌纤维的数量在出生前是固定的，出生后，肌肉生长主要取决于已有肌纤维体积的增大，为典型的限定性生长(Choi et al, 2014)。鱼类兼有肌纤维增生生长和肥大生长。肌纤维增生生长及肥大生长对于鱼类生长的贡献取决于鱼的种类和体型(De Almeida et al, 2008)。小型(生长缓慢型)鱼类，如斑马鱼，主要依赖已有肌纤维体积的增大而不是新的肌纤维生成，而大型(生长迅速型)物种，如牙鲆，既依赖于肌纤维增生生长，也依赖于纤维肥大生长(Lee et al, 2019)。

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为高蛋白质、低脂肪、富含维生素的鱼类，深受消费者喜爱，是我国重要的海水养殖对象。半滑舌鳎的生长过程具有明显的性别二态性，1龄雌鱼的体重及生长速度是雄鱼的2~4倍(Chen et al, 2014)。雌鱼为什么比雄鱼生长快？mstn基因在雌、雄鱼生长差异中是否发挥作用？查明这些问题对于半滑舌鳎遗传改良和养殖业发展具有重要意义。尽管半滑舌鳎mstn基因的克隆已经有过报道(钟其旺, 2007)，但有关半滑舌鳎mstn基因在雌鱼和雄鱼中的表达差异及其与鱼体生长关系的研究尚未见报道。

为探究mstn基因与半滑舌鳎生长发育的关系，阐明半滑舌鳎雌、雄鱼生长差异的分子机制，本研究选取半滑舌鳎的肝、脾、肠、肾、性腺、鳃、心脏、脑和肌肉9个组织以及不同发育时期的肌肉组织，采用qPCR方法、组织切片染色以及原位杂交方法，对半滑舌鳎雌鱼和雄鱼中mstn的表达模式及表达差异进行系统分析。

本研究所用半滑舌鳎取自山东省海阳市黄海水产研究所实验基地。随机选取1龄半滑舌鳎雌、雄鱼各6尾，取肝、脾、肠、肾、性腺、鳃、心脏、脑和肌肉各组织，迅速保存于液氮中备用。不同生长时期的雌、雄鱼各6尾，40 d [雄鱼体重为(0.35±0.08) g，雌鱼体重为(0.34±0.09) g]、60 d [雄鱼体重为(0.74±0.18) g，雌鱼体重为(0.69±0.17) g]、120 d [雄鱼体重为(2.76±0.64) g，雌鱼体重为(2.55±0.76 g)]、180 d [雄鱼体重为(17.40±7.30) g，雌鱼体重为(22.40±8.30) g]、1 y [雄鱼体重为(82.10±15.20) g，雌鱼体重为(376.70±39.30) g]、2 y [雄鱼体重为(207.62± 33.65) g，雌鱼体重为(1 805.00±275.30) g]。取全长中央背部肌肉组织，分别于液氮中速冻保存和4%多聚甲醛(PFA)固定保存。取鳍条保存于无水乙醇中。

根据mstn mRNA序列及半滑舌鳎基因组数据(GCA_000525025.1)设计引物，以β-actin作为qPCR的内参基因，引物序列见表 1，引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。

表 1(Tab.1)

表 1 引物序列 Tab.1 The sequence of primers 引物Primer 序列Sequence (5ʹ~3ʹ) scaffold68-2-F CCTAAATGATGGATGTAGATTCTGTC scaffold68-2-R GATCCAGAGAAAATAAACCCAGG mstn-F ATGCAGCCGTCTCCTGTCCCG mstn-R TCAGGAGCAGCCGCAGCGGTC mstn-QF CTCCGCTCCCTTTATGGTT mstn-QR GGATTAATGTCGCGCTCTCAC mstn-ISHF CAACGCCATCAAATCCCA mstn-ISHR TGCTCCTGGTGGTTGAAGTAG β-actin-F TTCCAGCCTTCCTTCCTT β-actin-R TACCTCCAGACAGCACAG

表 1 引物序列 Tab.1 The sequence of primers

基因组DNA的提取按照TIANamp marine animals DNA kit试剂盒(TIANGEN)说明书进行，利用超微量核酸检测仪和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量。采用刘洋等(2014)开发的共显性性别特异标记引物scaffold68-2-F/R进行PCR后电泳检测，用于半滑舌鳎遗传性别鉴定。

按照TRIzol(Invitrogen)法提取各样本总RNA，采用0.8%琼脂糖凝胶电泳和超微量核酸检测仪测定RNA的质量和浓度。cDNA第一链的合成按照PrimeScript™ RT reagent kit with gDNA easer (Perfect Real Time)(TaKaRa)说明书进行。

以1.4制备的肌肉组织cDNA为模板、mstn-F/R为引物，进行PCR扩增。PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，34个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。PCR产物经切胶回收纯化后连接pEASY-T1载体(全式金生物)并转化至大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞DH5α。筛选阳性克隆送至北京擎科生物技术有限公司测序，将测序结果与基因组数据进行比对分析。

实时荧光定量PCR (qRT-PCR)在7500 Fast Real-time PCR仪上进行。qPCR体系参照TB Green^® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa)说明书，扩增程序：95℃预变性5 min；95℃变性5 s，60℃退火34 s，共40个循环；之后产物进行熔解曲线分析。

半滑舌鳎肌肉组织4%多聚甲醛(PFA)固定不少于24 h后，用75%乙醇脱水(Zhang et al, 2014)，送武汉塞维尔生物科技有限公司进行切片制备。设计探针合成引物，SP6和T7启动子序列分别加在正向引物和反向引物的5ʹ端。以肌肉组织cDNA为模板，mstn-ISHF/R为引物进行PCR扩增。随后对PCR产物进行胶回收、连接、转化及测序。以测序正确的PCR纯化产物为模板，参照罗氏体外转录试剂盒(Roche Diagnostics GmbH, 德国)操作说明书进行地高辛标记探针合成，并使用试剂盒(Sigma)进行纯化，纯化产物检测浓度后于–80℃保存。原位杂交具体步骤参考Xu等(2016)的方法。

采用2^–ΔΔCt计算基因相对表达量，其数值采用平均值±标准差(Mean±SD)表示。使用SPSS软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)和t检验进行差异显著检验，显著水平为P < 0.05，使用Prism软件作图。

1龄半滑舌鳎9个组织中mstn的qPCR结果显示，mstn基因在肌肉中的表达量最高。mstn在雄鱼肌肉中的表达量最高，其次是精巢和脑；雌鱼中，在肌肉和脑中的表达量显著高于其他组织。性别差异表达分析结果显示，mstn表达量在脾、肠、肾、性腺、脑和肌肉组织均存在显著差异(P < 0.05)，而在肝脏、鳃和心脏组织中的表达量不存在显著差异(图 1)。

图 1(Fig. 1)

图 1 半滑舌鳎mstn基因各组织性别差异表达 Fig.1 Relative expression level of mstn gene in tissues of different gender of Chinese tongue sole *表示存在显著差异(P < 0.05)，下同。 Asterisks indicate significant differences (P < 0.05). The same as below.

在雌、雄鱼不同生长发育时期，mstn基因在肌肉中的表达模式如图 2所示。结果显示，1 y和2 y雌、雄鱼之间存在差异表达(P < 0.05)，雄鱼肌肉中的表达水平明显高于雌鱼肌肉，而在40、60、120和180 d雌、雄鱼之间的表达水平不存在显著差异(P > 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 2 半滑舌鳎mstn基因不同发育时期肌肉性别差异表达 Fig.2 Relative expression level of mstn gene in muscle of Chinese tongue sole at different development stages

4个时间点(40、60、120和180 d)的肌肉组织切片制备及观察结果如图 3所示，肌纤维的横截面呈现不规则的多角状或圆形，细胞核位于周边。肌纤维聚集成束，其周围包有结缔组织。

图 1(Fig. 1)

图 3 不同发育时期的半滑舌鳎肌纤维横切面 Fig.3 Cross section diagram of muscle fibers of Chinese tongue sole at different developmental stages a：40 d雄鱼；b：40 d雌鱼；c：60 d雄鱼；d：60 d雌鱼；e：120 d雄鱼；f：120 d雌鱼；g：180 d雄鱼；h：180 d雌鱼 a: Male fish at 40 d; b: Female fish at 40 d; c: Male fish at 60 d; d: Female fish at 60 d; e: Male fish at 120 d; f: Female fish at 120 d; g: Male fish at 180 d; h: Female fish at 180 d

利用合成的RNA探针对60 d、120 d、180 d和1 y半滑舌鳎雌、雄鱼肌肉切片进行原位杂交，结果如图 4显示，反义探针在肌肉组织中存在杂交信号，mstn的表达位置在成肌细胞的边缘，位于肌纤维之间，即成肌细胞增殖、分化的位置；正义探针无杂交信号。

图 1(Fig. 1)

图 4 mstn基因原位杂交结果 Fig.4 In situ hybridization of mstn in different days a：60 d雄鱼；b：60 d雌鱼；c：120 d雄鱼；d：120 d雌鱼；e：180 d雄鱼；f：180 d雌鱼；g：1 y雄鱼；h：1 y雌鱼 每个分图均由2张反义探针杂交图片和1张正义探针杂交图片组成，中间反义探针杂交结果为左侧的放大框区域。 a: 60 d male; b: 60 d female; c: 120 d male; d: 120 d female; e: 180 d male; f: 180 d female; g: 1 y male; h: 1 y female. Each subplot composed of two antisense probe hybridization results and one justice probe hybridization results. The middle antisense probe hybridization result was the zoom box area on the left.

多种鱼类mstn基因已被克隆，其表达几乎在所有组织中被检测到。本研究在半滑舌鳎的9个组织中均检测到mstn基因的表达，其在肌肉组织的表达量高于其他组织，雄鱼肌肉组织中的表达量高于雌鱼且存在显著差异。半滑舌鳎雌、雄鱼各组织的mstn基因表达模式不同，雄鱼肌肉组织的表达量最高，其次是精巢和脑组织；而雌鱼肌肉和脑组织的表达量高于其他组织。在大刺鳅(Mastacembelus armatus)的成鱼中，mstn在肌肉中表达量最高，其次为眼、脑、性腺和心脏，鳃中表达量最低(钟东明等, 2020)。mstn在团头鲂(Megalobrama amblycephala)成鱼中，肌肉、脑和精巢中存在大量表达，肝胰脏、脾脏和卵巢中少量表达(杜尚可等, 2017)。在淇河鲫(Carassius auratus)的脑组织的表达量最高，其次为肌肉、肝脏、鳃和肾脏，肠中的表达量最低(田雪等, 2017)。mstn在刀鲚(Coilia nasus)肌肉和脑中呈高表达，鳃、肝、脾、肠、肾和头肾中则微量表达(杜富宽等, 2014)，与本研究结果相似，mstn在肌肉、脑中表达水平较高。此外，在多种鱼类中发现了mstn基因的亚型，虹鳟(Oncorhynchus mykiss)中2种基因型序列表现为较高的相似性，可达到94% (Ostbye et al, 2001)。斑马鱼中存在mstn-1和mstn-2两个亚型，基因序列比对分析发现，2个基因存在差异(Kerr et al, 2005)。mstn在鱼类不同组织的广泛分布及亚型的存在表明，mstn不仅参与肌肉的生长发育调控，还可能与神经系统及免疫系统的发育相关。

mstn基因作为肌肉生长发育调控的负调控因子，在鱼类组织的细胞定位主要在胚胎中(濮剑威, 2011)，本研究通过对60 d、120 d、180 d和1 y肌肉组织切片原位杂交实验证实，半滑舌鳎mstn基因的表达位置主要位于肌纤维的边缘，即成肌细胞增殖分化的位置。在许氏平鲉(Sebastes schlegelii)中，作为肌肉生长发育的主要正调控基因，myod1s的表达位置在肌纤维的边缘，位于肌纤维之间。除此之外，还发现100 d肌肉组织中的表达myod1s基因的细胞数目显著高于180 d，表明在孵化后100 d肌肉组织具有更高的增殖分化能力(孔祥福等, 2021)。

鱼类的性别二态性在自然界中普遍存在，既有雌鱼生长速度显著高于雄鱼的半滑舌鳎(季相山, 2009)；也存在雄鱼明显比雌鱼生长快的现象，例如兰州鲇(Silurus lanzhouensis)(俞兆曦, 2016)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)(朱媛媛, 2012)等。兰州鲇mstn基因在肌肉组织中的表达量最高，雄鱼低于雌鱼，但雌雄个体间差异不显著。生肌决定因子(myogenic determination gene, myod)与myogenin (myog)是肌肉生长发育的主要正调控基因，在肌肉形成过程中起着决定性作用，在兰州鲇肌肉组织中的相对表达量雄鱼高于雌鱼，且雌雄个体间差异显著(俞兆曦, 2016)。

在对半滑舌鳎雌、雄鱼肌肉发育的不同时期mstn表达量的研究表明，雌、雄鱼在1龄和2龄时期雌、雄鱼之间存在差异表达，其他发育时期表达量无显著差异。半滑舌鳎雌、雄鱼体重生长变化研究结果显示，半滑舌鳎在50日龄~5月龄时期，雌、雄鱼之间体重无显著差异；7月龄时，雌鱼生长速度显著快于雄鱼，雌、雄鱼之间体重开始出现差异；12月龄时，雌、雄鱼体重差异最显著；18月龄时，雌鱼平均体重则是雄鱼的4.9倍(季相山, 2009)。对半滑舌鳎体长生长变化的研究表明，6月龄时，雌、雄鱼体长已经出现差异，8月龄时二者之间差异达到显著性水平(李虎等, 2012)。综上所述，半滑舌鳎mstn基因表达量与雌、雄鱼之间的生长差异存在一定的关系，其在雌、雄鱼肌肉组织中的差异表达可能是造成半滑舌鳎雌、雄鱼生长差异的重要因素之一。12月龄雌鱼生长明显快于雄鱼可能与雌鱼mstn表达水平明显低于雄鱼有关。

本研究采用qPCR方法、组织切片染色以及原位杂交方法，探究半滑舌鳎肌肉生长发育的负调控因子mstn与肌肉生长发育的关联。结果显示，mstn主要在雌、雄鱼肌肉、脑和性腺组织中表达；1龄和2龄时期，雄鱼肌肉组织中mstn表达量高于雌鱼且存在显著差异。原位杂交结果显示，mstn表达位置在成肌细胞边缘，即成肌细胞增殖分化的位置。该研究结果为进一步阐明半滑舌鳎雌雄生长差异提供了思路与基础。