鱼类的生长和繁殖受环境条件的调节，气候的变化可能给海水网箱养殖鱼类带来不利影响。已有大量研究表明，冬季的低温易导致鱼类生长性能降低，甚至大量死亡(Abdel-Tawwab et al, 2014; Wen et al, 2017; Islam et al, 2019、2020)。红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)主要分布在我国沿海地区、朝鲜半岛和日本海域，其肉质鲜美、营养丰富，已成为我国重要的经济型海水养殖鱼类之一。红鳍东方鲀作为暖温性鱼类，其适宜的生长温度为16~25℃，然而，冬季水温的下降严重影响其生长性能，需要采用室内加热水进行养殖，但由于加热升温的方法会带来成本上升、环境压力等问题，养殖水温仍只能维持在较低水平。因此，研究该物种冷适应的分子机制及培育具有耐寒特性的品种，有助于减少因低温而出现大面积死亡的情况发生，从而提高养殖产量，提升经济效益。

受益于分子生物学手段的不断提升，针对鱼类低温耐受分子机制的研究越来越深入，一些与鱼类低温耐受相关的基因得以被发现及应用。本课题组前期通过分析红鳍东方鲀的低温转录组差异基因，筛选得到4个与低温耐受相关的基因。抗冻蛋白(AFP)基因作为研究较为深入的抗寒基因，普遍存在于鱼类、植物、昆虫、细菌和真菌中(Duman et al, 1993; 崔杰等, 2019; 徐凯等, 2019; 张俊芳等, 2020)。AFP对冰晶具有较高的亲和力，能够附着到冰晶表面，阻止冰晶长大，从而达到抗寒的目的(Raymond et al, 1977; 汪少芸等; 2012)。在鱼类中，已有大量的相关研究，鱼源抗冻蛋白也得到了广泛应用(钟其旺等, 2002; 蔡路昀等, 2018)。冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)是一种进化上保守的RNA结合蛋白，CIRP基因作为一种分布广泛、作用性强的功能基因，参与机体抵御外界低温的过程，通过提高mRNA的稳定性，介导多种基因的转录翻译，从而保护机体免受低温损伤(Al-Fageeh et al, 2006)。近年来，研究发现，CIRP参与了一些鱼类的低温胁迫应答过程，包括黄姑鱼(Nibea albiflora) (Xu et al, 2018)、牙鲆(Paralichthys olivaceus) (胡金伟等, 2015)、大黄鱼(Larimichthys crocea) (苗亮等, 2017)等。高速迁移蛋白家族蛋白(HMGB1)作为一种高度保守的非组蛋白染色质相关蛋白，其功能是稳定核小体的形成(Lange et al, 2009)，并充当转录因子样蛋白，通过弯曲DNA和促进获得特定DNA靶点上的转录蛋白来调控基因的表达(Park et al, 2003)，包括一些与低温相关的基因(Vornanen et al, 2005)。Y-box结合蛋白1 (YB-1)属于冷休克蛋白家族成员，在进化上高度保守(Swamynathan et al, 1998)，是一类重要的功能蛋白。其可以作为转录因子与DNA、mRNA结合，也可以与其他转录因子发生蛋白互作，来完成基因转录与翻译的调控，进而参与机体的生理调控作用(Kloks et al, 2002; Eliseeva et al, 2011)。YB-1基因作为一种胁迫响应基因，对不同物种的多种胁迫都会产生响应，包括冷胁迫、氧化应激、缺氧等(Rauen et al, 2016; Li et al, 2018)。关于HMGB1基因和YB-1基因的相关研究报道在海洋生物中较少，且集中在鱼类免疫方面(Cai et al, 2014; Xie et al, 2014; Cai et al, 2018; He et al, 2019)。

本文以红鳍东方鲀为研究对象，采用荧光定量PCR的方法研究上述4种抗寒基因在不同温度、不同组织中的响应情况，从分子水平理解红鳍东方鲀的低温适应性，初步分析红鳍东方鲀幼鱼的抗寒分子机制，以期为筛选抗寒分子标记提供候选基因，进而为红鳍东方鲀耐低温育种研究和应用奠定基础。

实验用红鳍东方鲀取自大连天正实业有限公司，挑选体长为(15.0±0.5) cm、体格健壮、无损伤、活力好的360尾幼鱼，于12个实验桶(500 L)暂养，静水充气方式饲养，每日换水1次，暂养2周。设置4个温度梯度(18℃、13℃、8℃和5℃)，18℃作为对照组，每个温度梯度设置3个平行，每个平行30尾幼鱼。暂养结束后，采用急性换水降温的方法，排掉海水的同时加入事先调至实验温度的海水，直到温度达到实验温度，使用亚美光411-H钛质加热器，控制温度在实验温度范围内，每隔2 h观察水温。实验过程中不投喂饵料，溶解氧为(6.80±0.12) mg/L，自然光照，胁迫24 h后结束实验。每个养殖桶取3尾，使用200 mg/L MS-222麻醉后，迅速在冰上完成解剖，每尾鱼分别取肝、脾、肾、脑、心、肠、肌肉、皮肤和性腺，浸入10倍体积的RNA保存液中(TIANGEN)，4℃静置24 h后于–80℃保存。

使用TIANGEN总RNA提取试剂盒(DP419)进行RNA提取，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，使用紫外分光光度仪检测浓度。取1 μg总RNA，按照TransScript反转录试剂盒(AT311-03)说明书合成cDNA第一链，将产物于–80℃冰箱保存，待下一步实验。

采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的方法检测目的基因的表达情况，使用Primer express 3.0设计定量引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表 1。参照TransStart说明书，在96孔板中配制20 μL体系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，RNase-free ddH₂O 7.4 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA模板1 μL。RT-qPCR反应在ABI StepOne plus平台进行，PCR反应程序：94℃预变性30 s，二步法PCR (94℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40个循环)，反应结束后绘制熔解曲线以确保扩增的特异性和准确性。

表 1(Tab.1)

表 1 RT-qPCR用到的引物序列 Tab.1 Primers used for RT-qPCR 引物Primer 序列Sequence (5′~3′) β-actin F ATCGTTGGTCGCCCCAGGCACC β-actin R CTCCTTGATGTCAGCACGATTTC AFP-F TCACGAACGGAGGTCTTTCT AFP-R TGCCACTTGTTTGGCTTGTA CIRP-F ATGGCGACAGGAGTTATGGT CIRP-R GTTCGTATCCACCCTGCATC HMGB1-F GACAAGGACATCGTTGCGTA HMGB1-R ATCCTCGTCGTCATCGTCTT YB-1-F AGAGGCTTCCGACCAAGATT YB-1-R GTTGGTTCTGACCACCTTCG

表 1 RT-qPCR用到的引物序列 Tab.1 Primers used for RT-qPCR

β-actin作为内参基因，采用2^–ΔΔCT法计算相对表达量。采用SPSS 22.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan检验比较各实验组之间的差异，P < 0.05表示存在显著性差异。

红鳍东方鲀AFP基因在18℃的表达情况如图 1所示，在所检测的组织中，该基因呈现广泛性表达，在肌肉中表达量最高(P < 0.05)，皮肤、肾脏中次之，在性腺中表达量较低。各组织不同温度处理24 h后的结果如图 2所示，随着温度降低，各组织中AFP基因的表达量基本呈显著升高的趋势，在5℃组达到最高值，相比对照组表达量升高且差异显著(P < 0.05)，增幅较大，增幅最低的肾脏也在18倍以上；在脑、心、肝、肌肉、性腺和皮肤中，5℃组表达量显著高于8℃组(P < 0.05)，在肾、肠、脾中8℃组和5℃组之间无显著差异。

图 1(Fig. 1)

图 1 AFP基因的组织表达 Fig.1 Tissue-specific expressions of AFP gene B：脑；H：心；I：肠；K：肾；L：肝；M：肌肉；SP：脾；SK：皮；GO：性腺。 不同字母代表差异显著(P < 0.05)。下同。 B: Brain; H: Heart; I: Intestine; K: Kidney; L: Liver; M: Muscle; SP: Spleen; SK: Skin; GO: Gonad. Different letters represent significant differences (P < 0.05). The same as below.

图 1(Fig. 1)

图 2 不同温度条件下AFP基因在红鳍东方鲀各组织中的表达 Fig.2 Expression of AFP gene in different tissues of T. rubripes at different temperatures

红鳍东方鲀CIRP基因在18℃的表达情况如图 3所示，在所检测的组织中该基因均有不同程度的表达，在肌肉中表达量最高(P < 0.05)，在肠中表达量较低。各组织不同温度处理24 h后的结果如图 4所示，随着温度的降低，各组织中CIRP基因的表达量的升降程度有所不同，肝、肾、脑的表达量呈先升高后降低再升高的趋势，在13℃组表达量显著高于对照组；心、肠和皮的表达量呈先升高后降低的趋势，在8℃组达到最大值，且8℃组和5℃组都显著高于对照组(P < 0.05)；在脾、肌肉和性腺中表达量呈上升趋势，在5℃组达到最高值，显著高于对照组(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 3 CIRP基因组织表达 Fig.3 Tissue-specific expressions of CIRP gene

图 1(Fig. 1)

图 4 不同温度条件下CIRP基因在红鳍东方鲀各组织中的表达 Fig.4 Expression of CIRP gene in different tissues of T. rubripes at different temperatures

红鳍东方鲀HMGB1基因在18℃的表达情况如图 5所示，在所检测的组织中该基因均有不同程度的表达，在肌肉中表达量最高(P < 0.05)，在脑、心、肝和皮肤中也有较高的表达量，在其他组织中表达量较低。各组织不同温度处理24 h后的结果如图 6所示，随着温度的降低，除肝脏外各组织中HMGB1基因的表达量基本呈先升高后降低的趋势，并在8℃组达到最大值，显著高于其他各组(P < 0.05)，其中，最小的增幅出现在肌肉组织，增幅3倍以上；最大增幅出现在肠组织中，增幅70倍以上；肝脏中HMGB1基因的表达量在13℃组和8℃组表达量显著高于对照组(P < 0.05)，两组间无显著差异。

图 1(Fig. 1)

图 5 HMGB1基因组织表达 Fig.5 Tissue-specific expressions of HMGB1 gene

图 1(Fig. 1)

图 6 不同温度条件下HMGB1基因在红鳍东方鲀各组织中的表达 Fig.6 Expression of HMGB1 gene in different tissues of T. rubripes at different temperatures

红鳍东方鲀YB-1基因在18℃的表达情况如图 7所示，该基因在肌肉中表达量最高(P < 0.05)，在其他组织中表达量较低。各组织不同温度处理24 h后的结果如图 8所示，随着温度的降低，各组织中YB-1基因的表达量的升降程度有所不同，在大部分组织中(脑、心、肠、肾、肝、肌肉和脾)表达量呈先升高后降低再升高的趋势，在8℃组达到最小值，其中，主要表达组织(肌肉)中的表达量降幅超过5倍；除肠外，其他各组织在8℃组的基因表达量都显著低于其他各组(P < 0.05)；在皮肤和性腺中，该基因的表达量在5℃组达到最大值，显著高于其他各组(P < 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 7 YB-1基因组织表达 Fig.7 Tissue-specific expressions of YB-1 gene

图 1(Fig. 1)

图 8 不同温度条件下YB1基因在红鳍东方鲀各组织中的表达 Fig.8 Expression of YB-1 gene in different tissues of T. rubripes at different temperatures

抗冻蛋白具有控制冰晶的形成以及调节冰晶状态的作用，分布比较广泛，在动物、植物以及微生物中均可以发现AFP的存在(Duman et al, 2001; Bale et al, 2002; Davies et al, 2016)。在抗寒应用方面，转基因烟草、马铃薯获得了更高的抗冻能力(黄永芬等, 1997; 沈立晓等, 1998)。在斑马鱼胚胎的早期阶段，将AFPs导入斑马鱼胚胎可增强细胞的冷冻保护(Martínez-Páramo et al, 2009)。在红鳍东方鲀中，关于AFP基因与抗寒性关系的研究尚未见报道。本研究发现，在所检测的组织中(肝、脾、肾、脑、心、肠、肌肉和性腺)，该基因呈现广泛性表达模式，这与Low等(1998)在杜父鱼(Myoxocephalus scorpius)中的研究结果相一致。同时，随着温度的降低，各组织中AFP基因的表达量基本呈显著升高的趋势，这可能是由于鱼类作为变温动物，当环境温度降低时，内部各组织都需面临低温的风险，AFP基因在应对低温胁迫时具有组织广适性，对各个组织都具有保护功能，其广泛分布以及低温诱导表达有利于对各组织的保护。另外，在本研究中，低温胁迫下AFP基因表达在各组织中的变化趋势一致，且都在最低温度5℃组达到最高值，据此推测，红鳍东方鲀AFP基因更多是通过直接保护组织免受冻害的方式来完成其抗寒性能。

冷诱导RNA结合蛋白CIRP最早在哺乳动物中发现，是一种参与机体应激调节的蛋白(Nishiyama et al, 1997)，其基因表达量在冷刺激下急剧增加，具有介导冷诱导细胞生长抑制作用，因此，被视为冷诱导的标记基因(Nishiyama et al, 1998)。本研究中，CIRP基因在所检测的组织中均有不同程度的表达，在肌肉中表达量最高。这种广泛性表达的模式在多种鱼类的研究中都有发现，如牙鲆CIRP基因在脑、鳃、心、肌肉、肝、肠等组织都有不同程度的表达，具有较广的表达谱(胡金伟等, 2015)；大黄鱼CIRP基因在肝脏中表达量最高，在肌肉、肾、鳃、皮肤、肠、脑、脾和心等组织中也有一定的表达(苗亮等, 2017)，大西洋鲑(Salmo salar)肝、肾、心中也都能检测到CIRP基因表达，且组织间不存在显著差异(Feng et al, 2004)。以上结果表明，CIRP基因的组织分布呈现广泛性，又具有物种特异性。另外，本研究还发现，随着温度的降低，各组织中CIRP基因的表达量的升降程度有所不同，呈现出不同的表达谱，这可能与不同组织的生理特性、行使的生物学功能不同等因素有关。皮肤和肌肉中CIRP基因在低温下都呈现升高的趋势，且3个低温组都显著高于对照组，这与大黄鱼(苗亮等, 2017)的研究结果相类似，大黄鱼皮肤和肌肉CIRP基因在整个降温过程中呈持续升高趋势，且在最低温度组中表达量最高。另外，苗亮等(2017)发现，脾和肠中CIRP基因的表达量较低，且表达量随温度降低而降低，与本研究的结果有所不同，其原因可能是2种鱼类的抗寒性能不同。本研究涉及到的低温过程并未超越红鳍东方鲀的耐受能力，在实验期间，CIRP基因在大多组织中仍然能够发挥正常的调控作用。

HMGB1是一种染色质相关的非组蛋白，对核小体形成、转录调控和炎症反应具有重要作用。在哺乳动物中，核HMGB1在核小体结构稳定性、DNA错配修复和基因表达调控中发挥重要作用(Bustin et al, 1999; Stros et al, 2010; Tang et al, 2010)。在硬骨鱼中也有报道，其在鱼类早期发育以及免疫应答方面起到重要作用(Zhao et al, 2011; Cai et al, 2014)。本研究发现，在所检测的组织中，该基因均有不同程度的表达，在肌肉中表达量最高，在脑、心、肝和皮肤中也有较高表达量，在其他组织中表达量较低。类似表达模式在多种鱼类中有报道，如牙鲆(胡金伟等, 2015)、红笛鲷(Lutjanus sanguineus) (Cai et al, 2014)、草鱼(Ctenopharyngodon idella) (Yang et al, 2013)、金鱼(Carassius auratus) (Xie et al, 2014)等。本研究还发现，随着温度的降低，除肝脏外，各组织中HMGB1基因的表达量基本呈先升高后降低的趋势，并在8℃组达到最大值，显著高于其他各组；在肝脏中也呈现相同的趋势，最高值出现在13℃组且与8℃组无显著差异。一方面，说明在低温胁迫下HMGB1基因发挥了调控功能(Vornanen et al, 2005)；另一方面，5℃对红鳍东方鲀来说已经是难于生存的温度，因此，HMGB1基因在5℃组的低表达可能超越了该基因的调控极限。目前，在低温胁迫下鱼类HMGB1基因的研究报道仍然较少，更多的反应调节机制需要进一步研究。

YB-1基因作为一个胁迫响应基因，不同种类的应激，如冷休克、氧化剂应激、重金属应激、缺氧和紫外线照射等都能触发YB-1基因的响应(Koike et al, 1997; Kohno et al, 2003; Rauen et al, 2016; Li et al, 2018)，在这些过程中，YB-1基因可以作为转录因子调节应激反应基因的转录，也可以同mRNA结合调节翻译过程。本研究中，YB-1基因在肌肉中表达量最高，显著高于在其他组织中的表达量。这种表达模式同其他物种的结果有所不同，如红螯螯虾(Cherax quadricarinatus) Y-box基因转录活性最强的组织是神经，在心、肠和肌肉中的表达量很低(孟庆国等, 2012)；Y-box基因在中间球海胆(Strongylocentyotus intermedius)体腔液、管足、围口膜、雄性性腺、雌性性腺、肌肉和肠7个不同组织中均有表达，但差异不显著(田燚等, 2013)；小鼠的YB-1基因在性腺中表达量最高，其次是肾、心、肌肉、肝等。以上结果表明，不同物种Y-box基因应对环境变化的方式有所不同，红鳍东方鲀YB-1基因可能在肌肉中发挥重要的环境调控作用。本研究还发现，在大多数组织中(其中包括主要的表达组织肌肉)，8℃组的表达量最低，显著低于对照组，并且这些组织中5℃组YB-1基因表达又有不同程度的回升，这些结果一方面说明YB-1基因在红鳍东方鲀中受冷诱导，在肌肉中以降低表达的方式应对低温胁迫；另一方面，8℃时该基因发挥主要的调节作用。

本研究通过荧光定量PCR技术对红鳍东方鲀肝、脾、肾、脑、心、肠、肌肉、性腺和皮肤中4个与低温相关基因的表达量进行检测，结果显示，4个基因在不同温度条件下、不同组织中均有不同程度的表达，其中，皮肤和肌肉普遍呈现高表达，且在低温胁迫下存在显著性变化，这说明皮肤和肌肉作为外界环境的密切接触者，在应对温度变化方面发挥重要的作用。另外，从不同温度下4个基因的表达变化规律来看，8℃可能是红鳍东方鲀应对低温胁迫的关键调控点，过低的温度会造成其调控紊乱，此结果可为研究红鳍东方鲀低温应答调控机制提供相关依据。