人类CO₂排放引起的全球变暖已经危及到人类社会的可持续发展。为了应对全球变暖，联合国大会早在1992年制定了《联合国气候变化框架公约》，把控制CO₂等温室气体排放、应对全球气候变暖给人类经济和社会带来不利影响纳入国际法框架(焦念志, 2012)。中国作为负责任大国，2020年9月在第75届联合国大会上提出了2030年实现碳达峰和2060年实现碳中和的承诺(焦念志, 2021)。但仅靠控制CO₂排放实现碳中和有局限性，在减排的同时进行增汇才是最有效的方式(张继红等, 2021)。海洋作为全球最大的碳库，在调节全球气候变化过程中起到了极为重要的作用，增汇潜力巨大(Khatiwala et al, 2009)。在“十三五”时期，我国已将“建立增加海洋碳汇的有效机制”与“探索开展海洋等生态系统碳汇试点”列入《生态文明体制改革总体方案》(张永雨等, 2017)。

为实现海洋增汇，科学家提出了“蓝碳”策略：通过恢复与保护红树林、盐沼湿地、海草床等三类近海生态系统，以加强有机碳埋藏，进而减缓气候变暖(McLeod et al, 2011)。而大型海藻因大多生长在岩基环境，碳埋藏过程受阻，被排除在“蓝碳”系统之外。但大型海藻同样具有强烈的碳汇过程(Duarte et al, 2013; Ross et al, 2015)。海藻能将大量的光合作用产物以溶解有机碳(dissolved organic carbon, DOC)的形态释放到环境中，释放的DOC经微型生物碳泵(microbial carbon pump, MCP)的作用可转化为惰性溶解有机碳(recalcitrant dissolved organic carbon, RDOC) (Jiao et al, 2010)。由于RDOC化学性质稳定，可实现碳千年尺度上的封存，进而有效缓解全球变暖(Ogawa et al, 2001)。养殖活动人为可控性强，若能通过海藻养殖增汇，无疑可以实现经济效益与生态效益的双赢(唐启升等, 2016)。初步估算，我国养殖海藻每年DOC释放量达82.2×10⁴~91.5×10⁴ t C/a，养殖海藻释放的DOC经过MCP作用每年可生成60万t以上的RDOC，约为我国海岸带“蓝碳”储碳量的1.7倍，碳汇潜力巨大(Abdullah et al, 2004; Krause-Jensen et al, 2016)。

光照强度与营养盐是藻类生长的重要环境因素，其不仅影响藻类的初级生产力，还调控藻类的DOC释放过程(韩婷婷等, 2014; 袁艳敏等, 2020)。Wada等(2007)通过现场实验发现，日本欧拉湾的褐藻(Ecklonia cava)初级生产力与DOC释放均与光照强度正相关。Reed等(2015)对美国莫霍克礁巨藻(Macrocystis pyrifera)藻床的研究也发现了同一现象，尽管巨藻释放DOC季节规律不明显，但与海面光照显著正相关。但也有研究持相反观点，如Maranon等(2005)在研究凯尔特海域的浮游藻类时发现，藻类释放DOC与光照强度的变化没有相关性。Mueller等(2016)通过实验发现，氮磷加富后，黑暗条件与光照条件下珊瑚藻释放DOC的速率差异不显著。为此，藻类释放DOC的环境调控目前形成了两个截然相反的假说：“溢出”假说与“扩散”假说。“溢出”假说认为，藻类释放DOC与光照强度正相关，其成分以高分子量物质为主；“扩散”机制假说则认为，藻类释放DOC受控于营养盐，且以小分子量物质为主(Bjornsen, 1988; Maranon et al, 2005)。海带是我国最主要的大型养殖藻类，其年产量约为我国海藻养殖产量的63.98%，增汇潜力巨大(于秀娟等, 2020)。而光照和营养盐对海带释放DOC速率还没有相关文献的报道。基于此，本研究探究光照强度与营养盐对海带幼苗释放DOC的影响，以期为探明海带释放DOC的环境调控机制提供参考，为海带养殖增汇提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验海带幼苗于2020年12月取自山东省荣成市东楮岛海带养殖区。所取海带幼苗平均体长为(34.26±8.99) cm，湿重为(5.25±1.86) g。海带幼苗取样后黑暗冷藏保存，4 h内运至实验室，在循环水养殖系统中暂养5 d后用于实验，暂养水温为(13.5±0.5)℃，光照强度为(63±9) μmol photons/(m²·s)。

1.2 实验方法 1.2.1 光照强度对海带幼苗释放DOC的影响

实验期间为海带幼苗海上夹苗期，此时水下0~1 m处的光强为50~300 μmol photons/(m²·s) (王月, 2016)。为模拟海上条件，设置0、83、165和250 μmol photons/(m²·s)共4个光照强度，每个光照强度设置6个平行，每个平行样本在2 L酸洗玻璃瓶中放入未受损伤的单株海带幼苗，通过光照培养箱进行不同光强培养，培养时间为6~8 h。同时，每个光照处理组设置3个未放置海带幼苗的平行样，作为空白对照。培养水温为(14.0±0.5)℃，海水为自然海水。在培养前、后抽取100 mL水样2份，其中，1份用于DOC含量和吸收光谱测定，水样–20℃黑暗冷冻保存，直至分析；另1份用于溶解氧(DO)测定，水样经KI固定，并在12 h内经碘量法滴定完毕，具体操作见GB/T 12763.4-2007。

1.2.2 营养盐对海带幼苗释放DOC的影响

设置氮加富、磷加富、氮磷加富和自然海水4个实验组。自然海水磷酸盐、无机氮浓度分别为3.5、97 μg/L，略低于同期桑沟湾营养盐水平，呈营养限制状态 (李凤雪等, 2020)。使用K₂HPO₄、KNO₃分析纯试剂分别配制成100、1000 μg/L标准液用于加富，使各加富组目标营养盐提升10倍，使海水中营养盐的浓度达到藻类生长率饱和浓度(Wyatt et al, 2014)。加富后各组氮、磷营养盐摩尔比如表1所示。实验过程光照强度为250 μmol photons/(m²·s)。培养水温为(14.0± 0.5)℃。其余处理同1.2.1。

1.3 分析方法 1.3.1 释放DOC速率测定

使用岛津TOC-L_CPH总有机碳分析仪测定样品的DOC含量。DOC释放速率[R_DOC, μmol/(g·h)]指单位质量(干重)海带幼苗在单位时间内引起的水体DOC含量的变化，其计算公式为：

$ {R_{{\text{DOC}}}} = \frac{{({C_t} - {C_0}) \times V \times 1000}}{{{W_D} \times {M_C} \times t}} $

(1)

式中，C_t为实验结束时海带幼苗的DOC浓度(mg/L)；C₀为空白对照瓶中DOC的浓度(mg/L)；V为养殖用海水体积(L)；W_D为实验海带幼苗的干质量(kg)；t为实验处理时间(h)，M_C为碳的相对分子质量。

1.3.2 释放DOC占净初级生产力(net primary productivity, NPP)比重

海带幼苗氧气释放速率[$\Delta {C_{{{\text{O}}_{\text{2}}}}}$, μmol/(g·h)]是单位质量(干重)海带幼苗在单位时间内引起的水体DO含量的变化，其计算公式为：

$ \Delta {C_{{{\text{O}}_{\text{2}}}}} = \frac{{c{{({\text{O}})}_t} - c{{({\text{O}})}_0}}}{{{W_D} \times h \times 2}} $

(2)

式中，$ c{({\text{O}})_t} $为实验结束时的氧气浓度[μmol/(g·h)]；$c{({\text{O}})_0}$为实验开始时的氧气浓度[μmol/(g·h)]；V为养殖用海水体积(L)；W_D为实验海带幼苗的干质量(kg)；t为实验处理时间(h)。

释放DOC占NPP比重(P, %)，是在假设碳固定与净产氧的摩尔比平衡(即1 mol C固定等于1 mol O₂释放)的条件下，相同时间内海带幼苗释放DOC占净初级生产力比例，其计算公式为：

$ P = \frac{{\Delta {C_{{\text{DOC}}}}}}{{\Delta {C_{{{\text{O}}_{\text{2}}}}}}} $

(3)

式中，∆C_DOC为单位时间内的DOC浓度变化[μmol/(g·h)]；$\Delta {C_{{{\text{O}}_{\text{2}}}}}$为单位时间内O₂浓度变化[μmol/(g·h)]。

1.3.3 释放DOC光谱斜率

使用UV-5100B紫外可见分光光度计测定过滤水样的紫外可见吸收光谱。以超纯水为空白对照，使用10 mm石英比色皿在200~700 nm范围内扫描，扫描间隔为1 nm。波长λ的吸收系数[a(λ)，m^–1]公式为：

$ {\text{a}}(\lambda ) = \frac{{2.303 \times A(\lambda )}}{{\text{b}}} $

(4)

式中，A(λ)为吸光度，b为光程路径(m)。

S_275~295反映DOC相对分子质量与光反应活性，值越小，相对分子质量越大(Wada et al, 2007)，光谱斜率S的计算公式为：

$ {\text{a}}(\lambda ) = {\text{a}}({\lambda _0}) \times {\text{exp}}[S \times ({\lambda _0} - \lambda )] $

(5)

式中，a(λ)为DOM吸收系数(m^–1)；λ为波长(nm)；λ₀为参照波长(nm)。

1.4 数据分析

采用Excel 2003软件对实验数据进行整理，采用SPSS 26.0进行单因素方差分析(其中，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著)，用LSD法进行多重比较，使用Origin 2021绘图。

2 结果 2.1 不同光照条件下海带幼苗的处理结果 2.1.1 不同光照强度下的DOC释放速率

研究结果显示，光照强度显著影响海带幼苗DOC的释放速率，DOC释放速率随光照强度增加呈上升趋势(图1)。黑暗条件下[0 μmol photons/(m²·s)]，海带幼苗的DOC释放速率最低，为(6.73±5.30) μmol/(g·h)。光照强度为250 μmol photons/(m²·s)时，海带幼苗的DOC释放速率最高，为(24.31±5.84) μmol/(g·h)，约为黑暗条件下的4倍左右。

2.1.2 不同光照处理强度下的海带幼苗释放氧气产量

研究结果显示，光照强度显著影响了海带幼苗的氧气释放速率，氧气释放速率随光照强度增加而呈现上升的趋势(图2)。在黑暗条件下，海带幼苗氧气净释放速率最低，为(66.70±12.23) μmol/(g·h)。在光照强度为250 μmol photons/(m²·s)条件下，海带幼苗氧气净释放速率最高，为(161.08±10.00) μmol/(g·h)。

2.1.3 不同光照强度下的海带幼苗释放DOC占NPP比重

研究结果显示，光照强度显著影响了海带幼苗释放DOC占NPP比重，DOC释放量占净产氧比例呈现先上升后下降的趋势(图3)。在黑暗条件下，释放DOC占NPP比例最低，为(10.31±1.81)%。在光照强度为165 μmol photons/(m²·s)时，占比例最高，达(20.06±5.70)%。

2.1.4 不同光照处理强度下的海带释放DOC的光谱斜率

光照强度显著影响了海带幼苗释放DOC的光谱斜率，S_275~295均值随光照强度上升呈下降趋势，表明释放DOC的分子量随光照强度增加而呈现增大的趋势(表2)。0、83 μmol photons/(m²·s)光照条件下S_275~295均值组间差异不显著。

2.2 不同营养盐处理下海带的处理结果 2.2.1 不同营养盐处理下的DOC释放速率

相较于自然海水，单一氮加富或磷加富没有显著提升DOC释放速率，氮磷共同加富则显著提升了DOC释放速率(图4)。自然海水组的海带幼苗的DOC释放速率最低，为(12.34±2.30) μmol/(g·h)；氮磷加富组，海带幼苗的DOC释放速率最高，为(37.15±6.77) μmol/(g·h)，约为自然海水组的4倍。

2.2.2 不同营养盐处理下的海带幼苗释放氧气产量

营养盐加富显著降低了海带氧气释放速率，氮加富、磷加富及氮磷共同加富条件下海带氧气释放速率均低于自然海水(图5)。氮加富、磷加富及氮磷共同加富条件下海带氧气释放速率组间差异不显著，分别较自然海水组下降了38.63%、43.85%和37.76%。

2.2.3 不同营养盐处理下的海带幼苗释放DOC占NPP比重

营养盐显著影响了海带幼苗释放DOC占NPP比重(图6)。在磷加富组中，所占比例最高，达(25.55±6.25)%；在自然海水中，所占比例最低，为(7.85±1.49)%。方差分析表明，单一营养盐加富的实验组显著高于氮磷加富组或自然海水组(P<0.05)。

2.2.4 不同营养盐处理下的海带幼苗释放DOC的光谱斜率

营养盐显著影响了海带幼苗释放DOC的光谱斜率，S_275~295均值随着营养盐加富而呈现增大的趋势，表明释放DOC的分子量随营养盐加富而呈现减小的趋势(表3)。氮加富、磷加富条件下，S_275~295均值组间差异不显著(P>0.05)。

3 讨论

本研究发现，在自然海水条件下，海带幼苗释放DOC的速率与光照强度正相关。在光照强度为250 μmol photons/(m²·s)条件下，海带幼苗的DOC释放速率最高，约为黑暗条件的4倍左右(图2)。通过吸收光谱发现，250 μmol photons/(m²·s)条件下，S_275~295显著低于黑暗条件，表明光照促进了溶解态大分子物质的释放(表2)。以上结果表明，在寡营养条件下，海带幼苗释放DOC受“溢出”机制调控。

通过营养加富实验发现，海带幼苗释放DOC受营养盐调控，氮磷加富条件下海带幼苗释放速率约为自然海水条件下的4倍(图4)。通过吸收光谱研究发现，在氮磷加富条件下，S_275~295显著高于自然海水条件，表明营养盐加富促进了溶解态小分子物质的释放(表3)。以上结果表明，在营养加富条件下，海带幼苗释放DOC受“扩散”机制调控。

本研究发现，海带幼苗释放DOC同时存在“溢出”与“扩散”2种调控机制。何种机制占主导取决于营养条件。在自然海水的寡营养条件下，表现为“溢出”机制占主导；在氮磷营养盐充足条件下，表现为“扩散”机制占主导。浮游藻类、羽毛藻(Caulerpa sertularoides f. Longipes)、底栖珊瑚藻(Coralline algae)以及大型海藻释放DOC大多是在海水中营养盐较为贫瘠的条件下发生的，受“溢出”机制调控(Haas et al, 2010; Naumann et al, 2010; Barrón et al, 2014; Cherrier et al, 2015)。而在营养盐较为充足的条件下，藻类释放DOC的速率与光照强度无相关性，表明“溢出”调控机制失效(Marañón et al, 2005; Mueller et al, 2016; Wyatt et al, 2014)。Mueller等(2016)通过光照与营养盐交叉实验发现，在寡营养盐条件下，珊瑚藻释放DOC的速率与光照强度正相关。但添加氮磷营养盐后，在不同光强下藻类释放DOC的速率差异不显著，表明养分的添加导致DOC释放速率与光强的正相关性消失，营养限制决定了“溢出”机制何时起作用。原因可能是藻类光合作用受光照调节，而细胞的生长则受无机营养盐限制。在氮磷营养盐限制条件下，随着光照强度升高，细胞光合作用产出将超过细胞生长对有机质的需求(Fogg, 2009)。此时，细胞光合固定有机碳的速率将超过氮磷供给速率，从而导致细胞内碳元素大量富集，细胞内C∶N∶P比上升，生成的有机质主要以高分子量物质为主。此时表现为光强的增加促进有机质生成，从而加剧DOM的释放，“溢出”机制占主导(Mueller et al, 2016)。当环境中氮磷营养盐富集时，细胞内C∶N∶P比下降，因此，生成的有机质主要以低分子量物质为主。低分子量的DOM跨膜运输受细胞膜内外浓度差控制，表现为“扩散”机制占主导(Wyatt et al, 2014)。

海带幼苗光饱和点大约为100 μmol photons/(m²·s) (梁洲瑞等, 2020)。当光照达到或超过光饱和点时，藻类光合作用速率基本已无变化，DOC释放速率也应无变化。本研究设置的165、250 μmol photons/(m²·s)光照均已超过光饱和点，但仍表现出DOC释放速率随光照上升而上升。Reed等(2015)通过现场实验也发现类似现象，即使现场光照远远超过藻类光饱和点，藻类释放DOC速率仍然与光强正相关。具体是何原因导致这一现象的发生，尚需进一步研究。

大型藻释放的DOC中既有易于生物降解的活性溶解有机碳(labile dissolved organic carbon, LDOC)成分，如类蛋白质物质；又有难于降解的RDOC成分，如类腐殖质物质与芳香族类物质(Wada et al, 2007; Zhang et al, 2017; Chen et al, 2020)。RDOC的存在使大型藻类释放DOC的降解周期远超过浮游植物释放DOC的降解周期。如Wada等(2008)研究发现，褐藻苷苔释放DOC的降解周期为24~172 d，Watanabe等(2020)发现，马尾藻释放DOC的降解周期为111~238 d，均远超过浮游植物释放DOC的降解周期(2.8~40 d)。光照与营养条件的改变，均显著改变了其释放DOC相对分子量大小(表2和表3)，表明其释放DOC的组成成分均发生了改变，其生物可利用性也发生了改变。Wyatt等(2014)也发现，氮磷营养盐加富后，底栖藻类释放DOC的生物可利用性更高。在未来研究中，尚需进一步探明光照与营养盐对海带释放DOC成分的影响，与异养细菌存在怎样的互作过程，何种养殖操作方式更有利于海带DOC的释放与RDOC的积累，才能将海带养殖增汇推入实际应用阶段。