血液是鱼类血液学研究及诊断的重要材料，由于鱼体血液中血小板含量高，极易凝结，因此，抗凝剂在研究过程中起到不可或缺的作用(Gholipourkanani et al, 2018)。鱼类血液会因不同抗凝剂的处理对抗凝效果和后续血液指标检测产生不同的影响，而正确使用抗凝剂会将影响降到最小(Weinert et al, 2015)。柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、草酸盐和肝素等是目前鱼类血液学研究中通常采用的抗凝剂(Walencik et al, 2007)。鱼类种属多样，血液抗凝剂选择也不尽相同，研究表明，肝素是鲤鱼(Cyprinus carpio)、褐鳟(Salmo trutta)的血液抗凝剂优选(Walencik et al, 2007; Ciepliński et al, 2019)；也有研究表明，乙二胺四乙酸盐对褐鳟、白斑狗鱼(Esox lucius)和鲻鱼(Mugil cephalus)血液抗凝效果更佳(Blaxhall et al, 1973; Mulcahy, 2010; Faggio et al, 2014)。张峰等(2006)研究发现，不同浓度的肝素钠、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸钠和草酸钠4种抗凝剂中，1.0~1.5 mg/mL的乙二胺四乙酸二钠对刺参(Stichopus japonicus)体腔细胞的抗凝效果最好，即使长时间作用，仍能使细胞保持伸展状态。Ahmed等(2014)和Sheikh等(2020)认为，肝素钠和乙二胺四乙酸二钾2种抗凝剂中，肝素钠对全唇裂腹鱼(Schizothorax labiatus)和雪鳟(Schizopyge plagiostomus)的血液生理指标、血细胞形态影响最小，推荐其作为首选抗凝剂。因此，抗凝剂对不同鱼类血液抗性效果存在显著种属间差异(Walencik et al, 2007)。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)属鲽形目(Pleuronectiformes)、菱鲆科(Scophthalmidae)、菱鲆属(Scophthalmus)，是冷水性深海底层鱼类，原产于欧洲，自1992年引进中国以来，经过近30年发展，养殖年产量稳定在5万t左右，占世界养殖大菱鲆产量80%以上，同时，形成较为完善的上下游产业链，成为我国海水鱼类养殖的重要优良品种之一(雷霁霖等, 2012)。国内外在大菱鲆苗种繁育、养殖模式、饲料营养、疾病防控、产品质量安全与加工技术等方面进行了较为系统性的研究(Qiang et al, 2004; 马爱军等, 2003; Pyanov, 2021)。目前，陆基工厂化循环水养殖是大菱鲆主要养殖模式，养殖水体温度和溶解氧是养殖过程中2个重要环境因子，特别是在高密度养殖条件下，保证养殖水体中充足的溶解氧是维持大菱鲆正常生理代谢的关键(吴志昊, 2011; 乔玮, 2014)。低氧环境对大菱鲆生理状态产生显著影响，已有研究表明，低氧环境可导致大菱鲆血液RBC、Hb和Hct显著上调，而不同抗凝剂下血液抗凝效果也会产生显著不同(刘伟东, 2009; Jia et al, 2021)，上述研究过程中都涉及到对大菱鲆相关生理生化指标检测，特别是对血液样品采集和检测更是广泛应用，但急性低氧胁迫下使用抗凝剂对大菱鲆血液产生的影响还未可知。刘伟东等(2009)使用乙二胺四乙酸作为抗凝剂，研究了低温条件下大菱鲆保活过程中血液生理生化变化，发现抽血过程中血液较正常状态黏稠，流动性也不如正常状态好。纪利芹(2014)使用肝素钠作为血液抗凝剂，研究了连续降温对大菱鲆血液生理生化指标的影响。目前涉及大菱鲆血液生理生化指标检测的研究中，抗凝剂选择上存在显著不同。本研究通过选用柠檬酸钠、肝素钠、乙二胺四乙酸二钾3种常用抗凝剂，对正常溶解氧和急性低氧胁迫条件下，上述抗凝剂的抗凝效果进行对比分析，以期筛选出急性低氧胁迫条件下大菱鲆血液研究的最适抗凝剂，为急性低氧环境中大菱鲆血液学研究及健康养殖提供技术支撑。

实验鱼由山东省烟台市经济开发区天源水产有限公司提供，共54尾，体质健康活泼，外观无损伤，平均体质量为(200.21±23.17) g，平均体长为(14.25± 3.75) cm，实验前将全部实验鱼在循环水养殖系统中暂养2周，保持水温范围为(18.0±0.5)℃，水中溶解氧浓度为(8.5±0.5) mg/L，pH为7.6±0.4，NH₃-N < 0.1 mg/L，每日饱食投喂商品饲料(海童，潍坊三通生物工程有限公司) 2次，实验前24 h禁食。实验中所用3种一次性负压静脉采血管购于山东鸿海医疗器械有限公司，抗凝管内添加剂浓度分别为肝素钠12~30 IU，柠檬酸钠105~109 mmol/L，乙二胺四乙酸二钾15~22 mg/mL。

实验分为对照组和处理组(急性低氧胁迫)，每组设置3个平行，每个平行选用9尾大菱鲆。对照组将所需实验鱼(循环水中暂养)放入含有200 mg/L MS-222的海水溶液中，至深度麻醉后迅速捞起，将含有3种抗凝剂(肝素钠、柠檬酸钠和乙二胺四乙酸二钾)的一次性负压静脉采血管连接一次性静脉采血针从大菱鲆尾静脉处抽取5 mL静脉血后，将采血管静置。处理组则将实验鱼放入预先充入氮气实验桶中溶解氧含量为(1.2± 0.3) mg/L，实验期间使用溶氧仪(AZ8603型台湾衡欣)实时监测水体溶解氧变化，维持2 h后进行麻醉采血，采血方法同对照组。

自血液注入采血管内开始计时，将采血管静置6 h和12 h后，观察采血管内血液凝结程度，记录管内血液凝结物比例。血涂片的制作采用姬姆萨染色法，姬姆萨原液购于北京索莱宝科技有限公司(G1015)，使用方法参照说明书。血涂片制作时，先将载玻片清洗干净，用移液枪取5 µL血液滴在载玻片一侧，将盖玻片一端接触血液，匀速推出，晾干后，甲醇固定10~15 min，再放入充满染色液的染色缸中着色15~30 min，着色完毕取出载玻片用蒸馏水洗净后晾干，显微镜下观察血细胞形态。

将血液样本分为2份，置于1.5 mL离心管中，1份在4℃、3500 r/min条件下离心10 min，取上清液，保存于–80℃，用于检测血浆葡萄糖和皮质醇浓度，另1份于4℃冰箱保存，使用迈瑞全自动血液细胞分析仪(BC-2800 vet)检测血液红细胞数目(10¹²/L)、白细胞数目(10⁹/L)、血红蛋白含量(g/L)和红细胞积压(%)。血浆皮质醇含量采用放射性同位素免疫法(RIA)，试剂盒(KIPI28000)购自北京北方生物技术研究所；血浆葡萄糖含量测定试剂盒(F006-1-1)购于南京建成生物工程研究所，操作步骤参见说明书。

实验结果用平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，使用Duncan多重比较分析3种抗凝剂在两种状态下的组间差异，P < 0.05为差异显著。

由图 1可见，正常溶解氧状态下乙二胺四乙酸二钾抗凝效果显著，急性低氧胁迫下静置6 h和12 h后，抗凝效果显著，抗凝剂分别为乙二胺四乙酸二钾和肝素钠。

图 1(Fig. 1)

图 1 不同作用时间下3种抗凝剂对大菱鲆血液抗凝效果的影响 Fig.1 Effects of three anticoagulants on turbot blood cells during different treatment time

图 2中为对照组和处理组乙二胺四乙酸二钾、肝素钠、柠檬酸钠3种抗凝剂下细胞显微图。对照组在3种抗凝剂作用下，分别出现嗜碱性粒细胞(图 2A)，中性粒细胞和双核细胞(图 2B)，嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞(图 2C)。处理组3种抗凝剂(图 2D、E、F)作用下均出现双核细胞，处理组肝素钠(图 2E)和柠檬酸钠(图 2F)抗凝作用下还分别出现微核细胞和无核红细胞。

图 1(Fig. 1)

图 2 不同抗凝剂下大菱鲆血细胞显微结构 Fig.2 Microstructure of blood cells of turbot under different anticoagulants A：嗜碱性粒细胞(BAS)；B：中性粒细胞(NEU)；C：嗜酸性粒细胞(EOS)，淋巴细胞(LYM)，单核细胞(MNC)，嗜碱性粒细胞(BAS)；D：单核细胞(MNC)，淋巴细胞(LYM)，双核细胞(BNC)；E：双核细胞(BNC)，微核细胞(MN)；F：双核细胞(BNC)，无核细胞(ERY)。 A: Basophil (BAS); B: Neutrophils (NEU); C: Eosinophils (EOS), Lymphocytes (LYM), Monocytes (MNC), Basophil (BAS); D: Monocytes (MNC), Lymphocytes (LYM), Binucleate cells (BNC); E: Binucleate cells (BNC), Micronucleus cells (MN); F: Binucleate cells (BNC), Erythroplastid (ERY).

急性低氧胁迫处理后，3种抗凝剂作用下大菱鲆血液白细胞数目均显著增多(图 3A) (P < 0.05)，肝素钠和乙二胺四乙酸二钾抗凝作用下，大菱鲆血液红细胞数目(图 3B)和血红蛋白含量显著增加(图 3D)，但柠檬酸钠抗凝作用下大菱鲆红细胞数目和血红蛋白含量显著降低(P < 0.05)。处理组中3种抗凝剂作用下大菱鲆红细胞积压变化均不显著(图 3C) (P > 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 3 3种抗凝剂对急性低氧胁迫下大菱鲆白细胞数目、红细胞数目、红细胞积压和血红蛋白含量的影响 Fig.3 Effects of three anticoagulants on white blood cell numbers, red blood cell numbers, hematocrit and hemoglobin content under acute hypoxia stress in turbot 不同字母表示组间差异显著，P < 0.05。下同。 Different letters indicate significant differences, P < 0.05. The same as below.

急性低氧胁迫处理后大菱鲆血浆葡萄糖浓度均显著增加(图 4A) (P < 0.05)，但肝素钠抗凝作用下，葡萄糖浓度显著低于柠檬酸钠和乙二胺四乙酸二钾(P < 0.05)。同时，大菱鲆血浆皮质醇浓度也出现类似变化趋势，急性低氧胁迫处理后，其浓度均显著增加，肝素钠抗凝作用下，皮质醇浓度显著低于柠檬酸钠和乙二胺四乙酸二钾(图 4B) (P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 4 3种抗凝剂对急性低氧胁迫下大菱鲆血浆葡萄糖和皮质醇浓度的影响 Fig.4 Effects of three anticoagulants on turbot plasma glucose and cortisol content under acute hypoxia stress

鱼类血液采集经抗凝剂作用后可分离出血浆，用于后续指标检测。其中，肝素钠主要是通过结合血浆中的抗凝蛋白阻止血液凝固，而柠檬酸钠和乙二胺四乙酸二钾能抑制血小板聚集和螯合Ca²⁺形成不易解离但可溶解的络合物，从而减少血液中Ca²⁺浓度，阻止血液凝固(Faggio et al, 2014)。刘凯等(2017)研究发现，肝素钠、柠檬酸钠、草酸钾和乙二胺四乙酸二钾均可延长鲫鱼(Carassius auratus)外周血的凝固时间。本研究中，柠檬酸钠和肝素钠在短时间内抗凝效果不显著，可能是柠檬酸钠与大菱鲆血液中Ca²⁺存在特异性结合，而肝素钠可能无法与大菱鲆血浆中的抗凝蛋白结合，从而不能减轻血液凝固现象，这种现象在鲻鱼、刺参中也有类似报道(张峰等, 2006; Faggio et al, 2014)。

目前，鱼类血细胞涂片制作是通过尾静脉采血后加入抗凝剂，抗凝剂可抑制血小板聚集，选用正确的抗凝剂对血细胞形态影响较小(曹文芝等, 2014)。周雪莹等(2007)研究表明，大菱鲆血细胞分为红细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和血栓细胞5种类型，未发现嗜酸性和嗜碱性粒细胞。本研究中，对照组柠檬酸钠抗凝作用下出现嗜酸性和嗜碱性粒细胞，乙二胺四乙酸二钾抗凝剂下未出现嗜酸性粒细胞，这与上述大菱鲆血细胞类型研究相悖。吴志昊等(2011)研究表明，高氧可导致大菱鲆出现核异常现象，极低氧则因大菱鲆在较短时间内死亡，无法观察到核异常情况出现。核异常现象包括核质外凸、核质内凹、双核等。此外，制药工厂及医院排放的污水、银和铜的氧化物毒性等不利因素也会导致尖齿胡鲶(Clarias gariepinus)出现核异常细胞(Alimba et al, 2017、2019; Ogunsuyi et al, 2019)。在本研究中，对照组肝素钠抗凝作用下血涂片中出现双核细胞，可能是肝素钠作为一种不利因子参与大菱鲆血液抗凝。急性低氧胁迫处理后，乙二胺四乙酸二钾、肝素钠和柠檬酸钠抗凝剂下均观察到双核血细胞，其中，肝素钠和柠檬酸钠抗凝剂下还分别出现微核和无核血细胞。

血液白细胞是鱼类机体细胞免疫和体液免疫的主要组成部分，主要功能是保护机体免受内外因素的侵害(常志成等, 2018)；红细胞是鱼类血液中最多的细胞，同哺乳动物类似，主要功能就是运输O₂和CO₂ (高泽霞等, 2008)；血红蛋白的主要功能是储存和运输O₂ (王跃群等, 1998)。影响全血黏度的因子为红细胞压积和血红蛋白(Bao et al, 2018)。因此，上述血液指标可以反映鱼类在不同状况下的生理状态，也经常作为评价鱼类生理状态的重要血液学参数(Ahmed et al, 2019)。所以，本研究将正常和低氧胁迫条件下抗凝剂对大菱鲆血液指标的影响进行对比分析发现，低氧胁迫条件下白细胞数目均显著增高(P < 0.05)，在吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)、花鲈(Lateolabrax maculatus)幼鱼中均有发现(陈德举等, 2019; 常志成等, 2018)。低氧胁迫条件下，肝素钠、乙二胺四乙酸二钾抗凝剂作用下大菱鲆红细胞数目显著增多(P < 0.05)，在暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)、鲫鱼幼鱼、西伯利亚鲟(Acipenser baerii)中均有研究(李欣茹, 2018; 王晓雯等, 2016; 张曦等, 2011)。张国松(2017)研究表明，在低氧条件下，鱼类会通过增加红细胞数目从而增加血红蛋白含量来提高携氧能力，使机体应对低氧环境下的应激反应。但在本研究中，柠檬酸钠抗凝作用下红细胞数目和血红蛋白含量显著降低(P < 0.05)，这可能是由于柠檬酸钠会导致红细胞出现溶血，从而造成红细胞减少(李双安等, 2005)。研究表明，乙二胺四乙酸二钾和肝素对褐鳟、横口裂腹鱼(Schizopyge plagiostomus)、全唇裂腹鱼(Schizothorax labiatus)血红蛋白含量无影响(Ciepliński et al, 2019; Sheikh et al, 2020; Ahmed et al, 2014)，与对照组结果相似。上述报道中，乙二胺四乙酸二钾与肝素钠相比，横口裂腹鱼、全唇裂腹鱼血液红细胞数目较低，但在本研究中，二者红细胞数目无显著差异。研究发现，乙二胺四乙酸和肝素会使横口裂腹鱼、波斯鲟(Persian sturgeon)血液红细胞积压较高(Sheikh et al, 2020; Gholipourkanani et al, 2018)。本研究表明，柠檬酸钠与乙二胺四乙酸二钾相比红细胞积压显著升高(P < 0.05)，这可能与柠檬酸钠会导致红细胞肿胀有关(Faggio et al, 2014)，上述报道与本研究结果不一致。

鱼类血液中的葡萄糖主要为机体提供能量，以确保各组织器官的正常运行。葡萄糖浓度会因环境因素应激而发生改变，军曹鱼(Rachycentron canadum)经急性低氧胁迫后，血浆葡萄糖浓度明显升高(黄建盛等, 2019)。在本研究中，急性低氧胁迫处理后，葡萄糖浓度显著增高(P < 0.05)，肝素钠与其他2种抗凝剂相比，葡萄糖浓度显著降低(P < 0.05)。研究表明，血液离体后，常温下血液中的葡萄糖会被分解代谢，从而导致葡萄糖含量降低(代胜奇, 2012)。鱼类的应激反应类似于高等脊椎动物，快速释放儿茶酚胺，随后释放皮质醇(Clauss et al, 2008)。皮质醇为一种稳定的应激激素，在低氧条件下，刺参的皮质醇浓度显著增加(周晓梦等, 2018)。Vijayan等(1997)研究表明，皮质醇浓度会随葡萄糖浓度的增加而增加。本研究中，急性低氧胁迫处理后，肝素钠抗凝剂作用下皮质醇含量与其他2种抗凝剂相比显著降低(P < 0.05)，同上述结果描述一致。

综上，本研究发现，体质量为(200.21±23.17) g的大菱鲆在乙二胺四乙酸二钾、肝素钠和柠檬酸钠3种抗凝剂作用下，正常溶解氧状态下乙二胺四乙酸二钾抗凝效果显著，急性低氧胁迫下静置6 h和12 h后，抗凝效果显著的抗凝剂分别为为乙二胺四乙酸二钾和肝素钠。肝素钠抗凝剂下出现双核血细胞，柠檬酸钠和乙二胺四乙酸二钾抗凝剂下分别出现嗜酸性、嗜碱性粒细胞和嗜碱性粒细胞。急性低氧胁迫处理后，肝素钠、柠檬酸钠抗凝剂下出现微核和无核血细胞，同时，肝素钠抗凝作用下葡萄糖和皮质醇浓度显著低于柠檬酸钠和乙二胺四乙酸二钾。此外，柠檬酸钠在急性低氧条件下红细胞数目和血红蛋白含量显著降低。综上，乙二胺四乙酸二钾可作为急性低氧胁迫条件下大菱鲆血液学分析的首选抗凝剂。