凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)俗称南美白对虾，原产于太平洋西岸水域秘鲁北部至墨西哥桑诺拉一带，是当今世界上养殖产量最高的对虾种类，也是我国主要养殖的对虾种类(陈昌生等, 2001)。水温是影响对虾生长、发育及代谢强度的重要环境因子之一。对虾为变温动物，其体温随着环境温度的变化而变化，而环境温度的不同会影响机体的新陈代谢和生理调节机制(景福涛等, 2006)。凡纳滨对虾幼体的最适生长温度为30~33℃(陈昌生等, 2001; 欧黄思, 2015)，虾苗生长的最适温度为28~32℃(杨锋等, 2001)，成虾的适宜温度为23~33℃(景福涛等, 2006)。长期生活在低温或高温环境中的凡纳滨对虾始终处于胁迫状态，导致其免疫适应不良(李强等, 2008)。高温易造成对虾的免疫力和生产性能下降，导致对虾患病及死亡率明显增加(胡利杰等, 2020)。在夏季高温期，对虾病毒病发病严重，该现象主要与环境温度相关(Cheng et al, 2000; 丁志起等, 2005)。但目前对凡纳滨对虾温度胁迫的调控关键基因尚无确切的研究结果。

DNA损伤诱导因子-4 (DNA damage inducible transcript-4 like, ddit4l)，也称为REDD2或RTP801L，是首次发现于白血病细胞系THP-1的一种应激诱导蛋白，主要存在于细胞浆、肌动蛋白微丝与核浆中(张少校等, 2017)。ddit4l受到DNA损伤、缺氧、缺血、氧化应激等刺激时，通过影响DNA损伤修复因子、缺氧诱导因子等信号通路来参与调节细胞生存、增殖与凋亡(Shoshani et al, 2002; Cuaz-Pérolin et al, 2004; Miyazaki et al, 2009; Simonson et al, 2017)。细胞自噬是细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，在维持蛋白代谢平衡与细胞内环境稳定、促进细胞的生长发育等方面发挥重要作用(李国东等, 2009; 马骊等, 2018)。饥饿、活性氧自由基(ROS)的氧化应激、生长因子缺乏、蛋白质折叠错误或聚集以及DNA损伤等刺激均会诱导细胞发生自噬(焦寒伟等, 2019)。自噬的一个重要调节因子是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，对生长因子、氧浓度、压力等刺激做出反应，以控制细胞的代谢和生长。ddit4l被证明是mTOR的上游抑制剂(Corradetti et al, 2005)，能够通过抑制mTOR介导的蛋白质来降低细胞增殖和分化(Polman et al, 2012)。目前，关于ddit4l基因在甲壳动物免疫防御方面的研究较少，在对虾中的研究更为缺乏。本研究对在不同温度胁迫下凡纳滨对虾ddit4l (Lv-ddit4l)的应激表达特性进行分析，可为进一步探究凡纳滨对虾高温胁迫应答机制提供参考。

实验动物选取于2020年构建的同一个凡纳滨对虾家系，平均体长为(10.0±0.5) cm，平均体重为(6.5± 0.5) g。实验地点为中国水产科学研究院黄海水产研究所遗传育种中心。在规格为130 cm×80 cm×60 cm的水箱中暂养5 d，水温为26℃，保持连续充气；每日投喂3次饲料，日换水量1/2。

高温胁迫实验分为温度渐变实验和温度骤变实验，均设置3个平行实验，整个实验过程无对虾死亡。

温度渐变实验组：暂养结束后，采用静水法，在130 cm×80 cm×60 cm的水箱中，自动恒温加热器调整水温。在26℃(对照)恒温之后，以每12 h升高2℃的速度从26℃升至38℃，38℃维持12 h后，再以每12 h降低2℃的速度回温至26℃。取样时间点见图 1。

图 1(Fig. 1)

图 1 温度渐变取样时间点示意图 Fig.1 Schematic diagram of sample collection under gradual change of temperature

温度骤变实验组：凡纳滨对虾在56 cm× 44 cm× 36 cm水箱中养殖。在26℃(对照)恒温之后，将凡纳滨对虾直接从26℃海水中移至36℃海水中养殖24 h，再将凡纳滨对虾直接从36℃海水中移至26℃海水中养殖48 h。分别在3个时间点取样，设置骤变早期和晚期，取样时间点见图 2。

图 1(Fig. 1)

图 2 温度骤变取样时间点示意图 Fig.2 Schematic diagram of sample collection under acute change of temperature

每个时间点分别从实验组3个平行实验中随机抽取2尾，共计6尾凡纳滨对虾。每尾凡纳滨对虾取眼柄、鳃、肝胰腺、神经和肌肉5种组织，神经取腹神经索部分，共计48尾虾的240份组织保存于RNAstore reagent (TIANGEN)中，用于后续的RNA提取和基因表达定量实验。

使用RNA-easy^TM isolation reagent (Vazyme)提取眼柄、肝胰腺、鳃和肌肉组织的总RNA，使用RNAprep pure micro kit (TIANGEN)提取凡纳滨对虾神经的总RNA。使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量及完整性。使用NanoDrop 2000 UV/Vis分光光度计(Thermo Fisher Scientific)在260 nm和280 nm下定量总RNA。使用试剂盒ReverTra Ace^® qPCR RT master mix with gDNA remover (TOYOBO)反转录获得cDNA。

基于高温胁迫实验样品转录组测序获得的ddit4l基因的参考序列，使用Primer Premier 5.0软件设计cDNA序列扩增和基因表达定量所用引物，引物信息见表 1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表 1(Tab.1)

表 1 引物名称及序列 Tab.1 The name and sequence of the primers 引物Primer 序列Sequence (5´~3´) 用途Purpose ddit4l-F GCTTCTCGCCGTGCAATTGTAGTGT 序列扩增Sequence amplification ddit4l-R TGAAAACGGTCCGAACTATGCTC 序列扩增Sequence amplification qddit4l-F TGCTGTCACCATCTTCATCACC ddit4l表达定量ddit4l expression quantitation qddit4l-R TTCTTCCTCCACTCGCCCAC ddit4l表达定量ddit4l expression quantitation 18S-F TATACGCTAGTGGAGCTGGAA 内参表达定量Internal reference expression quantitation 18S-R GGGGAGGTAGTGACGAAAAAT 内参表达定量Internal reference expression quantitation

表 1 引物名称及序列 Tab.1 The name and sequence of the primers

以反转录获得的cDNA为模板，利用上游引物ddit4l-F和下游引物ddit4l-R通过PCR扩增cDNA序列。PCR反应程序：94℃预变性2 min；98℃变性30 s，61℃退火30 s，68℃延伸1 min，35个循环；68℃ 5 min。反应后进行琼脂糖凝胶电泳确定扩增产物特异性和片段大小。PCR产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行Sanger测序。将测序结果与转录组中序列进行对比，验证Lv-ddit4l的cDNA序列。

使用EditSeq软件分析该基因开放阅读框(ORF)及推导其氨基酸序列。使用ExPASy-ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/)软件预测蛋白质分子质量、理论等电点、不稳定系数等。使用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)软件分析蛋白质的跨膜区。使用SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)软件进行信号肽预测。使用NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)软件进行糖基化位点分析。使用NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)软件进行磷酸化位点分析。使用InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)软件进行蛋白质功能结构域预测分析。使用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)软件进行二级结构预测。基于BLAST搜索结果，对ddit4l在氨基酸水平上进行同源比较和进化树分析，使用DNAMAN 6.0软件进行同源多序列比对，使用MEGA 7.0软件通过邻接法(neighbour-joining method, NJ)进行Lv-ddit4l基因进化树构建。

以凡纳滨对虾5种组织的cDNA为模板，使用SYBR Green Real time PCR Master Mix(TOYOBO)，使用Applied Biosystems^TM 7500 Real Time PCR instrument定量仪，采用2^–ΔΔCt计算方法进行荧光定量RT-PCR (qRT-PCR)，分析ddit4l在不同温度时5种组织中的表达水平。反应体系为25 µL：12.5 µL SYBR Real time PCR Master Mix，2.5 µL样品溶液，8 µL蒸馏水，1 µL上游引物和1 µL下游引物。每个样品实验设置3个平行重复以及内参对照。反应条件：95℃ 60 s；95℃15 s，60℃ 15 s，72℃ 45 s，共40个循环。

使用IBM SPSS Statistics 26软件对计算结果进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，P < 0.05表示差异显著，并通过prism将统计结果整理成柱状图。

Lv-ddit4l基因扩增产物凝胶电泳结果如图 3所示，产物单一，且长度在750 bp左右，符合序列扩增引物设计的预计产物大小。

图 1(Fig. 1)

图 3 Lv-ddit4l基因扩增产物凝胶电泳结果 Fig.3 Gel electrophoresis of Lv-ddit4l gene amplification products

Lv-ddit4l序列包含1个495 bp的ORF，编码164个氨基酸，预测其带负电荷的氨基酸残基为24个(Asp+Glu)，带正电荷的氨基酸残基为18个(Arg+ Lys)，分子量为18.51 kDa，理论等电点为5.35，不稳定性系数为65.83，归类为不稳定性蛋白，脂肪族指数为96.28，亲水性总平均值为–0.307，无跨膜蛋白和信号肽结构，预测无糖基化位点，磷酸化位点分析预测有8个Ser、4个Thr和1个Tyr，在62~160氨基酸位置处包含1个RTP801C超基因家族功能结构域，且该结构域在物种间相当保守(图 4、图 5)。预测的二级结构中，α-螺旋(62个氨基酸)占37.80%，β-折叠(33个氨基酸)占20.12%，β-转角(7个氨基酸)占4.27%，无规卷曲(62个氨基酸)占37.80%，说明Lv-ddit4l基因编码的蛋白以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主，含少量的β-折叠，间或有β-转角。Lv-ddit4l蛋白质的三维结构如下(图 6)。

图 1(Fig. 1)

图 4 Lv-ddit4l基因cDNA序列和对应的氨基酸序列 Fig.4 cDNA and amino acid sequence of Lv-ddit4l 启动子和终止子用红色字体表示，“ ”表示磷酸化位点，“–”表示结构域 The start and stop codons are indicated in red, " " for phosphorylation site, "–" for domain

图 1(Fig. 1)

图 5 Lv-ddit4l基因的功能结构域 Fig.5 Functional domain of Lv-ddit4l

图 1(Fig. 1)

图 6 Lv-ddit4l蛋白质的三维结构 Fig.6 Three-dimensional structure of the Lv-ddit4l protein

利用NCBI BLASTP对Lv-ddit4l基因编码的氨基酸序列进行同源序列比对(图 7)，发现Lv-ddit4l与北太平洋雪蟹(Chionoecetes opilio)的同源性较高，为59.76%，与其他物种同源性为：人(Homo sapiens) (23.20%)、家鼠(Mus musculus) (23.59%)、牛(Bos taurus) (23.71%)、黑猩猩(Pan troglodytes) (23.20%)、野猪(Sus scrofa) (21.65%)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis) (20.11%)、斑点叉尾(Ictalurus punctatus) (25.13%)、斑马鱼(Danio rerio) (17.96%)、尖吻鲈(Lates calcarifer) (24.74%)、眼斑鳗狼鱼(Anarrhichthys ocellatus) (24.23%)、海龟(Chelonia mydas) (21.88%)、鸸鹋(Dromaius novaehollandiae)(19.44%)、鲸鲨(Rhincodon typus) (21.35%)、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum) (29.65%)、佛州文昌鱼(Branchiostoma floridae) (20.48%)、大型蚤(Daphnia magna) (27.33%)、紫色海胆(Strongylocentrotus purpuratus) (19.13%)、日本刺参(Apostichopus japonicus) (22.22%)、马蹄蟹(Limulus polyphemus) (23.39%)、美国龙虾(Homarus americanus) (34.12%)。

图 1(Fig. 1)

图 7 Lv-ddit4l氨基酸序列比对 Fig.7 The alignment of Lv-ddit4l amino acid sequence ddit4l序列GenBank登录号：人(NP_660287.1)、家鼠(NP_084419.2)、北太平洋雪蟹(KAG0695771.1)、牛(NP_001074988.1)、黑猩猩(XP_001168002.1)、野猪(XP_013834460.1)、热带爪蟾(XP_004911505.2)、斑点叉尾(XP_017326609.1)、斑马鱼(NP_001245246.1)、尖吻鲈(XP_018546478.1)、眼斑鳗狼鱼(XP_031707148.1)、海龟(XP_027681253.1)、鸸鹋(XP_025965069.1)、鲸鲨(XP_020378872.1)、豌豆蚜(NP_001155726.1)、佛州文昌鱼(XP_035668797.1)、大型蚤(JAL45518.1)、紫色海胆(XP_787042.1)、日本刺参(PIK42874.1)、马蹄蟹(XP_022254613.1)、美国龙虾(XP_042214560.1)。 The GenBank accession numbers of ddit4l amino acid sequences are as follows: Homo sapiens (NP_660287.1), Mus musculus (NP_084419.2), Chionoecetes opilio (KAG0695771.1), Bos taurus (NP_001074988.1), Pan troglodytes (XP_001168002.1), Sus scrofa (XP_013834460.1), Xenopus tropicalis (XP_004911505.2), Ictalurus punctatus (XP_017326609.1), Danio rerio (NP_001245246.1), Lates calcarifer (XP_018546478.1), Anarrhichthys ocellatus (XP_031707148.1), Chelonia mydas (XP_027681253.1), Dromaius novaehollandiae (XP_025965069.1), Rhincodon typus (XP_020378872.1), Acyrthosiphon pisum (NP_001155726.1), Branchiostoma floridae (XP_035668797.1), Daphnia magna (JAL45518.1), Strongylocentrotus purpuratus (XP_787042.1), Apostichopus japonicas (PIK42874.1), Limulus polyphemus (XP_022254613.1), Homarus americanus (XP_042214560.1).

对ddit4l编码的蛋白序列进行系统进化树分析，结果如图 8所示，凡纳滨对虾先与北太平洋雪蟹紧密聚为一支，再与美国龙虾相聚，它们的亲缘关系最近，形成一个独立的分支。接着与日本刺参、紫色海胆、佛州文昌鱼、马蹄蟹、大型蚤、豌豆蚜聚为一支。

图 1(Fig. 1)

图 8 ddit4l系统进化发育树分析 Fig.8 The analysis of phylogenetic tree for ddit4l

qRT-PCR分析表明，在26℃水温环境中，Lv-ddit4l在凡纳滨对虾5种组织中均有表达，且表达量基本相同，没有显著差异(P > 0.05) (图 9)。

图 1(Fig. 1)

图 9 26℃时凡纳滨对虾Lv-ddit4l在5种组织中的表达 Fig.9 Expression of Lv-ddit4l in five tissues of L. vannamei at 26℃ 标有不同字母的值之间差异显著(P < 0.05)。下同。 Values with different letters are significantly different (P < 0.05). The same as below.

在温度渐变实验中，Lv-ddit4l基因在凡纳滨对虾5种组织中的相对表达量如图 10所示。眼柄中的Lv-ddit4l表达量在水温升至32℃时(B-32℃)显著上调(P < 0.05)，是对照组(A-26℃)表达量的10.37倍。与对照组(A-26℃)相比，鳃、肝胰腺中Lv-ddit4l的表达量回温至32℃时显著上调(P < 0.05)，表达量分别是对照组(A-26℃)的3.37倍和2.03倍。回温至26℃时(E-26℃)，眼柄、鳃、肝胰腺、神经和肌肉中的Lv-ddit4l表达量与对照组(A-26℃)无显著差异(P > 0.05)。在神经和肌肉中，不同温度胁迫下的Lv-ddit4l表达量没有显著变化(P > 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 10 温度渐变下Lv-ddit4l在5种组织中的表达 Fig.10 Expression of Lv-ddit4l in five tissues under gradual change of temperature

在温度骤变实验中，Lv-ddit4l在凡纳滨对虾5种组织中的相对表达量见图 11。与对照组(A-26℃)相比，鳃、肝胰腺、神经中的Lv-ddit4l表达量在水温骤变至36℃后10 min时(F-36℃)显著上调(P < 0.05)；其中，肝胰腺的表达量变化显著，为对照组的24.06倍，鳃、神经中的表达量分别为对照组(A-26℃)表达量的1.22倍和3.67倍。肌肉中的Lv-ddit4l表达量在水温维持在36℃ 24 h (G-36℃)时显著上调(P < 0.05)，是对照组(A-26℃)的2.71倍。回温至26℃时(H-26℃)，鳃、肝胰腺、神经和肌肉中的Lv-ddit4l表达量与对照组无显著差异(P > 0.05)。

图 1(Fig. 1)

图 11 温度骤变下Lv-ddit4l在5种组织中的表达 Fig.11 Distribution of Lv-ddit4l in five tissues under acute change of temperature

目前，已知ddit4l在维持单核细胞氧化还原状态以及在骨骼肌代谢方面发挥作用(Cuaz-Pérolin et al, 2004; Pisani et al, 2005; Imen et al, 2009; Suzuki et al, 2011)。ddit4l表达具有很强的特异性，通常见于纤维细胞、肌细胞以及巨噬细胞，在医学上的大多数恶性肿瘤组织中低表达甚至不表达(Cuaz-Pérolin et al, 2004; Simonson et al, 2017)；ddit4l mRNA在成人的骨骼肌中特异性高表达，遇到压力应激时可以抑制mTOR的活性(Drummond et al, 2008)；大鼠(Rattus norregicus) ddit4l mRNA也在骨骼肌、心脏和精巢中特异性表达(Pisani et al, 2005)；小鼠(Mus musculus) ddit4l基因在肌肉组织中特异性表达(Miyazaki et al, 2009)；在斑马鱼成鱼中，ddit4l基因在脑、眼睛、心脏、肝脏、肾脏、卵巢、鳃、肠道、肌肉、脾脏和精巢中均有表达，但在肝脏、肾脏和卵巢中的表达量较高(冯强, 2012)。对斑马鱼胚胎进行热激处理，ddit4l的表达量显著上调；对斑马鱼稚鱼和成鱼进行饥饿处理，ddit4l的表达量显著上调(冯强, 2012)。Cuaz-Pérolin等(2004)筛选出ddit4l基因，发现ddit4l是一种低氧反应基因，在化学缺氧的条件下，ddit4l基因的表达量呈剂量依赖性上调。Pisani等(2005)研究证明，ddit4l在大鼠肌肉无氧代谢中表达量也显著上调，它还与导致细胞死亡的应激反应有关(Cuaz-Pérolin et al, 2004; Imen et al, 2009)。

本研究采用qRT-PCR技术检测了Lv-ddit4l在温度渐变和温度骤变胁迫时5种组织表达水平变化。结果表明，该基因在所有检测的组织中都有表达，且5种组织总体的表达水平比较一致。与ddit4l在斑马鱼和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)不同组织中普遍表达的特点(冯强, 2012; 阎德平等, 2021)相一致。与26℃水温相比，在水温缓慢升至32℃的凡纳滨对虾眼柄中Lv-ddit4l的表达量显著上调(P < 0.05)，是对照组表达量的10.37倍，推测凡纳滨对虾眼柄中该基因对温度变化较先做出响应。在水温升至38℃时，眼柄、鳃、肝胰腺、神经和肌肉中Lv-ddit4l的表达量均无显著变化，推测该基因可能在热应激的前期发挥作用。在水温从38℃缓慢回至32℃时，凡纳滨对虾鳃、肝胰腺中的Lv-ddit4l表达量显著上调(P < 0.05)，分别是对照组的3.37倍和2.03倍。在32~38℃范围内的整个温度渐变的过程中，Lv-ddit4l在眼柄、鳃和肝胰腺中表达量均显著上调，说明该基因可能在凡纳滨对虾的温度渐变胁迫中发挥作用。在环境水温从26℃骤变至36℃后10 min时，凡纳滨对虾鳃、肝胰腺和神经中的Lv-ddit4l表达量显著上调(P < 0.05)，其中，肝胰腺中的表达量为对照组的24.06倍，鳃和神经中的表达量分别为对照组的1.22倍和3.67倍。肝胰腺是凡纳滨对虾重要的免疫器官(张月等, 2017)，推测在应对温度骤变中，肝胰腺中的ddit4l基因可能发挥重要的功能。在环境水温从26℃骤变至36℃后24 h时，凡纳滨对虾肌肉中Lv-ddit4l表达量显著上调(P < 0.05)，是对照组的2.71倍。在36℃范围内的整个温度骤变过程中，Lv-ddit4l在鳃、肝胰腺、神经和肌肉中表达量均显著上调，说明该基因可能在凡纳滨对虾的高温骤变胁迫中发挥作用。当环境温度分别从38℃、36℃恢复至26℃，凡纳滨对虾体内上调表达的Lv-ddit4l表达量呈下调趋势。Lv-ddit4l在凡纳滨对虾遭遇热胁迫时表达量上调，与ddit4l基因在斑马鱼胚胎遭受热激时表达量上调的结果一致(冯强, 2012)。同时，凡纳滨对虾的神经和肌肉在温度渐变过程中以及眼柄在温度骤变过程表达量变化差异不显著也说明ddit4l基因的表达具有很强的特异性，与前人的研究结果(Pisani et al, 2005; Miyazaki et al, 2009; 冯强, 2012; Simonson et al, 2017)一致。相对于温度渐变，温度骤变下凡纳滨对虾的Lv-ddit4l表达量上调表达更为明显，说明温度骤变对该基因的影响更大，Lv-ddit4l应对高温胁迫中的具体功能值得深入研究。

研究表明，温度与凡纳滨对虾的氧代谢密切相关(Zhou et al, 2010)，温度升高会导致溶解氧浓度下降，缺氧严重影响对虾的代谢过程(朱孟凯等, 2015)。动物体有一定的氧和热耐受极限，一旦温度超过这个极限，动物体就可能从有氧代谢转变为无氧代谢(Anestis et al, 2008)，影响机体的多种生理活动(Yao et al, 2014)。研究表明，ddit4l基因在体内缺氧时表达量上调，促进细胞自噬(Simonson et al, 2017)，能够参与大鼠肌肉的无氧代谢(Pisani et al, 2005)。本研究发现，Lv-ddit4l在高温渐变及高温骤变中均出现差异表达，即该基因能够参与高温胁迫的应激应答。在遭受高温胁迫时，Lv-ddit4l能快速响应以适应外界环境。推测其可能促进细胞自噬来应对外界刺激。但目前Lv-ddit4l发挥作用的具体机制尚不明确，有待进一步深入研究。