许氏平鲉幼鱼对饲料中维生素D<sub>3</sub>需求量的研究

引用本文

孙海悦, 王际英, 李宝山, 王成强, 刘财礼, 沈钰博, 孙永智, 黄炳山, 王世信. 许氏平鲉幼鱼对饲料中维生素D₃需求量的研究[J]. 渔业科学进展, 2023, 44(1): 103-114. DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20210716001.

SUN Haiyue, WANG Jiying, LI Baoshan, WANG Chengqiang, LIU Caili, SHEN Yubo, SUN Yongzhi, HUANG Bingshan, WANG Shixin. Dietary Vitamin D₃ Requirement of Juvenile Rockfish (Sebastes schlegelii)[J]. Progress in Fishery Sciences, 2023, 44(1): 103-114. DOI: 10.19663/j.issn2095-9869.20210716001.

基金项目

烟台市科技创新发展计划项目(2021XDHZ056)和山东省自然科学基金(ZR2020QC206)共同资助

作者简介

孙海悦，E-mail: 1969832776@qq.com

通讯作者

王际英，研究员，E-mail: ytwjy@126.com

文章历史

收稿日期：2021-07-16
收修改稿日期：2021-09-03

Contents Abstract Full text Figures/Tables PDF

许氏平鲉幼鱼对饲料中维生素D₃需求量的研究

孙海悦 ^1,2, 王际英 ², 李宝山 ², 王成强 ², 刘财礼 ², 沈钰博 ², 孙永智 ², 黄炳山 ², 王世信 ²

1. 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心农业农村部鱼类营养与环境生态研究中心水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心上海 201306;
2. 山东省海洋资源与环境研究院山东省海洋生态修复重点实验室山东烟台 264006

收稿日期：2021-07-16；收修改稿日期：2021-09-03

基金项目：烟台市科技创新发展计划项目(2021XDHZ056)和山东省自然科学基金(ZR2020QC206)共同资助

作者简介：孙海悦，E-mail: 1969832776@qq.com.

通讯作者：王际英，研究员，E-mail: ytwjy@126.com.

摘要：本实验旨在研究维生素D₃对许氏平鲉(Sebastes schlegelii)幼鱼生长、体组成及机体免疫能力的影响，以确定其对维生素D₃的最适需求量。配制维生素D₃含量分别为707、1254、1740、2513、4519和8671 IU/kg的6种等氮等脂饲料，饲养初始体质量为(20.95±0.05) g的许氏平鲉幼鱼，8周后进行哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)攻毒48 h。研究表明，随着维生素D₃含量的增加，许氏平鲉幼鱼增重率(WGR)和特定生长率(SGR)均先上升后下降，脏体比(VSI)和肝体比(HSI)显著下降，707 IU/kg组显著高于其他组(P < 0.05)；全鱼粗脂肪和肌肉粗脂肪随维生素D₃含量增加呈增加的趋势，在4519 IU/kg组有最大值并显著高于对照组(P < 0.05)，脊椎骨粗灰分和钙含量显著增加；血清总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活力和补体3 (C₃)含量均先升高后降低，均在2513 IU/kg组有最大值，谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活力和丙二醛(MDA)含量均先降低后升高，总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)和钙离子含量(Ca²⁺)呈增加的趋势，磷(Pi)和补体4 (C₄)含量不受维生素D₃含量的影响(P > 0.05)。攻毒后，T-AOC及MDA、C₃和C₄含量显著增高，肝脏和头肾HSP70、MYD88、IRAK4、TRAF6和TLR2基因表达显著升高(P < 0.05)。以WGR为评价指标，经折线回归分析表明，体质量为(20.95±0.05) g的许氏平鲉幼鱼维生素D₃的需求量为2 223.45 IU/kg饲料。

关键词：许氏平鲉维生素D₃ 生长免疫需求量

Dietary Vitamin D₃ Requirement of Juvenile Rockfish (Sebastes schlegelii)

SUN Haiyue ^1,2, WANG Jiying ², LI Baoshan ², WANG Chengqiang ², LIU Caili ², SHEN Yubo ², SUN Yongzhi ², HUANG Bingshan ², WANG Shixin ²

1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Centre for Research on Environmental Ecology and Fish Nutrion (CREEFN) of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
2. Shandong Key Laboratory of Marine Ecological Restoration, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai, Shandong 264006, China

Corresponding author: WANG Jiying. E-mail: ytwjy@126.com.

Abstract: Rockfish (Sebastes schlegelii) is a near-shore, carnivorous coldwater fish, primarily distributed in the East China Sea, Korean peninsula, Japan, and the Sea of Okhotsk. Owing to its delicious meat, strong disease resistance, rapid growth, and other characteristics, it has become one of the main cultured fish in deep water cages in northern China. A high-quality and efficient formula diet for rockfish has not been developed because of nutrient requirement deficiencies. As vitamin D₃ is the most important form of vitamin D and only exists in animals, cultured fish can only obtain vitamin D₃ from their diet. Vitamin D₃ can maintain the mineral homeostasis in fish, participate in the endocrine system, and affect the proliferation and apoptosis of immune cells. As such, this experiment was conducted to investigate the effects of dietary vitamin D₃ on growth performance, body composition, and immune function of juvenile rockfish and determine the optimum dietary vitamin D₃ requirement. Six kinds of isonitrogenous and isolipidemic diets with 707, 1254, 1740, 2513, 4519, and 8671 IU/kg of vitamin D₃ were prepared by adding 0, 500, 1000, 2000, 4000, and 8000 IU/kg of vitamin D₃ into the basic diet. Each diet was randomly assigned to triplicate groups of juveniles with initial bodyweights of (20.95±0.05) g for eight weeks. The fish were challenged with Vibrio harveyi for 48 hours after feeding. Results showed that, with the increase of vitamin D₃ contents, both the weight gain rate (WGR) and specific growth rate first increased and then decreased, reaching a maximum value in the 2513 IU/kg group, which was significantly higher than that in the 707 IU/kg group. The feed conversion rate first decreased and then increased and was significantly lower in the 2513 IU/kg group than other groups. Both viscerosomtic index and hepatosomatic index decreased significantly and were significantly higher in the 707 IU/kg group than in other groups. There were no significant differences in the condition factor and survival rate among all groups. The crude fat of whole fish and muscle showed an increasing trend, reaching a maximum value in the 4519 IU/kg group, which was significantly higher than 707 IU/kg group. The crude muscle protein first decreased and then increased; the 8671 IU/kg group was significantly higher than the 1740 IU/kg and 2513 IU/kg groups. The moisture, crude protein, and crude ash of whole fish, as well as the muscle moisture and crude ash, had no significant differences in concentration among all groups. The spine crude ash showed an increasing trend; the 1740~8671 IU/kg groups had significantly higher contents than the 707 IU/kg group. The calcium contents increased with the increase of dietary vitamin D₃ levels. Total antioxidant capacity (T-AOC) and superoxide dismutase activities first increased and then decreased, reaching a maximum in the 2513 IU/kg group. The malondialdehyde (MDA) contents first decreased and then increased; the 2513 IU/kg group had significantly lower content than the 707 IU/kg group. Complement 3 (C₃) contents first increased and then decreased; the 707 IU/kg group had significantly lower content than the other groups. Alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase first decreased and then increased, reaching minimum values in the 2513 IU/kg group. The highest cholesterol and triglyceride values were observed in the 4519 IU/kg group. The calcium (Ca²⁺) contents first increased with the increase of dietary vitamin D₃ levels, with the 707 IU/kg group showing significantly lower content than other groups. The phosphorus and complement 4 (C₄) contents were not affected by dietary vitamin D₃. After the challenge, T-AOC, MDA, C₃, and C₄ were significantly elevated; T-AOC, C₃, and C₄ in the serum had maximum values in the 2513 IU/kg group, and MDA reached its minimum value in the 2513 IU/kg group. With the increase of dietary vitamin D₃ content, HSP70, MYD88, IRAK4, TRAF6, and TLR2 in the liver, and head kidney increased first and then decreased before and after the challenge. Gene expression was significantly elevated after the challenge. Taking WGR as the evaluation index, a broken line regression analysis showed that the optimum dietary vitamin D₃ requirement was 2 223.45 IU/kg diet for juvenile rockfish S. schlegelii with the body weight of (20.95±0.05) g.

Key words: Rockfish (Sebastes schlegelii) Vitamin D₃ Growth Immunity Requirement

维生素D包括维生素D₂和维生素D₃，维生素D₃是维生素D最重要的表现形式，仅存在于动物体内(李向等, 2021)。与哺乳动物不同，鱼类由于长期生活在水中，对光线的吸收能力较差，因此，鱼类体内的维生素D₃不能经由皮肤中的维生素D₃原经紫外线照射转化而来，只能从饲料中直接获取。维生素D₃可以维持鱼类体内矿物质的稳态、参与机体内分泌等(Lock et al, 2010)，还可以影响免疫细胞的增殖和凋亡(Calton et al, 2015)。

目前，有关鱼类对维生素D₃需求量的报道并不多，且不同鱼类对维生素D₃的需求量差异较大。研究表明，斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)、鲈鱼(Lateolabrax japonicus)和黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)对维生素D₃的需求量分别为2250、431和16 600 IU/kg饲料(张璐等, 2016; 谢诗玮等, 2019; 郭勋等, 2020)。维生素D₃缺乏时，部分鱼类会出现佝偻病、骨骼异常、钙平衡紊乱等症状(Haga et al, 2004; Taveekijakare et al, 1996)；维生素D₃过量时，部分鱼类会出现生长缓慢且中毒症状(Barnett, 1982; Andrews et al, 1980)。

许氏平鲉(Sebastes schlegelii)又名黑头，属鲉形目(Scorpaeniformes)，是一种冷水性近海底层肉食性鱼类，因其肉质爽口、抗病力强、生长快速等优点，深受人们的喜爱，在我国北方网箱养殖规模也逐年增加(李宝山等, 2019)。目前，对许氏平鲉幼鱼维生素的研究仅在维生素B₆ (周莹等, 2020)、维生素C (Bai et al, 1996)和维生素E (Bai et al, 1998)，维生素D尚无研究。本研究通过添加不同含量的维生素D₃，探究其对许氏平鲉幼鱼生长、体组成和机体免疫能力的影响，以确定许氏平鲉幼鱼对维生素D₃的最适需求量，为其配合饲料的开发提供参考。

1 材料与方法 1.1 实验饲料

本实验以白鱼粉为主要蛋白源，玉米油为主要脂肪源，设计粗蛋白约为50%、粗脂肪约为10%的基础饲料配方。在基础饲料中分别添加0、500、1000、2000、4000和8000 IU/kg的维生素D₃ (500 000 IU/g)，配制维生素D₃含量为707、1254、1740、2513、4519和8671 IU/kg的6种等氮等脂饲料，分别命名为D1、D2、D3、D4、D5和D6组，其中，D1为对照组。饲料配方及营养组成见表 1。

表 1 饲料配方及营养组成(%风干基础) Tab.1 Formulation and nutritional composition of the experimental diets (% air-dry matter basis)

饲料制作时，将所需原料粉碎过80目筛，按配比称重后，逐级扩大混合均匀，将鱼油和玉米油提前混好倒入其中搅拌均匀，再加入适量蒸馏水混合好，用小型螺旋饲料挤压机将饲料制成粒径为2和4 mm的颗粒，60℃烘干后，用塑料袋密封保存备用。

1.2 实验用鱼及饲养管理

本研究在山东省海洋资源与环境研究院鱼房循环水养殖系统中进行。实验鱼购自山东荣成裕源祥水产有限公司。正式实验前暂养于绿色圆形养殖桶(桶高为80 cm，直径为70 cm，水深为50 cm)，期间投喂对照组(D1)饲料，2周后挑选600尾规格均匀、体质良好的许氏平鲉幼鱼(20.95±0.05) g，随机分配至24个桶，每桶25尾。每种饲料随机投喂4桶实验鱼(其中1桶用于攻毒实验)，养殖时间为8周。每天定时定量(08:00和16:00)投喂2次，初始投喂量按照鱼体质量的1%进行投喂，观察每日摄食情况，按照需要调整次日投喂量。记录死鱼重量和数量。养殖期间水质符合以下条件：水温为16~18℃，溶氧(DO) > 6.0 mg/L，pH为7.5~8.2，盐度为27~28，氨氮和亚硝态氮 < 0.05 mg/L。

1.3 攻毒实验

养殖实验结束后，攻毒实验桶挑选20尾体质量基本一致的许氏平鲉幼鱼，进行攻毒实验。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)由中科院烟台海岸带研究所提供。攻毒实验前进行预实验确定许氏平鲉的致病浓度为6×10³ CFU/g鱼体质量。许氏平鲉幼鱼感染哈维氏弧菌以后，表现为鳞片脱落、鳍部和鳃部发红并伴有创伤溃疡。正式攻毒实验，每尾鱼经腹腔注射0.9×10⁶ CFU/mL的菌液0.2 mL。4 h后观察许氏平鲉是否发病，记录发病的鱼尾数。攻毒48 h后, 每桶随机取3尾病鱼，尾静脉取血后，无菌环境下解剖，取肝尖和头肾放入灭菌离心管后，再投入液氮中。血清、头肾和肝脏于–80℃冰箱中保存。

1.4 样品采集及分析

养殖实验结束后，禁食24 h，记录每个桶鱼的总体质量和数量，每桶随机取8尾鱼用于体质量及体长的测量后，进行尾静脉取血，将鱼解剖后分离出内脏团、肝脏和肠，分别称其质量，然后用解剖刀将肌肉切下。将8尾解剖过的鱼放入恒温水浴锅中85℃煮8 min左右，分离脊椎骨，然后将其浸泡于超纯水中并用牙刷洗刷去掉周围肌肉组织和毛细血管，氯仿–甲醇溶液脱脂后于105℃烘箱中烘24 h，保存在干燥器中备用。另取7尾全鱼测定鱼体常规成分。全鱼、背肌、肝脏及血清样品置于–20℃条件下保存，待测。

实验饲料及样品中水分采用105℃恒重法测定(GB/T 6435-2014)，粗脂肪采用索氏抽提法测定(GB/T 6433-2006)，粗蛋白采用凯氏定氮法测定(GB/T 6432-2018)，粗灰分采用550℃失重法测定(GB/T 6438-2007)，能量采用燃烧法测定(IKA, C6000, 德国)。脊椎骨中钙含量采用国标中高锰酸钾滴定法测定。

血清总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、补体3(C₃)、补体4(C₄)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、钙离子(Ca²⁺)含量、磷(Pi)含量均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。

使用Trizol法提取总RNA，并用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。根据本实验室所得的许氏平鲉转录组数据，找到热休克蛋白(HSP70)、髓样分化因子88 (MYD88)、肿瘤坏死因子受体活化因子6 (TRAF6)、白细胞介素受体相关激酶4 (IRAK4)和Toll样受体2 (TLR2)的基因序列，NCBI Nucleotide BLAST进行同源性比对分析，确定同源性较高的基因序列，利用Primer 5.0软件设计引物，选用RPL17作为内参基因(Ma et al, 2013)，引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如表 2所示。并结合2^–∆∆Ct法分析上述基因的相对表达水平。

表 2 基因表达的引物序列 Tab.2 Primer sequences for gene expression

1.5 指标计算

$ 增重率\text{(weight gain rate, WGR, %)}=(鱼体终末体质量–鱼体初始体质量)/鱼体初始体质量×100 $

$ 特定生长率\text{(specific growth rate, SGR, %/d)}= (\ln 鱼体终末体质量–\ln 鱼体初始体质量)/养殖周期×100 $

$ 饲料系数\text{(feed conversion ratio, FCR)}=摄食饲料量/(鱼体终末体质量–鱼体初始体质量) $

$ 肥满度\text{(condition factor, CF)}=鱼体终末体质量/体长^{3}×100 $

$ 脏体比\text{(viscerosomtic index, VSI, %)}=内脏团重/鱼体终末体质量×100 $

$ 肝体比\text{(hepatosomatic index, HSI, %)}=肝脏重/鱼体终末体质量×100 $

$ 存活率\text{(survival rate, SR, %)}=终末鱼尾数/初始鱼尾数×100 $

1.6 数据统计与分析

采用统计软件SPSS 21.0对所有数据进行单因素方差分析。差异显著(P < 0.05)用Duncan’s检验法进行多重比较分析，数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示。使用GraphPad 8软件进行绘图。采用折线模型拟合数据，确定许氏平鲉幼鱼对饲料中维生素D₃的最适需求量。

2 结果 2.1 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼生长和形体指标的影响

由表 3可知，随着维生素D₃含量的升高，许氏平鲉幼鱼WGR和SGR均先升后降，D4组有最大值且显著高于其他组(P < 0.05)，FCR先降后升，D4组显著低于对照组(P < 0.05)，VSI和HSI降低，实验组(D2-D6)显著低于对照组(D1) (P < 0.05)。各组CF、存活率(SR)无显著性差异(P > 0.05)。

表 3 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼生长和形体指标的影响 Tab.3 Effects of vitamin D₃ on growth performance and body indices of juvenile S. schlegelii

以WGR为评价指标，经折线模型分析后得许氏平鲉幼鱼(20.95±0.05) g对饲料中维生素D₃的需求量为2 223.45 IU/kg(图 1)。

图 1 许氏平鲉幼鱼增重率与饲料中维生素D₃含量的折线回归关系 Fig.1 The broken-line regression analysis based on weight gain rate and dietary vitamin D₃ of juvenile S. schlegelii

2.2 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼鱼体常规成分的影响

由表 4可知，维生素D₃含量对全鱼水分、粗蛋白和粗灰分均无显著性影响(P > 0.05)，全鱼粗脂肪在D5组有最大值，D3、D4、D5和D6组显著高于对照组和D2组(P < 0.05)。

表 4 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼鱼体常规成分的影响(%湿重) Tab.4 Effects of vitamin D₃ on proximate composition of juvenile S. schlegelii (% wet weight)

维生素D₃含量对许氏平鲉幼鱼肌肉水分、粗灰分无显著影响(P > 0.05)。肌肉粗蛋白先下降后升高，D6组显著高于D3和D4组(P < 0.05)。肌肉粗脂肪在D5组有最大值且显著高于其他组(P < 0.05)。

许氏平鲉幼鱼脊椎骨粗灰分含量随着饲料中维生素D₃含量的增加而增加，D3~D6组显著高于对照组(P < 0.05)。钙含量随着维生素D₃含量的增加而增加(P < 0.05)。

2.3 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼血清生化指标的影响

由表 5可知，随着维生素D₃含量的升高，许氏平鲉幼鱼血清中T-AOC和SOD活力均先升高后降低，D4组有最大值；MDA先降低后升高，D4组显著低于对照组；C₃先上升后下降，实验组显著高于对照组(P < 0.05)；ALT和AST均先下降后上升，D4组有最小值；T-CHO和TG均在D5组有最大值，显著高于D1组(P < 0.05)。Ca²⁺含量随着维生素D₃含量的升高而升高，实验组显著高于对照组(P < 0.05)。Pi和C₄含量不受维生素D₃含量的影响(P > 0.05)。

表 5 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼血清生化指标的影响 Tab.5 Effects of vitamin D₃ on serum biochemical parameters of juvenile S. schlegelii

2.4 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼攻毒后发病率的影响

由表 6可知，随着维生素D₃含量的增加，许氏平鲉幼鱼累积发病率逐渐降低，对照组累积发病率达到最高，D4组累积发病率最低。

表 6 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼攻毒后发病率的影响 Tab.6 Effects of vitamin D₃ on incidence rate of juvenile S. schlegelii after challenge

2.5 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼攻毒前后血清抗氧化和免疫酶的影响

与攻毒前相比较，攻毒后随着维生素D₃含量的增加，许氏平鲉幼鱼T-AOC，MDA、C₃和C₄含量显著增加，T-AOC在D4组达到最高(图 2A)；MDA含量呈先下降后上升的趋势，D4组有最小值(图 2B)；C₃和C₄含量先上升后下降，均在D4组有最大值(图 2C、D)。

图 2 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼攻毒前后血清T-AOC、MDA、补体3和补体4的影响 Fig.2 Effects of vitamin D₃ on serum T-AOC、MDA、complement C₃ and C₄ of juvenile S. schlegelii before and after challenge 小写字母不同表示攻毒前后组间差异显著(P < 0.05)，大写字母不同表示攻毒前后组内差异显著(P < 0.05)。 Different lowercase letters indicate significant difference between groups before and after challenge (P < 0.05), different uppercase letters indicate significant difference within group before and after challenge (P < 0.05).

2.6 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼攻毒前后肝脏和头肾相关基因表达量的影响

由表 7可知，随着维生素D₃含量的增加，许氏平鲉幼鱼肝脏应激基因(HSP70)和免疫基因(MYD88、TRAF6、IRAK4和TLR2)在攻毒前后均先上升后下降；与攻毒前相比，攻毒后基因表达量显著高。随着维生素D₃含量的增加，攻毒前许氏平鲉肝脏HSP70和MYD88基因表达量均在D4组有最大值并显著高于对照组(P < 0.05)，攻毒后肝脏HSP70和MYD88基因表达量均在D5组达到最高；攻毒前后肝脏IRAK4和TRAF6基因表达量均在D4组有最大值并显著高于对照组(P < 0.05)；攻毒前D4和D5组TLR2基因表达量差异不显著并显著高于其他组，攻毒后D5组TLR2基因表达量有最大值并显著高于其他组(P < 0.05)。

表 7 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼攻毒前后肝脏相关基因表达量的影响 Tab.7 Effects of vitamin D₃ on liver related genes expression in juvenile S. schlegelii before and after challenge

由表 8可知，随着维生素D₃含量的增加，许氏平鲉幼鱼头肾应激基因(HSP70)和免疫基因(MYD88、TRAF6、IRAK4和TLR2)在攻毒前后均先上升后下降；与攻毒前相比，攻毒后基因表达量显著高。随着维生素D₃含量的增加，攻毒前后头肾HSP70、MYD88和IRAK4基因表达量均在D4组达到最高并显著高于对照组(P < 0.05)；攻毒前后头肾TRAF6基因表达量均随着维生素D₃含量的增加而增加，均在D5组达到最高；攻毒前头肾TLR2基因表达量实验组显著高于对照组(P < 0.05)，攻毒后在D4组达到最高。

表 8 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼攻毒前后头肾相关基因表达量的影响 Tab.8 Effects of vitamin D₃ on head kidney related genes expression in juvenile S. schlegelii before and after challenge

3 讨论 3.1 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼生长及体组成的影响

研究表明，饲料中添加适宜的维生素D₃可提高鲈鱼、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和斑点叉尾 (Ietalurus Punetaus)的生长(张璐等, 2016; Barnett, 1982; Andrews et al, 1980)，缺乏维生素D₃会降低杂交罗非鱼(Oreochromis mossambicus)的食欲(Shiau et al, 1993)，维生素D₃过量时，溪鳟(Salvelinus fontinalis)会表现出生长缓慢和中毒等现象(Poston, 1969)，但对大西洋鲑(Salmo salar)和黄颡鱼的WGR和SGR等均无显著影响(Horvli et al, 2015; 段鸣鸣等, 2014)。本研究表明，不同的维生素D₃含量会显著影响许氏平鲉的WGR、SGR和FCR。对照组的WGR和SGR都显著低于实验组，说明过低的维生素D₃含量不能满足实验鱼的生长，当饲料中维生素D₃含量为2513 IU/kg时许氏平鲉幼鱼生长最好。本实验维生素D₃含量最高组只表现出生长缓慢并未表现出中毒现象，表明8671 IU/kg的维生素D₃不会对许氏平鲉造成毒害。适宜含量的维生素D₃可以显著降低实验鱼的FCR、HSI和VSI，这与青鱼(Mylopharyngodon piceus)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)和斜带石斑鱼的研究结果相一致(吴成龙等, 2015; 王可宝, 2011; 谢诗玮等, 2019)。本实验中SR无显著差异，与吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)的研究结果一致(喻丽娟等, 2018)。但对杂交罗非鱼的研究表明，饲料中添加维生素D₃的实验组的死亡率显著低于对照组(Shiau et al, 1993)，出现不同结果的原因可能是鱼类、大小、养殖周期和养殖环境不相同导致。

多数鱼类维生素D₃的需求量现已确定，本研究以WGR为评价指标，许氏平鲉幼鱼维生素D₃的需求量为2 223.45 IU/kg。这与斜带石斑鱼的需求量类似(2250 IU/kg) (谢诗玮等, 2019)。高于吉富罗非鱼(259.8 IU/kg)和鲈鱼(431.0 IU/kg)等鱼类的需求量(喻丽娟等, 2018; 张璐等, 2016)。低于黄颡鱼的需求量(16 600 IU/kg, 郭勋等, 2020)。这与鱼的种类、实验饲料、实验环境、实验周期等有关。

随着维生素D₃添加量的增加，全鱼和肌肉粗脂肪先上升后下降，说明饲料中添加维生素D₃影响了许氏平鲉幼鱼的脂肪代谢，但影响脂肪代谢的机理还需进一步研究。全鱼和肌肉粗灰分无显著性差异，但添加维生素D₃的实验鱼的粗灰分高于对照组，表明维生素D₃促进了矿物质在体内的沉积。全鱼水分、粗蛋白和肌肉水分无显著性差异，这一结果与吉富罗非鱼的研究结果相似(喻丽娟等, 2018)，说明水分和粗蛋白对于维生素D₃是不敏感指标。

研究表明，饲料中维生素D₃含量适宜，对骨骼矿化和钙沉积有促进作用，低于或高于适宜含量，都会使骨骼矿化异常(杨玉菊, 2001)。本研究中，随着维生素D₃添加量的增加许氏平鲉幼鱼脊椎骨粗灰分和钙含量呈增加的趋势，与鲈鱼幼鱼、虹鳟和皱纹盘鲍(Salmo gairdneri)的研究结果一致(张璐等, 2016; Barnett, 1982; 周歧存等, 2004)，说明维生素D₃对钙的代谢途径具有间接或直接的调节作用，从而促进鱼体的生长。

3.2 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼血清生化指标的影响

T-AOC是反应血液抗氧化能力的重要指标。本研究中，T-AOC随着维生素D₃添加量的增加而增加，在维生素D₃含量为2513 IU/kg时最强，说明2513 IU/kg维生素D₃有利于提高许氏平鲉幼鱼血清中T-AOC。SOD呈相同的变化趋势，MDA则呈相反的变化趋势，这一结果说明，饲料中添加维生素D₃可以提高机体抗氧化能力。血清ALT和AST是反应肝脏是否健康的重要指标(李彦等, 2008; 王宝恩, 1996)，本研究中，ALT和AST随着维生素D₃添加量的增加呈先下降后上升的趋势，说明添加维生素D₃对许氏平鲉幼鱼肝脏具有保护作用。血清T-CHO随着维生素D₃添加量的增加先升高后下降，与吉富罗非鱼和团头鲂的研究结果相似(喻丽娟等, 2018; 王可宝, 2011)，表明适量的维生素D₃促进了鱼类肝脏中脂肪的代谢，过量的维生素D₃可能会影响肝脏代谢脂肪的能力，使脂肪代谢受阻，导致进入血清的T-CHO减少，但是影响机理还有待进一步研究。以上3组指标均表明，饲料中添加过量的维生素D₃会影响肝脏的生理功能。血脂与全鱼粗脂肪沉积是正相关关系，说明维生素D₃促进实验鱼的生长可能与促进其对脂肪的利用有关。维生素D₃主要通过提高肠道和肾小管上皮对钙的吸收，促使血清Ca²⁺上升(张桐, 2011)。本研究中，血清Ca²⁺呈增加趋势。维生素D₃可促使补体免疫系统活性增强。本研究中，添加维生素D₃的实验组C₃和C₄含量显著高于对照组，研究表明，添加维生素D₃可以增强机体的免疫能力。

3.3 维生素D₃对许氏平鲉幼鱼攻毒后保护率和血清酶活性的影响

维生素D₃促使水产动物免疫能力增强，本研究中，许氏平鲉幼鱼感染哈维氏弧菌后实验组累积发病率低于对照组，说明维生素D₃增强了许氏平鲉抵抗病原菌的能力。

随着维生素D₃含量的增加，许氏平鲉幼鱼攻毒后血清T-AOC和MDA明显增加，T-AOC先升高后降低，MDA呈相反的变化趋势，说明许氏平鲉幼鱼受哈维氏弧菌侵袭后体内自由基和活性氧增多，T-AOC增强，脂质过氧化物增加，MDA含量升高。T-AOC在D4组活性最强，MDA含量在D4组最低，说明许氏平鲉幼鱼在感染哈维氏弧菌后饲料中维生素D₃含量在2513 IU/kg时有利于提高机体的总抗氧化能力。

补体是反应机体抵抗病原菌侵袭和炎症反应的重要指标(Lambris et al, 1989)。本研究中，在哈维氏弧菌作用下，血清C₃和C₄的含量显著增加，实验组C₃含量显著高于对照组和D2组，实验组C₄含量显著高于对照组，出现该结果的原因可能是许氏平鲉幼鱼受哈维氏弧菌感染后血清中C₃和C₄含量增加用以增强机体抵抗病原菌的能力，缺乏维生素D₃的对照组和D2组抵抗病原菌的能力减弱。

3.4 维生素D₃对攻毒前后应激基因与免疫基因表达量的影响

热休克蛋白又称热应激蛋白，是生物有机体在受到刺激后，发生热休克反应时产生的一种伴随细胞蛋白(Kiang et al, 1998)。本研究中，不同水平的维生素D₃含量在攻毒前后均会显著影响HSP70 mRNA在肝脏和头肾中的表达，且攻毒后HSP70 mRNA表达量显著高于攻毒前，说明饲料中添加维生素D₃有利于提高许氏平鲉的抗应激能力。Toll样受体(TLRs)是一种病原体识别分子的受体，参与免疫系统的信号转导过程(范泽军等, 2015)。TLRs能够与配体结合形成二聚体，通过上游的接头蛋白MYD88与其下游IRAK4和TRAF6等相结合，最终激活核因子(NF-kB)进入细胞核中，诱发炎症因子和促炎症因子的表达。本研究中，不同水平的维生素D₃含量在攻毒前后均会显著影响MYD88、IRAK4、TRAF6和TLR2 mRNA在肝脏和头肾中的表达，以上基因在不同组织中的表达和饲料中维生素D₃含量有关，这一结果说明饲料中添加适宜的维生素D₃可以促进应激基因和免疫基因的表达，进而增强许氏平鲉幼鱼对病原菌的抵抗能力。本研究与黄鳝(Monopterus albus)、金头鲷(Sparus auratus)和欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)等研究结果相似(黎德兵等, 2014; Cerezuela et al, 2008; Rebeca et al, 2009)，更进一步说明了适宜的维生素D₃可以促进相关免疫基因在不同组织中的表达。

4 结论

综上所述，维生素D₃是许氏平鲉幼鱼维持体内矿物质稳态和生长发育的必需营养物质。适宜的维生素D₃添加量可以提高许氏平鲉幼鱼抗氧化和免疫能力。以WGR为评价指标，(20.95±0.05) g的许氏平鲉幼鱼对维生素D₃的最适需求量为2 223.45 IU/kg饲料。

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