渔业科学进展  2022, Vol. 43 Issue (6): 207-215  DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20210621001
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引用本文 

乔玲, 任成喆, 李健, 李铁军, 孙秀梅. 凡纳滨对虾工厂化养殖水体中微小辐环藻HY01的分离鉴定及对不同氮源的响应[J]. 渔业科学进展, 2022, 43(6): 207-215. DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20210621001.
QIAO Ling, REN Chengzhe, LI Jian, LI Tiejun, SUN Xiumei. Isolation, Identification and Response of Actinocyclus exiguous HY01 to Different Nitrogen Sources from the Indoor Industrial Aquaculture System for Litopenaeus vannamei[J]. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(6): 207-215. DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20210621001.

基金项目

国家重点研发计划课题(2019YFD0900403)、浙江省海洋水产研究所博士启动基金项目(2020B01)和浙江海洋大学博士启动基金项目(11034150220004)共同资助

作者简介

乔玲，E-mail: qiaoling1990123@126.com

通讯作者

李健，研究员，E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

文章历史

收稿日期：2021-06-21
收修改稿日期：2021-07-18
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
凡纳滨对虾工厂化养殖水体中微小辐环藻HY01的分离鉴定及对不同氮源的响应
乔玲 1, 任成喆 2, 李健 3, 李铁军 1, 孙秀梅 1     
1. 浙江省海洋水产研究所 浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室 浙江 舟山 316021;
2. 浙江海洋大学海洋科学与技术学院 浙江 舟山 316022;
3. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室 山东 青岛 266071
收稿日期：2021-06-21；收修改稿日期：2021-07-18
基金项目：国家重点研发计划课题(2019YFD0900403)、浙江省海洋水产研究所博士启动基金项目(2020B01)和浙江海洋大学博士启动基金项目(11034150220004)共同资助
作者简介：乔玲，E-mail: qiaoling1990123@126.com.
通讯作者：李健，研究员，E-mail: lijian@ysfri.ac.cn.
摘要：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)工厂化养殖池中，一株硅藻在养殖中后期长期占优势，因其个体较小且细胞外壳覆盖一层硅质膜，难以用光学显微镜直接准确鉴定其分类地位。通过对该藻株进行分离纯化，利用光学显微镜和电子显微镜，结合分子生物学技术，鉴定该分离藻株为微小辐环藻HY01 (Actinocyclus exiguous HY01)。藻细胞直径约为(11.4±1.0) μm，壳面上有很多小孔，光学显微镜下不可见，且壳中央的孔密度较壳边缘稀疏，壳边缘具有眼斑结构，有3~5个唇形突。以不同浓度氨氮和硝态氮为氮源培养微小辐环藻HY01，结果显示，微小辐环藻HY01均能利用氨氮和硝态氮进行生长，最适宜生长的氨氮和硝态氮浓度分别为600和882 μmol/L，但以氨氮为氮源时微小辐环藻HY01的最大细胞密度、最高比生长速率以及蛋白含量均低于以硝态氮为氮源，表明微小辐环藻HY01可能更喜欢利用硝态氮，但对较高浓度的氨氮有一定的耐受性。
关键词：微小辐环藻    鉴定    氨氮    硝态氮    生长特性    
Isolation, Identification and Response of Actinocyclus exiguous HY01 to Different Nitrogen Sources from the Indoor Industrial Aquaculture System for Litopenaeus vannamei
QIAO Ling 1, REN Chengzhe 2, LI Jian 3, LI Tiejun 1, SUN Xiumei 1     
1. Key Laboratory of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang Province, Zhejiang Marine Fisheries Research Institute, Zhoushan, Zhejiang 316021, China;
2. Marine Science and Technology College, Zhejiang Ocean University, Zhoushan, Zhejiang 316022, China;
3. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao, Shandong 266071, China
Corresponding author: LI Jian, E-mail: lijian@ysfri.ac.cn.
Fund: This work was supported by National Key Research and Development Program of China (2019YFD0900403), Start-up Foundation for Docotors of Zhejiang Marine Fisheries Research Institute (2020B01), and Start-up Foundation for Docotors of Zhejiang Ocean University (11034150220004)
Abstract: Shrimp production has expanded rapidly over the last few decades in China. With the increasing production, water pollution has become increasingly serious. An increase in nutrients in water results in eutrophication, characterized by low oxygen, high ammonia, high phosphorus, and high frequency of algal blooms, which in turn influence shrimp growth and yield. Phytoplankton is an important component of aquaculture ecosystems. It is a direct or indirect food source for cultured organisms, and can remove nitrogen and phosphorus and maintain water quality. Constructing a benign phytoplankton community can improve the nitrogen pollutant absorption efficiency, improve the environment, and reduce the environmental pollution caused by cultivation. Certain phytoplankton groups, such as diatoms and green algae, are desirable for their high nutritional value and contribution to water quality. The use of phytoplankton to purify and regulate aquaculture water quality could reduce the negative impacts of aquaculture, which is an environmental protection option with a low cost, low energy consumption, high benefit, and considerable development potential. Microalgal growth is significantly affected by factors such as temperature, light, and nutrient conditions. Therefore, the environmental adaptability of microalgae is the primary consideration for selecting and cultivating algal species. In situ isolation and screening of algal species can reduce the stress response of microalgae, which is conducive to their normal ecological function of regulating water quality. In an indoor industrial aquaculture system for Litopenaeus vannamei, one diatom species was dominant for a significant amount of time in the middle and late stages of aquaculture in 2019. This alga was small and covered with a silica membrane layer, which was difficult to identify with a light microscope. The shrimps effectively grew in the ponds where this alga was the dominant species. To identify the algae and explore its application in water quality regulation in aquaculture, the algal strain was isolated and purified from the indoor industrial aquaculture system, and identified by optical microscopy, electron microscopy, and 18S rRNA sequence analysis. The results identified this algal strain as Actinocyclus exiguous HY01. The cell diameter was approximately (11.4±1.0) μm. At present, A. exiguous is the smallest individual species in the genus Actinocyclus. There are numerous small pores on the mantle that were not visible under a light microscope. The pore density at the mantle center was less than that at the mantle margin. There is a pseudonodulus at the valve margin, and 3~5 labiate processes. Nitrogen is an indispensable element for the growth and metabolism of phytoplankton, and is the main component of nucleic acids, proteins, and chlorophyll in cells. Ammonia and nitrate are the two main forms of inorganic nitrogen in aquaculture water, which can be directly absorbed and utilized by microalgae. The addition of nitrogen nutrients can promote microalgal growth. However, the microalgae cell density did not increase as the nitrogen concentration increased. Excessive ammonia content is inconducive to algae growth, and even affects the absorption and transformation of other nitrogen sources. In this study, ammonia and nitrate of different concentrations were used as nitrogen sources to culture A. exiguous HY01. The results showed that both ammonia and nitrate could be used for A. exiguous HY01 growth. The optimum growth concentration of ammonia was 600 μmol/L. Under these conditions, the cell density, specific growth rate, and protein content of A. exiguous HY01 were the highest, at 4.54×108 cells/L, 0.36±0.07, and 4.45 mg/g, respectively. When the ammonia concentration was 882 μmol/L, the cell density and specific growth rate of A. exiguous HY01 were the lowest, at 2.11×108 cells/L and 0.27±0.05, respectively. When the ammonia concentration was 50 μmol/L, the A. exiguous HY01 protein content was the lowest at 1.38 mg/g. The optimum growth concentration of nitrate was 882 μmol/L. Under these conditions, the cell density, specific growth rate, and protein content of A. exiguous HY01 were the highest, at 5.92×108 cells/L, 0.40±0.01, and 11.97 mg/g, respectively. When the nitrate concentration was 100 μmol/L, the cell density, specific growth rate, and protein content of A. exiguous HY01 were the lowest. In summary, the maximum cell density, maximum specific growth rate, and protein content of A. exiguous HY01 were lower in the medium containing ammonia-nitrogen than those in the medium with nitrate-nitrogen. We speculated that A. exiguous HY01 might prefer nitrate to ammonia, but has greater tolerance to high ammonia concentrations. This might be one reason why A. exiguous HY01 was dominant for a long time in the indoor industrial aquaculture system of L. vannamei in 2019. The results are expected to provide a reference for the targeted cultivation of this alga and its application in water quality regulation in aquaculture.
Key words: Actinocyclus exiguous    Identification    Ammonia    Nitrate    Growth characteristics    

在过去的几十年里，我国对虾养殖迅速发展，2019年，对虾总产量为145.02万t，占甲壳类总产量的83.16% (农业农村部渔业渔政管理局等, 2020)。凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是对虾主要养殖品种，2019年其产量占对虾总产量的78.91% (农业农村部渔业渔政管理局等, 2020)。研究发现，在高密度对虾养殖过程中，饵料中仅有20%~30%的氮、10%~20%的磷被对虾利用(臧维玲等, 2009; Chen et al, 2018)，随着养殖的进行，养殖水体中氮磷营养盐的增加，造成水体富营养化，促进藻类生长，甚至会引发有害藻华(常孟阳等, 2019)，水质恶化，最终会影响对虾的生长，引发病害(Tseng et al, 2004)。

浮游植物是养殖生态系统的重要组成部分，可以通过光合作用吸收利用环境中的氮、磷等营养盐，对养殖生态系统内物质循环和能量流动起重要作用。利用浮游植物净化和调控养殖水质不仅减轻了养殖引起的负面环境影响(黄翔鹄等, 2005; Ramli et al, 2017)，还为养殖生物提供直接或间接饵料(刘瑞卿等, 2021)，是一项成本低、能耗少、效益高、开发潜力大的环保工程。作为一种绿色、健康和低成本的养殖环境水质改良方法，微藻定向培育技术已在水产养殖业中得到广泛的关注和应用(黄翔鹄等, 2021)。黄翔鹄等(2005)研究了固定化微藻对改善凡纳滨对虾养殖水质和对虾抗病能力的影响，发现引入固定化波吉卵囊藻(Oocystis borgei)和微绿球藻(Nannochloris oculata)均能改善养殖水质，提高对虾抗病能力；波吉卵囊藻对氨氮的吸收能力较强，而微绿球藻对亚硝酸盐的吸收能力较强。Ramli等(2017)研究了固定化毛枝藻(Stigeoclonium nanum)对循环水养殖系统中氨氮和硝酸盐的去除能力，发现该藻对氨氮的去除能力强于对硝酸盐的去除能力。

用于调控养殖环境水质的微藻是否能适应本地的温度、光照、水环境等条件是选择定向培育微藻藻种的首要考虑因素，因此，从原位环境中分离筛选藻种，更有利于其在调控水质方面发挥正常生态功能(黄翔鹄等, 2021)。2019年，凡纳滨对虾工厂化养殖池中，一株硅藻在养殖中后期长期占优势，因其个体较小且细胞外壳覆盖一层硅质膜，难以用光学显微镜准确鉴定其分类地位，在以该藻为优势种的养殖池中，对虾生长状况良好(Qiao et al, 2020)。本研究以从凡纳滨对虾工厂化养殖水体中分离纯化出的一株微藻为研究对象，利用形态学结合分子生物学手段，对该藻进行鉴定，进一步研究该藻在不同浓度氨氮、硝态氮条件下的生长响应，以期为定向培育该藻并应用于对虾工厂化养殖水环境水质调控提供参考。

1 材料与方法 1.1 藻种分离与培养

从山东省海阳黄海水产有限公司凡纳滨对虾工厂化养殖池(36°40′23″N，121°09′00″E)中取500 mL养殖水体，置于冰袋上带回实验室。将水样置于载玻片上，在显微镜下(Olympus CKX41, 日本)用毛细吸管吸取单细胞，于含有f/2培养基的48孔细胞培养板中，将该细胞培养板放入培养箱培养，经扩大培养后，利用平板涂布法通过添加抗生素去除培养液中的细菌，得到纯净的藻液。

分离纯化后的藻株编号为HY01，培养在250 mL三角瓶中，培养温度为28℃，培养光照度为2000 lx，光暗比12 h︰12 h。

1.2 分离藻株HY01的鉴定 1.2.1 光学显微镜鉴定

取1 mL处于指数生长期的藻液在光学显微镜(Olympus CKX41, 日本)下观察其形态特征。

1.2.2 电子显微镜鉴定

取50 mL处于指数生长期的藻液，4000 r/min离心10 min，弃上清液，保留约20 mL的浓缩藻液，加入等体积97%的浓硫酸，于60℃水浴加热20 min，冷却后加入同体积65%的浓硝酸，继续水浴加热，直至沉淀变为白色。将处理后的样品4000 r/min离心5 min，弃上清液，之后用蒸馏水清洗沉淀数次，直至中性。干燥后镀金，用扫描电子显微镜观察，拍照。

1.2.3 分子生物学鉴定

取100 mL处于指数生长期的藻液，8000 r/min离心10 min，弃上清液。用DNA提取试剂盒(TIANGEN，北京)提取总DNA。以上述DNA为模板，用真核藻类18S rDNA通用引物Euk1A (5′-CTGGTTGATCCTGCCAG-3′)和Euk516r (5′-ACCAGACTTGCCCTC-3′)进行PCR扩增，反应产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，将通过验证的阳性PCR产物送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。将测序所得基因序列在NCBI上用BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源分析，下载相关序列，应用MEGA 5.05软件，以邻接法(Neighbor- Joining method)构建系统发育树。

1.3 分离藻株HY01对不同氮源的响应

实验开始前，将处于指数生长期的藻细胞分别接种至氨氮和硝态氮为氮源的培养液中驯化培养2~3个生长周期。实验所用氨氮氮源为NH4Cl，浓度梯度为50、100、200、400、600和882 μmol/L，硝态氮氮源为NaNO3，浓度梯度为100、200、400、600和882 μmol/L，每个浓度设置3个平行。将驯化培养后处于指数生长期的藻细胞接种至不同浓度的氨氮和硝态氮为氮源的培养液中，每天取样，测定藻细胞密度，共培养10 d。

1.3.1 藻细胞生长测定

取指数生长期的藻细胞，在400~800 nm之间，以培养液为参比调零建立基线，对用培养液稀释的不同浓度藻液进行连续扫描，确定分光光度法的最佳测试波长为676 nm。将处于指数生长期的藻细胞用培养液按比例稀释成各种浓度，用光学显微镜确定藻数量，以培养液为参比，将相应浓度藻液用分光光度计测定最佳测试波长下的吸光度，确定藻细胞浓度与藻液吸光度之间的线性关系，绘制藻细胞密度和吸光度值间的标准曲线(瞿唯钢等, 2013)。藻细胞密度(y)与吸光值(x)之间线性关系式为y=2×109x–7×106 (R2=0.999 2)。由此可见，该藻的细胞密度与藻液吸光值之间呈线性相关，可通过测定藻液的吸光值反映该藻的生长情况。

每天定时取样，利用分光光度计在最佳测试波长下测定吸光度值，利用上述标准曲线计算藻细胞密度，绘制分离藻株HY01的生长曲线。

分离藻株HY01的平均比生长速率计算公式如下：

$ μ = ({\rm{ln}}N_{t} – {\rm{ln}}N_{0})/(T_{t}–T_{0}) $

式中，Nt为收获时藻细胞密度，N0为起始藻细胞密度，Tt为藻细胞收获时间，T0为藻细胞起始培养时间。

1.3.2 藻细胞蛋白含量测定

在培养第10天，收集藻细胞，放入超低温冰箱冷冻至结冰，然后用真空冷冻干燥机冻干，冻干藻粉用于蛋白含量测定。蛋白含量按考马斯亮蓝法测定(黄俊远, 2014)。

1.3.3 数据处理与统计分析

每组实验设置3个平行，测得数据进行平均值与标准差分析，数据汇总后利用Origin 9.2对数据进行整理作图。采用SPSS 20软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和独立样本T检验(independent-sample T test)，显著性水平为P < 0.05。

2 结果与分析 2.1 分离藻株HY01的鉴定

分离藻株HY01的光镜和扫描电镜下的形态特征见图 1。分离藻株HY01细胞呈圆柱形，细胞直径为10.5~12.9 μm，平均直径约(11.4±1.0) μm。细胞外壳覆盖一层硅质膜(图 1d)，难以用光学显微镜直接准确鉴定其分类地位。经酸处理后，在电子显微镜下观察发现，其壳面上有很多小孔，且壳中央的孔密度较壳边缘稀疏(图 1e~g)，壳中央每10 μm内有20~26个小孔，壳边缘每10 μm内约有31~44个小孔(图 1e~g)。细胞壳面边缘处有眼斑(图 1d)，在光学显微镜下不可见。细胞壳边缘处还有3~5个唇形突(图 1e~g)。根据该藻株HY01的形态学特征，判断其为微小辐环藻(Actinocyclus exiguus HY01)。

图 1 分离藻株HY01的形态特征 Fig.1 Morphological characterization of separated microalga HY01 a、b为光学显微镜观察；c为荧光显微镜观察；d~g为电子显微镜观察；d图中圆圈部分为眼斑；e图箭头指向唇形突。 a and b are pictures taken under light microscope; c is a picture taken under fluorescence microscope; d~g are pictures taken under scanning electron microscope; the circle part in figure d is pseudonodulus, the arrow points to labiate process in figure e.

为进一步确定分离藻株HY01的分类地位，对分离藻株HY01进行18S rDNA扩增并测序，测序所得序列已提交到GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)，序列号为MW915791.1。下载GenBank中与扩增序列相似性高的序列，利用MEGA5.05以邻接法构建系统发育树(图 2)，结果显示该藻属于辐环藻属，与A. actinochilus (AY485506.1)、Actinocyclus sp. (KX253959.1、KC309522.1)和A. curvatulus (X85401.2)具有较高的相似性。

图 2 基于18S rRNA基因序列构建分离藻HY01与相似种的系统发育树 Fig.2 Phylogenetic tree based on 18S rDNA gene sequence between separated microalga HY01 and its similar species using Neighbor-Joining method
2.2 微小辐环藻HY01对不同浓度氮源的响应

微小辐环藻HY01在不同浓度氨氮和硝态氮为氮源的培养条件下的生长曲线见图 3。如图 3所示，以氨氮为氮源培养微小辐环藻HY01，6种氨氮浓度下的细胞密度均在第9天达到峰值，其中，氨氮浓度为600 μmol/L时，藻细胞密度最高，达到4.54×108个/L，其次为100 μmol/L (4.33×108个/L)；在氨氮浓度为882 μmol/L的培养液中，微小辐环藻HY01的细胞密度最低(2.11×108个/L) (图 3a)。以硝态氮为氮源培养微小辐环藻HY01，硝态氮浓度为100 μmol/L培养液中，藻细胞密度在培养第8天达到峰值，为3.86×108个/L；硝态氮浓度为200~882 μmol/L时，随着培养天数增加，藻细胞密度增加，第10天硝态氮浓度为882 μmol/L的培养液中藻细胞密度最高(5.92×108个/L)，其次为600 μmol/L (5.85×108个/L) (图 3b)。

图 3 微小辐环藻HY01在不同浓度氨氮(a)和硝态氮(b)培养条件下的生长曲线 Fig.3 Growth curves of A. exiguus HY01 under different ammonia (a) and nitrate (b) concentrations

当氮源为氨氮时，微小辐环藻HY01的平均比生长速率在氨氮浓度为100和600 μmol/L时最高，分别为0.37±0.04和0.36±0.07，氨氮浓度为882 μmol/L时，平均比生长速率最低，为0.27±0.05；当氮源为硝态氮时，微小辐环藻HY01的平均比生长速率随着硝态氮浓度的升高呈显著升高趋势(P < 0.05)，硝态氮浓度为600和882 μmol/L时，平均比生长速率最高，均为0.40±0.01 (图 4)。以氨氮为氮源时，微小辐环藻HY01的最高比生长速率显著低于以硝态氮为氮源时(P < 0.05)。

图 4 微小辐环藻HY01在不同浓度氨氮和硝态氮条件下的平均比生长速率 Fig.4 Average specific growth rate of A. exiguus HY01 under different ammonia and nitrate concentrations

微小辐环藻HY01在不同浓度氨氮和硝态氮条件下的蛋白含量如图 5所示。当氮源为氨氮时，微小辐环藻HY01的蛋白含量在氨氮浓度为600 μmol/L时最高，为4.45 mg/g，其次是100 μmol/L时，为3.28 mg/g，氨氮浓度为50 μmol/L时，藻内蛋白含量最低，为1.38 mg/g；当氮源为硝态氮时，微小辐环藻HY01蛋白含量随着氮浓度的增加显著升高(P < 0.05)，即硝态氮浓度为882 μmol/L时藻内蛋白含量最高，为11.97 mg/g，硝态氮浓度为100 μmol/L时最低，为4.55 mg/g (图 5)。以氨氮为氮源时，微小辐环藻HY01的蛋白含量显著低于以硝态氮为氮源时的蛋白含量(P < 0.05)。

图 5 微小辐环藻HY01在不同浓度氨氮和硝态氮条件下的蛋白含量 Fig.5 Protein contents of A. exiguus HY01 under different ammonia and nitrate concentrations
3 讨论

根据光镜和扫描电镜下的形态学特征，以及基于18S rDNA测序的分子生物学方法，判断该藻为微小辐环藻。微小辐环藻属于硅藻门(Bacillariophyta)、圆筛藻纲(Coscinodiscophyceae)、圆筛藻目(Coscinodiscales)、半盘藻科(Hemidiscaceae)、辐环藻属(Actinocyclus)，该藻与辐环藻属其他种的主要区别在于细胞直径和壳面孔密度。目前已报道的辐环藻细胞直径和壳面孔密度见表 1 (Fryxell et al, 1981; 郭晓慧等, 2018)。调查发现，目前微小辐环藻是辐环藻属中个体最小的物种，其细胞直径为6.4~13 μm (Fryxell et al, 1981; 郭晓慧等, 2018)，本研究分离出的微小辐环藻HY01细胞直径约为(11.4±1.0) μm；在壳面孔密度方面，微小辐环藻HY01壳面每10 μm孔的个数较其他辐环藻个数多，且边缘部分比中央部分明显密集。本研究中，微小辐环藻HY01壳面边缘唇形突数量为3~5个(图 1e~g)，高于海南省海口市红城湖分离出的微小辐环藻唇形突数(2~3个) (郭晓慧等, 2018)，而南大西洋样品中微小辐环藻有2~5个唇形突(Fryxell et al, 1981)。综上所述，本研究从凡纳滨对虾工厂化养殖水体中分离出的一株硅藻为微小辐环藻HY01，该藻细胞个体较小，是目前已知辐环藻属物种中最小的，用光学显微镜难以辨别；该藻壳面上有很多小孔，与其他辐环藻不同的是，微小辐环藻壳面孔纹排列相对紧密，且壳中央的孔密度较壳边缘稀疏，壳边缘具有眼斑结构，有3~5个唇形突。

表 1 辐环藻的细胞直径和壳面孔密度 Tab.1 Diameters and numbers of areolae per 10 μm on mantle of Actinocyclus

本研究中微小辐环藻HY01分离自凡纳滨对虾工厂化养殖池，该藻在养殖中后期(4~5月)均为优势种，最高细胞密度达到2.77×107个/L，占了总细胞密度的75% (Qiao et al, 2020)。由辐环藻引发的赤潮报道较少，目前仅有2次，一次是在大西洋(48°49′51.6″N，16°30′36″W)，细胞密度为4×105个/L，赤潮持续了5 d (Smythe-Wright et al, 2010)；另一次发生在海南省海口市红城湖，持续时间为6 d，期间微小辐环藻的细胞密度保持在107~108个/L，致使红城湖40余吨花鰶(Clupanodon thrissa)死亡(郭晓慧等, 2018)。该藻没有毒性，导致鱼类死亡的原因可能与水体盐度剧烈变化造成应激反应有关(郭晓慧等, 2018)。

赤潮的暴发往往与水体的环境因素有关(张善发等, 2020)。温度是一切酶促反应的限制性因子，水温的变化直接影响浮游植物的生长代谢(窦勇等, 2020)。营养盐是浮游植物生长必需的营养元素，大部分赤潮的暴发都与水域的富营养化有关(徐宁等, 2005; Glibert et al, 2008; 张善发等, 2020)。海南红城湖微小辐环藻赤潮暴发期间，水体温度较高，平均约为31℃；水体总无机氮浓度为3.12 mg/L，其中，氨氮是总无机氮的主要组成部分，平均贡献率为84.8%；活性磷酸盐浓度为0.11 mg/L，氮磷比范围为13.1~66.8，平均值为31.4；水体中总无机氮和活性磷酸盐均超过四类水质，为高度富营养化(郭晓慧等, 2018)。因此，红城湖微小辐环藻赤潮的暴发可能与水体近年逐渐富营养化以及较高的水温有关(郭晓慧等, 2018)。凡纳滨对虾工厂化养殖池中，微小辐环藻HY01为优势种期间，养殖水体温度平均为28℃；水体总无机氮平均浓度为5.07 mg/L，其中，氨氮平均浓度为1.53 mg/L，分别占总无机氮的30%；活性磷酸盐的平均浓度为0.06 mg/L，氮磷比范围为27.6~38.6，平均值为32% (Qiao et al, 2020)。因此，微小辐环藻HY01可能更喜欢在温度较高、营养物质丰富的水域生长。

氮作为浮游植物生长代谢过程中不可缺少的元素之一，是参与细胞内核酸、蛋白质及叶绿素构成的主要成分(Robertson et al, 2009)。氨氮和硝态氮是养殖水体中无机氮的2种主要形态(Chen et al, 2018; Qiao et al, 2020)，可被微藻直接吸收利用。氮营养盐的添加在一定程度上能够促进微藻的生长，但并非氮营养盐浓度越高微藻生物量就高，过高的氨氮不利于藻类生长，甚至影响其他氮源的吸收和转化(Collos et al, 2014; Gutierrez et al, 2016)。本研究分别以不同浓度氨氮和硝态氮为氮源培养微小辐环藻HY01，发现该藻均能利用氨氮和硝态氮进行生长，最适宜生长的氨氮浓度为600 μmol/L，最适宜生长的硝态氮浓度为882 μmol/L，但以氨氮为氮源时微小辐环藻HY01的最大细胞密度、最高比生长速率以及蛋白含量均低于以硝态氮为氮源(图 3~图 5)。通常认为浮游植物会优先利用氨氮，因为氨氮可以直接被利用，而硝态氮需要先被还原才能被利用(Dortch, 1990; Berges et al, 2008; Mulholland et al, 2008)。但不同藻类对不同形态氮的选择性不同，研究发现，硅藻更偏好硝态氮丰富的水域环境，而甲藻更倾向于高氨氮或尿素的水环境(Lomas et al, 1999; 欧美姗等, 2006; Mulholland et al, 2008)。因此，本研究分离出的微小辐环藻HY01可能更喜欢利用硝态氮，但对较高浓度的氨氮有一定的耐受性，这可能是微小辐环藻HY01在养殖中、后期长时间占优势的原因之一。

4 结论

根据光镜和扫描电镜下的形态学特征，结合分子生物学技术，鉴定该分离藻株为微小辐环藻HY01。藻细胞个体较小，大小约为(11.4±1.0) μm，壳面上有很多小孔，光学显微镜下不可见，且壳中央的孔密度较壳边缘稀疏，壳边缘具有眼斑结构，有3~5个唇形突。以不同浓度氨氮和硝态氮为氮源培养微小辐环藻HY01，结果表明，微小辐环藻HY01可能更喜欢利用硝态氮，但对较高浓度的氨氮有一定的耐受性。

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