海上石油运输导致的溢油污染是当前全球海洋重大环境问题之一，多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是环境毒性作用最为显著的一类石油污染物，受到广泛关注(Renault, 2015; 杨帆等, 2013; 徐勇等, 2015)。PAHs在海洋中分布广泛，一般情况下，其在近海的浓度大于远海，表层的浓度大于深层，沉积物中的浓度大于水体。早在2005年，东海海域近岸泥质区沉积物中PAHs含量就达到180.3~424.8 ng/g (张宗雁, 2005)；2013年，东海海域近岸表层沉积物中PAHs的平均含量已达到771 ng/g (邓伟, 2013)；2020年，舟山海域近岸沉积物中的PAHs平均含量达到2000 ng/g左右(Cao et al, 2020)。苯并[a]芘(benzo[a]pyrene, BaP)是最早被发现的PAHs之一，广泛分布于各种环境中且具有较强的稳定性和致癌性，被认为是PAHs的主要代表(李玉, 2018)。BaP具有疏水亲脂性的特点，水环境中的BaP会以食物链或直接接触的方式富集到双壳贝类的体内，不仅对双壳贝类产生强烈的毒性效应，而且威胁到食品安全和人类健康，因而被国内外学者广泛研究(杨慧赞, 2008; Banni et al, 2010; Speciale et al, 2018; Chen H et al, 2018)。
双壳贝类具有较高经济价值，其大多数种类运动缓慢，滤食水中的浮游生物，营固着、匍匐、底栖或埋栖生活。PAHs极易被水中的悬浮固体颗粒吸附并随着固体颗粒的沉降而进入沉积物，从而导致PAHs在沉积物中的含量远高于水体中的含量(朱樱等, 2009)。相比在水中能自由活动的其他动物，双壳贝类更易受到环境中PAHs的影响。近年来，有许多学者探究了PAHs对海洋双壳贝类的氧化毒性和免疫毒性效应，包括厚壳贻贝(Mytilus coruscus) (Qu et al, 2019; Chen S et al, 2018)、栉孔扇贝(Chlamys ferrari) (Tian et al, 2020; Cai et al, 2016; Xiu et al, 2014)、菲律宾帘蛤(Ruditapes philippinarum) (Jiang et al, 2019; Wang et al, 2018)、文蛤(Meretrix meretrix) (Wang et al, 2012)、大海扇蛤(Pecten maximus)(Hannam et al, 2010)和长牡蛎(Crassostrea gigas)(Geffard et al, 2003)等常见的具有较高经济价值的贝类。泥蚶(Tegillarca granosa)作为我国传统四大养殖贝类(蛏、蛤、蚶和蛎)之一，有非常高的经济价值，但目前关于泥蚶响应PAHs污染的研究尚不多见。Su等(2017、2019)发现，泥蚶在pH为7.8和7.4的CO2酸化海水中暴露4周后，其体内BaP的积累量会显著高于对照组。Tang等(2020)则研究了BaP和微塑料联合作用于泥蚶产生的免疫毒性。
本研究以泥蚶的消化腺为目标组织，检测其在BaP急性暴露下的组织学变化、氧化应激状态、神经毒性以及DNA甲基化水平，旨在全面评估BaP对泥蚶的毒性效应，为深入探索双壳贝类应对石油污染物胁迫的内在调控机制提供新思路，同时为石油污染威胁下泥蚶的生物资源保护提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验所需的泥蚶采自浙江省舟山市东极岛，平均壳长为(32.3±1.8) mm，壳宽为(22.5±3.7) mm，壳高为(24.6±2.1) mm，购回后，小心刷洗表壳至无明显污物，置于经二氧化氯消毒并晾晒后的300 L方形塑料桶中暂养1周以适应环境。在灭菌并曝气48 h的纯水中加入人工海盐提前配制所需海水，其盐度为25±1，温度为(24±2)℃，pH为8.1±0.4。暂养期间，保持自然光照周期，使用气泵持续充气供氧，使用具有良好适应性和增殖能力且被广泛用作双壳贝类饲料的亚心型扁藻(Platymonas subcordiformis)投喂泥蚶，早晚各1次，每次约5%组织干重(Zhao et al, 2017)。每24 h完全换水1次，取出泥蚶并彻底清洗缸底桶壁。
1.2 实验设计Su等(2017)将泥蚶暴露于5 μg/L的BaP中长达28 d，其结果表明BaP的亚慢性暴露对泥蚶具有免疫毒性。本实验为了探究BaP急性暴露对泥蚶多方面的毒性效应，提高BaP浓度，设计为期4 d的急性暴露实验：取暂养后仍保持健康有活力的泥蚶若干，随机分为4组，分别为海水组(对照组)、DMSO组(BaP载体溶剂对照组，0.01% VDMSO/V海水)、10 μg/L BaP浓度组和100 μg/L BaP浓度组，每组设3个平行，每个平行包含40个个体。使用Agilent 5975 GC-MS系统测定实验前后水体中的BaP浓度。实验前水体中BaP浓度为8.26 μg/L (10 μg/L组)和92.47 μg/L (100 μg/L组)，而实验结束时的BaP浓度为5.58 μg/L (10 μg/L组)和77.39 μg/L (100 μg/L组)。暴露实验使用单独的玻璃水族缸养殖每个平行中的所有个体，共96 h，分别在暴露后的0、24、48、96 h从每个浓度组的每个平行随机选取3只泥蚶，置于冰上解剖后立即用无菌镊子和眼科剪迅速分离消化腺组织，并将其混合以减少个体差异对实验的影响，随后置于–80℃超低温冰箱保存备用。暂养淘汰缺乏活力和不健康的个体。在暴露期间，泥蚶的存活率为96.46%。
1.3 组织切片与HE染色取出保存的组织，解冻后用4%多聚甲醛溶液在室温固定24 h。用70%乙醇洗掉残留的固定液并修剪组织，随后进行逐级脱水、透明、透腊、包埋、切片、脱蜡复水、HE染色、封片、扫描与图像采集。使用CaseViewer软件对图像进行处理与分析。
1.4 脂质过氧化与DNA氧化损伤测定取0.2 g组织，按照1∶9比例加入1.8 mL现配的生理盐水，置于冰上用电动研磨器充分研磨，4℃ 3000 r/min离心15 min后取上清液，得到10%组织匀浆，使用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定丙二醛(MDA)含量。另取0.2 g组织，使用预冷的PBS缓冲液(pH=7.4)按照相同的方法取上清液，用酶联免疫吸附法测定8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量。操作步骤参照各试剂盒的说明书。
1.5 抗氧化酶活性和基因表达测定用生理盐水制备10%的组织匀浆，使用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和谷胱甘肽硫转移酶(GST)的活性，操作步骤参考各试剂盒的说明书。另取少量组织，用北京索莱宝科技有限公司提供的总RNA提取试剂盒提取RNA，随后用TaKaRa公司提供的反转录试剂盒进行反转录合成cDNA第一链。选取SOD、CAT和GST作为目标基因，18S rRNA作为内参基因(Tang et al, 2020; Volland et al, 2017)，进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)实验。从NCBI数据库中查找目标基因的全长序列并用Primer-BLAST在线设计引物(表 1)，委托华大基因合成引物。qRT-PCR实验所用的TB Green® Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)试剂盒购自TaKaRa公司，根据说明书进行实验操作。
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表 1 用于实时荧光定量PCR的引物 Tab.1 Primer pairs used in quantitative real-time PCR |
用生理盐水制备10%的组织匀浆，使用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)的活性，操作步骤参考各试剂盒的说明书。
1.7 DNA甲基化水平测定和相关性分析取少量组织，使用盐析法提取组织DNA，随后根据EpiGentek试剂盒说明书，使用间接ELISA法对泥蚶组织的DNA甲基化水平(5-mC含量)进行测定。使用R软件(V4.0.2)内的corrplot包进行DNA甲基化水平、抗氧化酶活性及基因表达量、AChE和ChAT活性、MDA和8-OHdG含量的Spearman相关性分析，并进行图形化展示。
1.8 数据分析所有实验都包含3个平行，数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示。采用SPSS 19.0软件对各组数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey多重比较检验，P < 0.05时，为存在显著差异。
2 结果 2.1 BaP急性暴露与组织损伤在非胁迫的状态下，泥蚶的消化腺由许多圆形或椭圆形的消化小管组成，其最外层有一层膜包裹，膜的内侧是紧密排列分布的消化腺上皮细胞和泡状的消化细胞，上皮细胞和消化细胞共同围成了内部的消化管腔(图 1)。
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图 1 BaP暴露前的消化腺组织结构 Fig.1 The digestive gland structure before BaP exposure TL：管腔；DT：消化小管；EC：上皮细胞；DC：消化细胞 TL: Tubular lumen; DT: Digestive tubule; EC: Epithelial cell; DC: Digestive cell |
10 μg/L的BaP暴露下，泥蚶消化腺组织受损程度随着时间延长而增加。在24 h，泥蚶消化腺受损较轻，结构仍然较为完整，仅有个别消化小管轻微变形(黄箭头)(图 2A)。暴露48 h后，可以观察到明显的血细胞浸润和少量的褐脂素聚集，消化细胞正从管壁上脱落，部分消化小管聚集在一起，变形较为严重且有萎缩的初步迹象(图 2B)。到96 h，出现大规模的消化小管萎缩，其管腔内的消化细胞基本消失(图 2C)。
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图 2 BaP暴露后的消化腺组织结构
Fig.2 The digestive gland structure after BaP exposure
A、B和C图分别为10 μg/L BaP暴露24 h、48 h和96 h D、E和F图分别为100 μg/L BaP暴露24 h、48 h和96 hAT：萎缩的消化小管；LF：褐脂素；HI：血细胞浸润；N：坏死 A, B, and C figures show 10 μg/L BaP exposure for 24 h, 48 h, and 96 h, respectively, and D, E, and F figures show 100 μg/L BaP exposure for 24 h, 48 h, and 96 h, respectively AT: Atrophied tubules; LF: Lipofuscin; HI: Hemocyte infiltration; N: Necrosis |
100 μg/L的BaP暴露也会导致泥蚶的消化腺组织受损程度随时间而增加，但各阶段的损伤状况较10 μg/L组更为明显，有个别消化小管趋于解体(蓝箭头) (图 2D和图 2E)。尤其是在暴露后96 h，泥蚶消化小管扎堆聚集，出现明显损伤，消化管腔界限模糊，有弥漫性的血细胞浸润，表明已经存在一定程度的坏死(图 2F)。
2.2 BaP急性暴露与氧化损伤在暴露于10 μg/L的BaP 24 h后，泥蚶消化腺中的MDA含量显著增加，但在48 h回落到对照组水平，随后急剧升高，于96 h达到峰值。在100 μg/L的BaP暴露下，MDA含量在24 h达到峰值，随后略有下降(图 3A)。8-OHdG含量的变化趋势在初期与MDA类似，均在BaP暴露后显著增加。与MDA不同的是，8-OHdG含量在2个浓度组均呈现时间依赖性增加，于暴露后96 h达到峰值(图 3B)。
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图 3 BaP暴露下泥蚶消化腺中MDA (A)和8-OHdG (B)的含量 Fig.3 The MDA (A) and 8-OHdG (B) content in the digestive gland of blood clams exposed to BaP 数值表示为平均值±标准差(n=3)。不同字母表示组间存在显著差异(P < 0.05)。下同。 Values presented as Mean±SD (n=3). Groups with different letters are significantly different (P < 0.05). The same as below. |
BaP急性暴露会引起泥蚶体内的氧化应激反应，从而诱导抗氧化防御系统的启动。由图 4可见，消化腺中抗氧化酶活性基本呈现持续上升的趋势。在100 μg/L BaP暴露下，所有检测的抗氧化酶活性均稳定且持续上升，且都于96 h达到峰值。
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图 4 BaP暴露对泥蚶消化腺中SOD (A)、CAT (B)、POD (C)和GST (D)活性的影响 Fig.4 Effects of BaP exposure on activities of SOD (A), CAT (B), POD (C), and GST (D) in digestive glands of blood clams |
在10 μg/L BaP暴露下，虽然每种抗氧化酶的活性在任一时间点都显著高于对照组，但各自的活性变化情况不同。SOD活性在48 h前显著增加，尽管在96 h达到峰值，但比48 h仅有轻微上升(图 4A)。CAT活性在24 h达到峰值，随后有所回落，48 h后趋于稳定(图 4B)。POD活性则呈现出持续增加的趋势(图 4C)。GST活性表现为先上升后下降再上升的趋势，在24 h相对对照组显著增加，随后出现显著下降，实验后期又陡然增加直至96 h出现最高值(图 4D)。
抗氧化酶的基因表达量与其活性有较好的一致性。在100 μg/L BaP暴露下，SOD、CAT和GST的表达量均持续上升，直至实验结束时出现峰值。在10 μg/L BaP暴露下，这3种抗氧化酶的基因表达量先在24 h出现显著上升，随后的变化趋势各不相同。其中，SOD基因在48 h及之后出现高表达，96 h比48 h仅有略微降低(图 5A)。CAT基因的表达量则在48 h及之后迅速降低至对照组水平(图 5B)。GST基因在48 h的表达量基本与24 h相同，但在96 h显著上升，出现峰值且高于100 μg/L组的表达量(图 5C)。
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图 5 BaP暴露对泥蚶消化腺中SOD (A)、CAT (B)和GST (C)基因表达的影响 Fig.5 Effects of BaP exposure on gene expression of SOD (A), CAT (B) and GST (C) in the digestive gland of blood clams |
AChE和ChAT是胆碱能系统中起着重要作用的2种酶，在神经系统中广泛分布并参与神经冲动的传导。在BaP急性暴露下，2种酶活性都受到了显著抑制。AChE活性在10 μg/L组持续降低，而在100 μg/L组只在24 h出现显著降低，随后基本保持不变，实验结束时的活性反而高于10 μg/L组(图 6A)。ChAT的变化趋势与AChE类似，只是100 μg/L组在48 h出现显著降低(图 6B)。
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图 6 BaP暴露对泥蚶消化腺中AChE (A)和ChAT (B)活性的影响 Fig.6 Effects of BaP exposure on activities of AChE (A) and ChAT (B) in the digestive gland of blood clams |
在2种浓度BaP的暴露下，泥蚶消化腺组织的DNA甲基化水平在24 h出现显著降低，随后呈现时间依赖性下降，在实验结束时出现最低值(图 7)。
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图 7 BaP暴露下泥蚶消化腺中的DNA甲基化水平变化 Fig.7 Changes of global DNA methylation level in the digestive gland of blood clams exposed to BaP |
由图 8可见，泥蚶消化腺组织中各个抗氧化酶活性及其基因表达量之间基本为显著的正相关，表明基因表达和酶活性的一致性。而DNA甲基化水平与各抗氧化酶活性及其基因表达量之间则呈显著的负相关。此外，由于BaP暴露导致了神经系统关键酶AChE和ChAT活性的降低，因此，它们也与其他的酶活性呈负相关，而与DNA甲基化水平呈正相关。
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图 8 泥蚶消化腺各项指标的斯皮尔曼等级相关性分析结果
Fig.8 Spearman rank correlation results for all biomarkers in the digestive gland of blood clams
圆的大小表示相关程度，与斯皮尔曼等级相关系数成正比。红色代表正相关，蓝色代表负相关。 *表示存在显著相关(P < 0.05)，**表示存在极显著相关(P < 0.01)。 The circle size is proportional to the correlation value (Spearman rank correlation coefficient), which represents correlation level. Red represents positive correlation and blue represents negative correlation. *: Significant difference (P < 0.05), **: Highly significant difference (P < 0.01). |
泥蚶作为一种滤食性双壳贝类，在滩涂里营埋栖生活，移动能力差，特别容易受到BaP等环境污染物的影响。消化腺作为双壳贝类的重要器官，不仅参与营养物质的消化，也是有机污染物聚集和解毒的重要细胞器，广泛参与抗氧化防御过程(Marigómez et al, 2002; Pagano et al, 2016)。当泥蚶受到BaP胁迫时，消化腺的受损程度随时间增加而加重，表现为消化细胞脱落，消化小管萎缩、变形、破碎，以及部分区域坏死。此外，在BaP暴露期间，泥蚶消化小管之间出现了血细胞浸润，如10 μg/L BaP暴露48 h后出现轻度的血细胞浸润，但该情况在暴露后96 h明显缓解，而100 μg/L浓度组在暴露前期和中期均未出现明显的血细胞浸润，但在暴露96 h之后出现大规模的弥漫性血细胞浸润和组织坏死。不同于脊椎动物，双壳贝类的血细胞在免疫方面有着重要作用(Canesi et al, 2006; Huang et al, 2018)，行使着脊椎动物炎细胞类似的功能，因此，出现血细胞浸润往往代表炎症的存在，有诸多研究从分子层面表明，BaP暴露会在鸡帘蛤(Chamelea gallina) (Matozzo et al, 2009)、菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)(Liu et al, 2014)等双壳贝类中引发炎症反应，本研究借助组织切片技术，切实观察到了炎症反应的存在，证明了BaP急性暴露也会导致泥蚶出现炎症反应。
氧化压力是指细胞内活性氧簇(ROS)水平增加导致的脂质、蛋白质和DNA的损伤(Schieber et al, 2014)，它已经被证明是BaP导致软体动物中毒的主要毒性机制(Livingstone, 2001)。ROS会导致生物膜发生脂质过氧化，而MDA则是脂质过氧化的重要产物之一。MDA因其检测方便的特点，被广泛用于脂质过氧化程度的判定。8-OHdG常因其在体外DNA模板的修饰和相邻碱基中的误导作用而被广泛研究(Kuchino et al, 1987)，是另一种非常重要的损伤性生物标志物。本研究通过测定MDA和8-OHdG含量探究了BaP对泥蚶造成的氧化损伤。结果显示，MDA含量随暴露时间延长而显著增加，表明BaP暴露可使泥蚶的脂质过氧化水平的时间依赖性升高，从而导致细胞毒性。在栉孔扇贝中也发现类似结果，MDA随着暴露时间的增加而增加，且MDA含量与BaP浓度呈正相关(Pan et al, 2009; Tian et al, 2013)。Sifi等(2019)的研究也证明了这一点，在被BaP等污染的海域中，截形斧蛤(Donax trunculus)体内的MDA含量会显著增加。Qi等(2020)关于厚壳贻贝的研究和Jiang等(2019)关于菲律宾帘蛤的研究也都表明了BaP暴露和双壳贝类体内MDA含量的关联性。在BaP暴露下，另一个指标8-OHdG的含量在消化腺中的时间依赖性增加，表明DNA氧化损伤的存在。在相近物种中也有类似的研究，当地中海贻贝(Mytilus galloprovincialis)暴露于含有一系列不同浓度BaP的海水时，其鳃和消化腺中均检测到8-OHdG含量的显著增加，但并未观察到明显的剂量–效应关系(Canova et al, 1998)。
Al-Subiai等(2011)研究表明，氧化压力的增加是诱导组织损伤和DNA损伤的原因之一。抗氧化防御系统作为机体的重要组成部分，在应对氧化压力方面有重要作用。在这个系统中，起关键作用的是其中的抗氧化酶，如SOD、CAT、POD和GST等。SOD能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受ROS损伤，在机体的氧化与抗氧化平衡中发挥主要作用。CAT和POD同属于过氧化物酶系，主要负责清理SOD酶促反应生成的过氧化氢。消化腺作为泥蚶抵御有机污染物的重要器官，其SOD和CAT活性及表达量在10 μg/L BaP暴露48 h后不再有显著上涨，而在100 μg/L BaP暴露下则持续显著上涨至实验结束出现峰值；POD的活性一直持续增长；而GST的活性及表达量随时间出现波动。由此可见，该实验结果未能反映出消化腺对BaP的处理能力上限，但消化腺在实验结束时已受到了较严重的损伤，对其行使抗氧化功能也有一定的影响。相似的结果在菲律宾帘蛤(Wang et al, 2011)、缢蛏(Sinonovacula constricta) (Li et al, 2016)、不等壳毛蚶(Scapharca inaequivalvis) (Monari et al, 2007)等海洋双壳贝类中也有报道。
BaP作为一种高毒性物质，除了具有氧化毒性外，还具有神经毒性(Chepelev et al, 2015)。然而，关于BaP神经毒性的研究，大多集中在脊椎动物及部分模式生物，很少涉及双壳贝类。AChE和ChAT作为一对控制乙酰胆碱(Ach)含量的神经系统关键酶，能标明胆碱能神经功能状态，在神经系统中有着非常重要的作用。其中，ChAT主要负责合成Ach，而AChE则将其分解为胆碱和乙酸盐。在斑节对虾(Penaeus monodon)和黑海胆(Arbacia lixula)等水生无脊椎动物(Eamkamon et al, 2012; Maisano et al, 2015)，这些酶活性的改变可能表明胆碱功能受损，因此，也指示了神经毒性的存在与否(Fulton et al, 2001; Lavado et al, 2006; Jebali et al, 2013; Fu et al, 2018)。在本研究结果中，10 μg/L和100 μg/L的BaP急性暴露都会使泥蚶消化腺中AChE和ChAT的酶活性显著下降，实验结束时这2种酶的活性已处于非常低的水平，表明BaP对泥蚶可能具有神经毒性。
DNA甲基化已经被证明参与哺乳动物和模式生物暴露于BaP时的应激反应。在斑马鱼(Danio rerio)中，BaP暴露会导致基因特异性甲基化和整体DNA甲基化水平的降低，从而打开基因启动子的开关，诱导环境胁迫相关基因表达以减弱BaP带来的影响(Fang et al, 2013; Corrales et al, 2014)。在泥蚶中，观察到BaP暴露下的消化腺组织中出现DNA甲基化水平显著下降，且在48 h之后基本保持稳定。鉴于目前尚无关于BaP暴露下软体动物DNA甲基化水平变化的研究，因此，未能对当前实验结果进行平行比较分析。然而，研究发现，在其他有毒物质暴露软体动物时，会降低其DNA甲基化的水平(Akcha et al, 2021; Bal et al, 2017)。这些现象与本研究中观察到的结果基本一致，至少表明泥蚶的DNA甲基化水平变化参与了BaP暴露引起的应激反应。
相关性分析显示，DNA甲基化水平和抗氧化酶基因表达之间呈显著或极显著的负相关，结合其他学者的相关研究(Fang et al, 2013; Corrales et al, 2014)和DNA甲基化的作用机制，推测DNA甲基化水平的降低可能在一定程度上促进了抗氧化酶基因的表达，从而对抗BaP的毒性。SOD、CAT和GST在BaP暴露下不同时间点的基因表达情况则证明了这点，这3种抗氧化酶基因的表达量在暴露24 h后都出现显著增加。虽然在某些时间点上，基因的表达水平和相应抗氧化酶活性之间并不总是一致，这可能与蛋白质的翻译后修饰有关(Regoli et al, 2011)，但从整体上看，这些基因的表达量相较暴露前确实有所增长。因此，DNA甲基化水平的降低可能是泥蚶抵御BaP胁迫的重要机制之一。通过测定抗氧化酶基因的表达量以及相关性分析，从侧面印证了该机制的合理性，但未来仍需进行更多、更深入的实验和分析，以挖掘更多信息，进一步扩展对于BaP暴露泥蚶产生的毒性效应以及泥蚶自身在此情况下产生应激反应的理解。
综上所述，BaP急性暴露泥蚶会给其带来多种毒性效应，主要表现为几乎不可逆的组织损伤；氧化损伤指标如MDA和8-OHdG的含量随暴露时间增长呈显著增加；神经传导关键酶AChE和ChAT活性被显著抑制。在这个过程中，抗氧化防御系统会积极响应，以求尽量降低BaP对机体的影响，但长时间高浓度的BaP暴露会加重抗氧化防御系统的负担，从而导致不可逆转的损伤，而DNA甲基化水平的显著降低，可能是泥蚶应对BaP暴露的潜在机制之一。
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