鱼粉是水产养殖业的重要饲料原料之一，具有蛋白质含量高、氨基酸平衡、易被水产动物消化吸收等优点(周歧存等, 2005)。随着水产养殖业的快速发展及全球渔业资源的匮乏，鱼粉供求矛盾日益显著，因此，寻找新型鱼粉替代物并合理降低配合饲料中鱼粉使用量，成为水产饲料的重要研究课题(王裕玉等, 2019)。在肉食性鱼类的研究中，通常能将鱼粉含量降低至40%左右。研究表明，使用菌酶协同发酵豆粕可将饲料中的鱼粉含量降至40%且不会对大口黑鲈(Micropterus salmonides)的生长和饲料利用产生不利影响(陈晓瑛等, 2021)，使用复合动植物蛋白饲料可将鱼粉使用量降低至30% (谢帝芝等, 2021)。然而，随着饲料中鱼粉比例的继续降低，会出现饲料适口性下降、鱼体生长缓慢等情况。

鱼溶浆(stickwater, SW)是鱼粉加工的副产品，含有大量水溶性小分子物质，如小分子多肽、牛磺酸、高不饱和脂肪酸等，其中，牛磺酸含量是鱼粉的数倍，这些成分被视为鱼粉中的特殊营养物质或生物活性物质。本实验室前期研究发现，鱼溶浆复合其他动植物蛋白可替代饲料中40%的鱼粉(郝甜甜等, 2019)。Najafian等(2018)发现，将新鲜鱼发酵会产生多种抗氧化活性肽，可起到调节免疫系统(Adesulu-Dahunsi et al, 2020)、预防多种疾病的功效。陈晓瑛等(2021)和邓雪娟等(2019)研究也发现，一些原料经过发酵处理，其营养组成发生改变并获得微生物中间代谢产物，可进一步提高饲料鱼粉的替代水平。然而，发酵鱼溶浆(fermented stickwater, FSW)作为新型蛋白源，其在海水鱼饲料中的应用尚未见报道。鉴于此，本实验以大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼为研究对象，研究FSW替代鱼粉对其生长、抗氧化能力、蛋白质代谢及相关基因表达的影响，探讨FSW作为新型蛋白源替代鱼粉的可行性，以期为FSW在大菱鲆配合饲料中的应用提供参考。

1 材料与方法 1.1 实验材料

实验鱼溶浆(SW)购自荣成海圣饲料有限公司，水分含量为48.73%，干物质粗蛋白含量为64.08%，粗脂肪含量为8.91%。菌种选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和乳酸杆菌(Lactobacillus) (购自山东中科嘉亿生物工程有限公司)。发酵条件：温度37℃，添加1%绵白糖为辅料，枯草芽孢杆菌和乳酸杆菌(1∶1)，添加量各占鱼溶浆总质量的0.5%，发酵周期为5 d。发酵前后营养成分见表 1，SW、FSW和鱼粉(FM)的氨基酸组成见表 2。

1.2 实验饲料

以鱼粉和大豆浓缩蛋白为主要蛋白源，鱼油和豆油为脂肪源，设计鱼粉含量为50%的正对照组，鱼粉含量为30%的负对照组，在负对照组基础上分别以2% (FSW2)、4% (FSW4)、6% (FSW6)、8% (FSW8)的FSW (干物质)替代鱼粉，以玉米蛋白粉和豆油分别调节蛋白和脂肪平衡，配制成6种实验饲料，所有原料粉碎后过80目筛，逐级混匀后加入鱼油、豆油和蒸馏水再次混匀，经螺旋挤压机加工成直径为4 mm和5 mm 2种规格的饲料颗粒，所有饲料在60℃烘干后置于−20℃冰箱保存待用。实验配方和营养组成见表 3。

1.3 饲养管理

养殖实验在山东省海洋资源与环境研究院循环水养殖系统中进行。实验用大菱鲆购自山东科合海洋高技术有限公司，驯养时间为2周，驯养时投喂大菱鲆商品料。驯养结束后挑选出450尾规格整齐、体质健壮的幼鱼[(30.00±0.03) g]分成18个桶，每桶25尾鱼。每种饲料随机投喂3桶鱼，养殖周期为56 d。每天投喂2次(08:00和16:00)，初始投喂量占总体质量的1.0%左右，并根据摄食情况及时调整投喂量。投喂30 min后排残饵并记录残饵数量。驯养及实验期间确保水温为15~17℃，氨氮和亚硝酸含量 < 0.1 mg/L，pH 7.6~8.2，溶氧含量 > 5.0 mg/L，盐度28~32。

1.4 样品采集

养殖实验结束后，禁食24 h后进行采样。称重每桶鱼的总重，记录存活鱼尾数，计算增重率和成活率；每桶随机取12尾鱼，其中，3尾作为全鱼样品，6尾测体重、体长后尾静脉采血，血样于4℃静止4 h后，4000 r/min离心10 min，取血清保存于−70℃冰箱待测；采血后分离内脏团、肝脏并称重，计算脏体比、肝体比；取背部肌肉，用于常规成分分析；剩余3尾无菌条件下取其前肠，立即放入无RNA酶管中，液氮速冻后转移至−70℃超低温冰箱保存。

1.5 检测指标和分析方法 1.5.1 生长指标

$ 存活率(\text{SR, %})=100×终末鱼尾数/初始鱼尾数 $

$ 增重率(\text{WGR, %})=100×(鱼体末重–鱼体初重)/鱼体初重 $

$ 饲料系数(\text{FCR})=总摄食量/(鱼末体重–鱼初体重) $

(FCR)

$ 蛋白质效率(\text{PER, %})=100×(鱼体末重–鱼体初重)/蛋白质总摄入量 $

$ 脏体比(\text{VSI, %})=100×内脏团重/鱼体末重 $

$ 肝体比(\text{HSI, %})=100×肝脏重/鱼体末重 $

$ 肥满度(\text{CF})=100×鱼体末重/体长^{3} $

1.5.2 常规成分测定

实验饲料及实验鱼水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分分别采用105℃恒重法(GB/T6435-2014)、凯氏定氮法(GB/T6432-2018)、索氏抽提法(GB/T6433-2006)和550℃失重法(GB/T 6438-2007)测定。

1.5.3 血清和肝脏生化指标测定

丙二醛(MDA)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)、总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)均采用南京建成生物工程的试剂盒进行测定，蛋白激酶A (PKA)、蛋白激酶C (PKC)采用ELISA试剂盒测定，组织蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定，酶活性单位参照试剂盒说明书。

1.5.4 肠道氨基酸转运载体和小肽转运载体表达量的测定

采用Trizol法提取肝脏总RNA，用微量紫外分光光度计检测总RNA浓度后，按照Prime Script反转录试剂盒(TaKaRa)进行反转录(表 4)。反转录的cDNA置于–70℃保存，用于检测氨基酸转运载体b0at1、cat1、pat1和小肽转运载体pept1的表达量。以β-actin为内参基因，实时荧光定量结果采用2^−ΔΔCt法进行计算。

1.6 数据分析

采用SPSS 18.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，差异显著时采用Duncan氏法多重检验，显著水平为0.05。统计数据以平均值±标准差(mean±SD, n=3)的形式表示。

2 结果 2.1 发酵鱼溶浆替代鱼粉对大菱鲆生长、饲料利用和形体指标的影响

FSW替代鱼粉对大菱鲆生长、饲料利用和形体指标的影响见表 5。FSW替代鱼粉对大菱鲆幼鱼的成活率和肥满度无显著影响(P > 0.05)。幼鱼终末体重、增重率和蛋白质效率均在负对照组达到最低值，负对照组饲料系数、脏体比和肝体比显著高于其他各组(P < 0.05)。FSW2~FSW8组幼鱼终末体重、增重率、饲料系数、蛋白质效率、肝体比、脏体比均与正对照组无显著差异(P > 0.05)。

2.2 发酵鱼溶浆替代鱼粉对大菱鲆幼鱼体成分的影响

如表 6所示，各组间全鱼和背肌水分含量均无显著差异(P > 0.05)。负对照组全鱼及背肌粗蛋白含量显著低于其他各组(P < 0.05)，粗脂肪含量则显著高于其他各组(P < 0.05)。正对照组全鱼和背肌粗灰分含量显著高于其他各组(P < 0.05)。

2.3 发酵鱼溶浆替代鱼粉对大菱鲆抗氧化能力的影响

如表 7所示，血清中MDA含量随FSW替代量的增加呈先降低后升高的趋势，SOD呈相反趋势。负对照组AKP活性显著低于其他各组(P < 0.05)。LZM活性呈先升高后降低的趋势，FSW4~FSW8组显著高于负对照组(P < 0.05)，与正对照组无显著差异(P > 0.05)。

2.4 发酵鱼溶浆替代鱼粉对大菱鲆代谢相关酶活性的影响

FSW替代鱼粉对大菱鲆幼鱼代谢相关酶活性的影响见表 8。血清ALT、AST活性随着FSW替代鱼粉水平的增加呈先上升后下降的趋势，肝脏中转氨酶呈相反的变化趋势。负对照组血清中TG含量显著高于正对照组(P < 0.05)，HDL-C含量显著低于正对照组(P < 0.05)。负对照组和FSW2~FSW8组血清T-CHO含量呈先降低后升高的趋势，最小值和最大值分别出现在FSW4和FSW8组。肝脏中LDH活性呈先下降后上升的趋势，FSW6组显著高于负对照组，但显著低于正对照组(P < 0.05)；PKC和PKA活性则分别在负对照组和FSW8组达到最低值，显著低于其他各组(P < 0.05)。

2.5 发酵鱼溶浆替代鱼粉对大菱鲆前肠氨基酸转运载体和小肽转运载体表达量的影响

如图 1所示，FSW2~FSW8组氨基酸转运载体b0at1 mRNA、cat1 mRNA、pat1 mRNA和小肽转运载体pept1 mRNA相对表达量均显著高于正对照组和负对照组(P < 0.05)。负对照组b0at1 mRNA相对表达量显著高于正对照组(P < 0.05)。正对照组和负对照组cat1 mRNA、pat1 mRNA和pept1 mRNA相对表达量无显著差异(P > 0.05)。

3 讨论 3.1 发酵鱼溶浆替代鱼粉对大菱鲆幼鱼生长性能的影响

本研究表明，鱼粉水平下降到30% (负对照组)，幼鱼增重率和特定生长率显著降低，说明植物蛋白替代鱼粉会造成大菱鲆幼鱼生长性能下降，与对大口黑鲈的研究结果一致(钟国防等, 2021)。而使用FSW替代负对照组饲料中8%鱼粉，幼鱼增重率、饲料系数与正对照组无显著差异。有研究表明，饲料原料发酵后，其中小肽、游离氨基酸和酸溶蛋白的含量通常会显著升高(李旺等, 2020)，但在本研究中发现，发酵前后鱼溶浆中的游离氨基酸含量并未发生显著变化，酸溶蛋白含量反而降低，说明在该发酵条件下，发酵菌优先利用小肽而非游离氨基酸作为其氮源(Ling et al, 1995; Wallace, 1996)。FSW替代2%及以上鱼粉时，增重率和饲料系数与正对照组无显著差异，表明在本研究条件下，饲料中添加FSW替代鱼粉能缓解高植物蛋白对大菱鲆幼鱼生长产生的负面效应，其作用机理可能为：鱼溶浆经过发酵后保留了特有的牛磺酸、小肽等促生长的功能活性成分(石勇等, 2019; 敬庭森等, 2021)；FSW中含有大量的菌体蛋白以及益生菌代谢产物，如芽孢杆菌发酵可产生诱食物质乙偶姻和蛋白酶及抗生素等有益物质(毛林静, 2020)，对水产动物具有抗病毒和促消化等作用；FSW中存在一些活菌，能通过影响肠道菌群的结构而促进大菱鲆的生长(Zhang et al, 2021)。

3.2 发酵鱼溶浆替代鱼粉对大菱鲆幼鱼抗氧化能力的影响

MDA反映了鱼体内脂质过氧化的程度，间接反映了细胞损伤的程度。在本研究中，负对照组血清中的MDA含量显著高于其他各组，而FSW替代鱼粉能降低血清中的MDA含量，这与王晓艳等(2021)对珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×E. lanceolatus♂)的研究结果一致。SOD能催化生物体内的超氧阴离子自由基发生歧化反应，进而生成过氧化氢和氧，在氧化还原平衡中起到非常关键的作用。本研究结果显示，FSW替代4%、6%、8%鱼粉，大菱鲆幼鱼血清中的SOD与正对照组无显著差异。表明FSW替代鱼粉能显著提高大菱鲆幼鱼的抗氧化能力，这可能与发酵菌的中间代谢产物有关。王迪等(2021)研究表明，菌种发酵的部分中间代谢产物与自由基清除能力具有显著的正相关性。

AKP是磷酸酶的一种，在动物代谢过程中起重要的调控作用，血清中AKP主要来源于肝脏和骨骼，数值偏低常表明肝胆系统的损伤(牟海津等, 1999)。LZM是一种能水解致病菌细胞壁黏多糖的碱性酶，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用(陈艳等, 2009)。负对照组血清AKP、LZM活性显著低于其他各组，说明植物蛋白替代鱼粉会对幼鱼肝脏造成损伤，这与宋文新(2009)对黑鲷的研究相一致，同时也说明FSW替代鱼粉能缓解植物蛋白造成的损伤，可能与其中的小肽有关。小肽一般指2~3个氨基酸的寡肽，可被机体完整吸收利用，在氨基酸消化、吸收和代谢中起到重要的作用(王恬等, 2003)。在星斑川鲽(Platichthys stellatus)研究中发现，在饲料中添加适宜量的小肽能促进鱼体生长，提升免疫和抗氧化能力(姜柯君, 2013; 王际英等, 2014)。综上，高植物蛋白饲料中，FSW替代鱼粉可提高大菱鲆幼鱼的抗氧化能力。

3.3 发酵鱼溶浆替代鱼粉对大菱鲆幼鱼代谢和体组成的影响

正对照组大菱鲆幼鱼的全鱼和背肌灰分显著高于其他各组，这是因为正对照组相比于其他组含有更多的鱼粉，而鱼粉中的高含量的钙和磷会造成全鱼和背肌灰分的增加(刘颖, 2018)。负对照组的全鱼和背肌脂肪含量均高于其他各组，血清中TG含量也显著高于其他组，表明高植物蛋白饲料会导致鱼体脂肪含量升高(刘兴旺等, 2018)，这与对牙鲆(Paralichthys olivaceus)的研究结果一致(邓君明, 2006; 刘襄河等, 2010)。T-CHO的代谢平衡对鱼体健康具有重要的意义，血清中的T-CHO含量反映了脂肪的代谢状况(吴智鸿等, 2005)，而HDL-C是血清T-CHO的主要运输者，可以以促进T-CHO代谢的方式影响脂质代谢(史连义等, 2009)，负对照组与正对照组血清T-CHO含量无显著差异，但随着FSW含量的增加，血清中的T-CHO含量呈先降低后上升的趋势，而血清中的HDL-C随着FSW的替代水平的增加呈先升高后降低的趋势，FSW6组与正对照组血清中的HDL-C无显著差异。说明FSW相较于鱼粉更能影响大菱鲆幼鱼的脂肪代谢，与草鱼(Ctenopharyngodoni dellus)和黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)的研究结果一致(吴代武等, 2015; 高敏敏等, 2019)。负对照组和FSW2~FSW8组全鱼及背肌粗脂肪含量呈先降低后平稳的趋势，表明FSW替代饲料中的鱼粉会降低幼鱼全鱼和背肌脂肪的沉积，这与黄颡鱼(高敏敏等, 2019)的研究结果一致。刘兴旺等(2018)研究表明，高植物蛋白饲料中添加牛磺酸在促进大菱鲆幼鱼的生长的同时，会降低其全鱼的脂肪含量，表明FSW2~ FSW8组脂肪沉积的变化可能与FSW中的牛磺酸含量较高有关。

负对照组饲料中的高植物蛋白导致其全鱼和背肌粗蛋白含量显著低于正对照组(王晓艳等, 2021; 杨英豪, 2014)。本研究发现，添加FSW能增加其粗蛋白的沉积，可从相关酶活性进行解释。转氨酶是动物蛋白质代谢的关键酶，主要存在于机体的肝细胞内，通过转氨基和脱氨基作用进行蛋白质代谢与转化，肝脏转氨酶水平代表了蛋白质代谢的强弱(Berge et al, 1998)，当肝细胞发生炎症、中毒等情况时，受损的肝细胞会将大量转氨酶释放进血液中，引起血清转氨酶的升高(Kouba et al, 2014)。随着饲料的变化，血清中AST和ALT酶活性呈先降低后升高的趋势，在负对照组达到最高值，在肝脏中则呈相反趋势，说明高植物蛋白对肝细胞造成了损伤，导致蛋白质代谢能力的下降及转氨酶的释放，这与大口黑鲈的研究结果相一致(张改改等, 2019)。而在饲料中添加不同水平的FSW替代鱼粉均能缓解高植物蛋白对肝脏的损伤，其中FSW6组效果最好。

PKA是依赖于cAMP蛋白激酶，在细胞中具有影响糖原、糖和脂质的代谢等多种功能。在本研究中，高植物蛋白替代鱼粉导致PKA的活性降低，FSW4和FSW6组PKA活性稍有升高，但与其他组无显著差异，说明适宜量FSW能在一定程度上提高大菱鲆幼鱼的PKA活性。PKC是G蛋白偶联受体系统中的效应物，而G蛋白偶联受体可识别各种配体和刺激物，参与基因表达、细胞分化及糖代谢的调控(曹铮, 2020)。负对照组PKC活性显著低于其他各组，说明高植物蛋白饲料能降低大菱鲆幼鱼肝脏的PKC活性，而FSW替代鱼粉则能降低高植物蛋白带来的负面影响。LDH是糖代谢的关键酶，它的作用是为机体的代谢提供能量，其活性同时反映了氨基酸的代谢强度(Jiang et al, 2014)。正对照组大菱鲆幼鱼肝脏中LDH活性显著高于其他各组，对LDH活性而言，本研究条件下低鱼粉饲料不能达到高鱼粉饲料相同的效果，但LDH的活性随着FSW替代量的增加而升高。综上，在本研究条件下，不同梯度FSW替代鱼粉均能一定程度提高幼鱼肝脏代谢水平。

3.4 发酵鱼溶浆替代鱼粉对大菱鲆幼鱼小肽转运载体及氨基酸转运载体表达的影响

氨基酸转运载体是介导氨基酸跨膜转运的膜蛋白，根据转运底物的不同，可以分为酸性氨基酸转运系统、中性氨基酸转运系统、碱性氨基酸转运系统、β氨基酸转运系统和亚氨基转运载体(何庆华等, 2007)。本实验主要研究了转运中性氨基酸的b0at1、转运碱性氨基酸的cat1和转运亚氨基和甘氨酸的pat1。饲料高植物蛋白替代鱼粉导致了大菱鲆幼鱼前肠b0at1基因表达量上调，但对cat1和pat1的表达量无显著影响。许丹丹(2014)的研究也表明，在植物蛋白替代鱼粉的实验中，肠道中氨基酸转运载体b0at1比其他氨基酸转运载体的表达更敏感。与负对照组相比，FSW2~FSW8组幼鱼前肠中boat1、cat1、pat1的表达量均显著升高，与FSW中大量游离氨基酸有关，游离氨基酸能刺激氨基酸转运载体的基因表达量升高(Garcia-Villalobos et al, 2012; Morales et al, 2013)。Liao等(2009)研究表明，增加肠腔微生物蛋白产量，会降低肠细胞膜对碱性氨基酸的转运能力。在本研究条件下，FSW是否能通过影响大菱鲆幼鱼的肠道菌群结构及菌群微生物蛋白产量而对小肽转运载体的表达水平产生影响还有待进一步研究。

pept1是肠肽转运载体，在肠胃中表达量较高，其功能为吸收蛋白质降解的小肽及多肽类似物(Daniel et al, 2004)。pept1的表达水平通常受饲料营养成分的影响(李本相, 2019)。在瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)幼鱼的实验中，与鱼粉组和水解鱼蛋白组相比，大豆浓缩蛋白组pept1的表达水平更高(杨英豪, 2014)，说明植物蛋白替代鱼粉能提高pept1的表达水平，这与本研究结果相一致。与负对照组相比，FSW2~FSW8组前肠pept1的表达水平再次升高，可能的原因有2点：一方面FSW替代鱼粉提高了饲料中的游离氨基酸及小肽含量，而游离氨基酸和小肽含量的增加可显著提高pept1 mRNA的表达水平(Ostaszewska et al, 2010)；另一方面与鱼粉相比，FSW含有更多非蛋白质氮，随着FSW替代水平的增加，饲料可利用氨基酸总量降低，氨基酸水平的降低也会提高pept1 mRNA的表达水平(Terova et al, 2009; 许丹丹, 2014)。

4 小结

以增重率为判断依据，在30%鱼粉水平下，在饲料中添加FSW可有效将鱼粉含量降低至22%，并且可缓解高植物蛋白导致的生长性能下降。