刀鲚(Coilia nasus)俗称刀鱼,是我国长江流域一种典型的江海洄游名贵鱼类,自古至今一直享有“长江三鲜”的美誉(袁传宓等, 1976; 施永海等, 2014)。近年来,由于长江水域环境变化和非法过度捕捞等原因而导致刀鲚数量迅速减少,至2012年,长江刀鲚产量为5750 kg,降至历史最低点(徐钢春等, 2016)。鉴于长江流域野生刀鲚资源的不断减少和已不能形成优势种群,自2019年2月1日起,我国农业农村部已禁止天然刀鲚的生产性捕捞。同时,为填补长江刀鲚资源衰减的漏洞,上海市水产研究所一直致力于刀鲚人工繁育和养殖技术的研究,并于2011年成功突破了刀鲚室内全人工养殖技术,但刀鲚的养殖产量极低(施永海等, 2014; 徐钢春等, 2016)。为提高刀鲚的人工养殖产量,在实际养殖过程中,需要选择合适的养殖环境,以保障在安全养殖条件下获取最大渔产量。因此,探究刀鲚在半咸水和淡水养殖条件下的生长性能及消化、抗氧化、非特异性和代谢能力的变化,对确定刀鲚的养殖条件,提高刀鲚的人工养殖技术及产量具有重要意义。
目前,刀鲚人工养殖的相关研究还处于发展初级阶段(魏广莲等, 2012; 闻海波等, 2009),国内外有关刀鲚的研究主要集中于其性腺发育(Xu et al, 2011; 徐钢春等, 2011a)、苗种繁殖技术(徐钢春等, 2016; 施永海等, 2015)、肌肉营养成分(唐雪等, 2011; 李丽等, 2019)及生长性能(袁新程等, 2021; 董文霞等, 2014; 徐钢春等, 2011b)等方面,至今尚未报道半咸水养殖条件对刀鲚的消化、抗氧化、非特异性免疫和代谢能力影响的相关研究。因此,开展半咸水养殖对刀鲚生理、生化指标影响的研究具有十分重要的现实意义。本实验开展了半咸水和淡水养殖对刀鲚消化酶、抗氧化酶、非特异性免疫酶及代谢酶影响的研究,以期为刀鲚的人工养殖技术提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验所用刀鲚是上海市水产研究所奉贤科研基地(以下简称奉贤科研基地)于2019年全人工集约化繁育而成,并经过室外池塘养殖培育1年后的同一批鱼种。实验用水为经过池塘、蓄水池沉淀、60目筛网过滤的当地内河水和自然海水(杭州湾自然海水,盐度为8.7~12.5)。实验池塘呈长方形,为南北方向泥底池塘,面积为0.17 hm2,平均水深为1.8 m,每口池塘装配1台叶轮式增氧机(功率1.5 kW),实验开始前,使用漂白精进行清塘和消毒,清除杂鱼、杂虾。
1.2 实验设计与养殖管理养殖实验于2020年3月17日—10月20日在奉贤科研基地的露天方形泥底池塘中进行,设置2个组,即半咸水养殖组(杭州湾自然海水,盐度为8.7~12.5)和淡水养殖组(对照组),每组1口养殖池塘(面积为0.17 hm2),共计2口池塘。每口池塘放养500尾刀鲚,套养于暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)池塘中。在刀鲚放养之前,实验池塘先进行生物饵料的培养,在放养刀鲚的前7 d,向池塘进水至平均水深为180 cm,之后每天中午开启增氧机2 h,连续培养7 d,待每口池塘水体中的生物饵料(枝角类、桡足类、小糠虾等)量达到50 ind./L时开始放养刀鲚进行养殖实验。
实验期间,不投喂其他配合饲料,均以本池塘中活生物饵料为食,并每5 d对实验池塘水体中的活生物饵料进行1次检测,保证每口池塘水体中活饵料生物量>5 ind./L,当发现不足时,及时从其他培育池塘中捞取活生物饵料进行补给。养殖期间,每14 d换水1次,每次换水1/3。实验期间,每天18:30开启增氧设备至次日06:00将其关闭(下雨等恶劣天气,适当延长开增氧机的时间),自然水温为15.6~32.4℃,pH为8.22~8.63,溶解氧(DO)≥6.95 mg/L,总氨氮(TAN)≤0.25 mg/L,亚硝酸盐氮(NO2–-N)≤0.13 mg/L。
1.3 取样与酶活力测定方法养殖实验结束后,每组随机采取12尾刀鲚并随机分成3个重复,每个重复取4尾刀鲚为一个样本。先使用0.5 mg/L MS-222对取样刀鲚进行麻醉,再用清水清洗干净,擦干体表水分后放于冰盘之上,进行解剖并小心取出肝、肠、胃和盲囊4种器官,用事先冷却过的0.86%生理盐水(4℃)清洗后,使用干净滤纸擦干表面水分,整个操作过程均在冰盘上进行,将取出的样品分装后暂存在–80℃冰箱中待测。在酶活力测定前,先将冷冻样品置于4℃冰柜中进行解冻,然后移入事先预冷的5 mL离心管中,加入9倍体积的事先冷却过的0.86%生理盐水,在冰浴环境下进行研磨,制备10%匀浆液,并置于2500 r/min的低温离心机(4℃)中离心10 min,吸取上层液体,即刻测定其各酶活力指标和总蛋白含量。
刀鲚内脏样品中消化、抗氧化、非特异性免疫及代谢酶活力和其总蛋白含量的测定,均使用购自南京建成生物工程研究所生产的试剂盒。淀粉酶(Amylase, AMS)试剂盒(碘—淀粉比色法)、脂肪酶(Lipases, LPS)试剂盒(比色法)、胃蛋白酶(Pepsin, PPS)试剂盒、胰蛋白酶(Trypsin, TPS)测试盒、过氧化氢酶(Catalase, CAT)测试盒(可见光法)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)测试盒(羟胺法)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-PX)测试盒、A059-1碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)试剂盒(可见光比色法)、酸性磷酸酶(Alanine aminotransferase, ACP)测试盒(可见光比色法)、谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)测试盒(赖氏法)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)试剂盒(TBA法)以及谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)试剂盒(比色法),使用考马斯亮蓝法检测刀鲚内脏样品中总蛋白质含量。本研究中,所有酶活力及总蛋白质含量测定步骤和计算方法均严格按照测试盒的说明书进行。
1.4 生长性能指标测定计算生长性能参数计算参考敬庭森等(2021),具体方法如下:
$ 体长相对增长率(\text{relative length growth rate, LGR}, \%) = (L_{T} – L_{0})/L_{0} ×100\% $ | (1) |
$ 体重相对增长率(\text{relative weight gain rate, WGR}, \%) = (W_{t }– W_{0})/W_{0} ×100\% $ | (2) |
$ 肥满度(\text{condition factor, CF}) = W_{t }/(L_{t})^{3} × 100 $ | (3) |
$ 存活率(\text{survival rate, SR}, \%) = 100\%×(N_{T}/N_{0}) $ | (4) |
$ 特定生长率(\text{specific growth ratio, SGR}, \%/d)= [\ln(W_{t}) – \ln(W_{0})]/t×100\% $ | (5) |
式中,L0为实验开始时刀鲚的体长;Lt为实验结束时刀鲚的体长;W0为实验开始时刀鲚的体重;Wt为实验结束时刀鲚的体重;t为养殖时间;N0为实验初始时刀鲚的数量;Nt为实验结束时刀鲚存活的数量。
1.5 数据处理和统计使用Excel 2007软件整理实验数据,运用SPSS 17.0软件对同一养殖条件下,刀鲚不同内脏器官间酶活力大小进行单因素方差(one-way ANOVA)分析及Duncan氏法多重比较,对2种养殖条件下刀鲚生长指标及酶活力进行独立样本t检验和比较其大小差异显著性。所得结果均以平均值±标准差(mean±SD)来表示,P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 半咸水养殖对刀鲚生长性能的影响半咸水和淡水刀鲚池塘的养殖情况见表 1。从表 1可以看出,半咸水刀鲚和淡水刀鲚的初始体长和初始体重相比均无显著差异(P > 0.05),而经过213 d的养殖,半咸水刀鲚的末体长和末体重均显著大于淡水刀鲚(P < 0.05)。从表 2可以看出,半咸水刀鲚的LGR、WGR、CF和SGR均显著大于淡水刀鲚(P < 0.05),各实验组SR相比无显著差异。结果表明,在半咸水养殖条件下,刀鲚的生长速度较快。
半咸水养殖对刀鲚内脏中AMS活力的影响见表 3。从表 3可以看出,半咸水刀鲚的盲囊和肠中AMS活力均明显大于肝和胃中AMS活力(P < 0.05),但盲囊和肠之间、肝和胃之间AMS活力相比均无显著差异(P > 0.05)。而半咸水养殖条件下的刀鲚各内脏器官中,AMS活力虽略有升高但相比均无显著差异(P > 0.05)。与半咸水刀鲚不同的是淡水刀鲚的4种内脏器官间相比均存在显著差异,盲囊中AMS活力显著大于肠(P < 0.05),肠中AMS活力显著大于胃(P < 0.05),胃中AMS活力显著大于肝(P < 0.05),半咸水和淡水刀鲚4种内脏器官AMS活力大小顺序均为盲囊 > 肠 > 胃 > 肝,表明AMS主要储存在盲囊和肠中,并对淀粉的消解起到重要作用。
半咸水和淡水刀鲚内脏中蛋白酶活力的影响见表 4。从表 4可以看出,盲囊中蛋白酶活力最高,均明显大于肝、肠、胃中蛋白酶活力(P < 0.05);其次,肠中蛋白酶活力也明显大于肝、胃中蛋白酶活力(P < 0.05),但肝和胃中蛋白酶活力相比无显著差异(P > 0.05)。2种刀鲚内脏中,蛋白酶活力大小顺序均为盲囊 > 肠 > 胃 > 肝脏,表明蛋白酶主要存在刀鲚的盲囊和肠中并发挥重要作用。而在2种不同养殖条件下,半咸水养殖条件均导致了刀鲚的蛋白酶活力升高,其中,半咸水刀鲚肝和胃中蛋白酶活力均显著大于淡水刀鲚,而盲囊和肠的蛋白酶活力相比无显著差异(P > 0.05)。表明半咸水养殖可提高刀鲚蛋白酶的活力,可能会引起刀鲚摄食习性和摄食量的改变。
半咸水和淡水刀鲚内脏中LPS活力影响见表 5。从表 5可以看出,淡水刀鲚盲囊中LPS活力最高,并显著大于肝和胃中的LPS活力(P < 0.05),但与肠中LPS活力相比无显著差异(P > 0.05)。半咸水刀鲚中LPS活力最高的是肠,其次为盲囊,二者均显著大于肝脏的LPS活力,而与胃中LPS酶活力相比无显著差异(P > 0.05),表明LPS活力主要存在刀鲚的盲囊、肠中,并在其中发挥重要作用。而在4种内脏器官中,半咸水养殖对刀鲚的肝和盲囊具有显著影响,而对胃和肠均未产生显著影响。其中,半咸水刀鲚的肝和盲囊中,LPS活力均显著低于淡水刀鲚(P < 0.05),表明半咸水养殖条件可显著降低刀鲚肝和盲囊的LPS活力。
半咸水养殖对刀鲚肝脏中抗氧化酶活力的影响见表 6。从表 6可以看出,淡水刀鲚的CAT活力均值为111.24 U/mg prot,显著大于半咸水刀鲚(24.47 U/mg prot) (P < 0.05)。而半咸水刀鲚的SOD、GSH-PX活力和MDA含量均显著大于淡水刀鲚(P < 0.05),分别为148.35、26.67 U/mg prot和7.42 nmol/mg prot。结果表明,半咸水养殖条件可促进刀鲚机体中SOD和GSH-PX活力提高,可提升刀鲚鱼体的抗氧化力。
半咸水养殖对刀鲚肝脏中AKP、ACP和ALT、AST活力的影响见表 7。从表 7可以看出,半咸水刀鲚肝脏中AKP和ACP活力均显著低于淡水刀鲚(P < 0.05),表明刀鲚在半咸水养殖条件下受到的威胁较少,所以,其肝脏中AKP和ACP活力较低。在半咸水和淡水2种养殖环境下,刀鲚肝脏中AST和ALT活力也发生了相应变化。从表 7还可以看出,半咸水刀鲚的AST活力大于淡水刀鲚,但差异不显著(P > 0.05);而ALT活力显著低于淡水刀鲚(P < 0.05)。表明在半咸水养殖条件下,对刀鲚的AST活力无显著影响,但会显著降低ALT活力。
盐度作为影响鱼类生长和存活的重要外部因子,当鱼类处在适宜盐度条件下,其生长性能会达到最好状态(袁新程等, 2020)。本研究显示,在半咸水(盐度为8.7~12.5)养殖条件下,刀鲚的生长速度显著大于淡水刀鲚,SR相比无明显差别,这表明刀鲚更适于在半咸水中生长,这与罗海忠等(2015)研究的四指马鲅鱼(Eleutheronema tetradactylum)在盐度为2~10的水体中生长较适宜,而在淡水中生长缓慢的结果相似。
由于养殖水环境的不同会导致鱼体内消化酶活力改变(杨静雯等, 2019),而消化酶作为鱼类生理系统的重要参与者,其活力大小决定了鱼体对外界营养物质消化、吸收能力的大小,进而影响鱼类的正常生长(Lundstedt et al, 2004; 唐黎等, 2007)。因此,可通过检测鱼体内消化酶活力的大小,以确定在不同养殖条件下鱼体的消化生理状况。本研究发现,在半咸水刀鲚的内脏器官中,AMS活力均比淡水刀鲚的高,胃和肝脏中蛋白酶活力均显著增大,表明刀鲚在半咸水养殖条件下的消化能力强于淡水养殖,这与半咸水刀鲚生长速度快于淡水刀鲚的结果相一致。推测导致此结果的原因,一方面是在半咸水养殖条件下,刀鲚为了平衡机体内外盐度差异,需要机体提供更多能量进行渗透压调节,因此,半咸水养殖刀鲚的机体需要更高的消化酶来消化食物,所以,半咸水刀鲚内脏器官中的AMS和蛋白酶活力会升高;另一方面是半咸水水体中的活饵料[蒙古裸腹溞(Monia mongolica Daday)、糠虾、小野杂鱼等]和淡水水体中的活饵料[多刺裸腹溞(Moina macrocopa)、大型溞、小河虾等]不同,这可能引起了刀鲚摄食习性和摄食量的改变,从而导致消化酶活力的改变。这与杨静雯等(2019)研究的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和硬头鳟(Salmon gairdneri)均在盐度为5和10时的消化酶活力最大,袁新程等(2020)研究发现的褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)在盐度为7.5~10.0时,AMS、TPS和PPS活性较高的研究结果相似。同时,本研究也发现,半咸水和淡水刀鲚的盲囊和肠中AMS、蛋白酶、LPS活力均显著大于胃和肝脏,表明刀鲚体内消化酶主要储存和发挥作用的场所是盲囊和肠,并且不会因低盐度环境而改变,这与邓平平等(2016)研究的刀鲚不同消化组织中,消化酶活性总体上为肠 > 盲囊 > 胃的研究结果相似。因此,半咸水养殖条件较适宜刀鲚养殖。
3.2 半咸水养殖对刀鲚抗氧化能力的影响肝脏作为鱼类重要的新陈代谢和免疫器官,不仅参与糖原的合成,而且在鱼体的抗氧化生理过程和自我防护系统中起到重要作用(张晨捷等, 2015; 郭本月等, 2017)。通常情况下,肝脏中含有3种主要的抗氧化酶即SOD、CAT和GSH-PX,其中,SOD的作用是消除鱼体内有害活性氧自由基(O2−),并通过歧化反应将其分解为H2O2和O2,而CAT或GSH-PX又均可通过催化反应将H2O2分解成无害的水,进而保护鱼体细胞免受自由基损害(丁金强等, 2013; Parihar et al, 1997)。本研究结果显示,半咸水刀鲚肝脏中SOD和GSH-PX活力均显著大于淡水刀鲚,表明半咸水养殖条件明显提升了刀鲚肝脏中SOD和GSH-PX的活力,但CAT活力出现了显著降低,造成此结果的原因,一方面是在不同盐度养殖条件下,CAT和GSH-PX活力优势存在显著不同(邓平平等, 2016),导致CAT和GSH-PX在参与H2O2降解反应中可能存在拮抗作用;另一方面可能是半咸水养殖条件下水体中的饵料生物发生改变,从而导致刀鲚体内营养结构的改变,而CAT活力对刀鲚体内营养结构改变的敏感性较强(刘永士等, 2014),所以导致CAT活力显著降低;也可能与半咸水养殖条件对刀鲚肝脏中CAT活力有抑制作用有关,这需要进一步研究验证。相似的研究结果也出现在余燕等(2009)的研究中。因此,CAT和GSH-PX活力在功能上虽存在相关性,但又相互独立的作用于不同的应激反应,对半咸水和淡水养殖条件下表现出不同的活力变化。
MDA含量作为鱼体内不饱和脂肪酸被氧化后的最后产物,其浓度高低不仅代表鱼体组织细胞受O2−损害的程度,同时,也反应了鱼体自身系统抗氧化水平的高低(Viarengo et al, 1995)。本研究中,半咸水刀鲚肝脏中MDA含量显著大于淡水刀鲚,这与SOD和GSH-PX活力均显著高于淡水刀鲚活性的结果相对应,表明半咸水养殖的刀鲚具有更高的抗氧化能力,抗逆性更强;此结果与鲜博等(2020)研究的在一定盐度养殖水体中,养殖50 d的刀鲚肝脏中MDA含量均显著大于淡水组的研究结果相一致。因此,对比半咸水刀鲚和淡水刀鲚肝脏中3种抗氧化酶(SOD、CAT和GSH-PX)活力和MDA含量可以看出,半咸水养殖条件下,刀鲚的抗氧化反应更加积极,抗氧化水平更高。因此,半咸水刀鲚比淡水刀鲚更能积极调动其自身的抗氧化系统来保护机体免受损害。
3.3 半咸水养殖对刀鲚非特异性免疫和代谢能力的影响ACP和AKP作为鱼类体内非特异免疫系统中的2种特殊的水解酶(丁金强等, 2013),它们不仅能消解体外入侵的病原体,还能加快体内吞噬细胞的吞噬作用和有害物的降解作用,因此,ACP和AKP被称为2种特殊的非特异性免疫酶(Muta et al, 1996)。在本研究中,半咸水刀鲚肝脏中ACP和AKP活力均显著低于淡水刀鲚,表明刀鲚在半咸水养殖环境中受到外界有害病原体的威胁较少,未引起ACP与AKP活力升高,所以,相较于淡水养殖而言,刀鲚更适合在半咸水中生存。这与胡利华等(2011)研究的日本鳗鲡(Anguilla japonica)养殖在一定盐度的水体中,其AKP活力会降低的研究结果相似。
AST和ALT活力主要存于鱼类肝脏组织细胞内,是鱼体内蛋白质、氨基酸代谢过程中的2种关键酶,其活力大小反应了鱼体对氨基酸的生成和降解情况(文远红等, 2013; 向枭等, 2012)。AST活力越大,表明动物体内蛋白质、氨基酸生成速度增加,分解速度减慢,有助于氮营养素在动物体内的积累;而ALT活力越大,表明动物体内尿素产生速度增加,通过尿液排出体外,从而可降低蛋白质和氨基酸代谢产生的废物对水产动物机体的损害(向枭等, 2012)。本研究中,半咸水刀鲚肝脏中AST活力大于淡水刀鲚,但差异不显著,表明半咸水养殖的刀鲚机体内蛋白质合成代谢较快,有利于其生长,但未产生明显差异。而半咸水刀鲚中的ALT活力显著低于淡水刀鲚,造成此结果的原因是刀鲚在半咸水养殖条件下,体内外环境间存在渗透压差,所以,刀鲚体内渗透压调节系统被激发,对内外渗透压进行调节,减慢尿素产生速度,以维持内外渗透压平衡(严银龙等, 2019),从而导致刀鲚机体内ALT酶活力显著降低。
4 结论半咸水养殖刀鲚生长较快,对蛋白质和淀粉的消化能力显著增强,具有更高的抗氧化能力和抗逆性,并通过调节代谢酶活力大小,减少尿素的产生和排放,维持内外渗透压平衡的同时,还减少了对养殖水质的污染。因此,相较于淡水养殖,刀鲚更适合在半咸水中养殖,建议今后可用盐度为8.7~12.5的半咸水进行刀鲚养殖。
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